Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Denne forskningen brukte ressurser på Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, biologi og kjemi laboratorier), et DOE Office of the Science User Facility som drives av Oak Ridge National Laboratory. Denne forskningen brukte også ressurser ved MLZ-FRM2-reaktoren Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) og JCNS1 ved Forschungszentrum Jülich GmbH, Tyskland. Forfatteren anerkjenner Dr. Ralf Biehl og Dr. Andreas Stadler for deres hjelp med modellering og deres bidrag til både IgG og MBP proteiner forskning, Dr. Piotr A. Żołnierczuk for NSE data reduksjon støtte, Dr. Changwoo Do for støtte med SANS målinger, og Rhonda Moody og Dr. Kevin Weiss for SNS biokjemi lab støtte.

Det nåværende arbeidet karakteriserer to proteiner: et vanlig humant antistoffprotein IgG, og det indre uordnede MBP. Den lyofiliserte formen av proteinene ble oppnådd fra kommersielle kilder (se Materialtabell).
1. Fremstilling av proteinprøver
<ol><li>Klargjør en 50 mM natriumfosfat + 0,1 M NaCl-buffer ved å veie og oppløse de respektive faste reagensene i tungtvann (D2O) (se materialtabell). Dette er det deutererte buffe...

NSE-spektroskopi gir en unik og detaljert oversikt over dynamikken til proteiner, som andre spektroskopiske teknikker ikke kan produsere. Målinger over en lengre tidsskala gir observasjoner av både proteinenes translasjons- og rotasjonsdiffusjon, som presentert her. Segmentdynamikken og andre interne svingninger avslører seg som et sterkt forfall av den sammenhengende spredningsfunksjonen S (Q, t) på kort tidsskala og er godt skilt fra de generelle diffusjonelle avslapningsprosessene. De viktigste begrensnin...

Sonderingsdynamikk av myk materie med nøytroner Å undersøke de dynamiske egenskapene til proteiner og peptider er en stor del av biofysisk forskning, og det finnes i dag mange velutviklede metoder for å få tilgang til et bredt spekter av energilandskap. Å relatere den eksperimentelt avslørte dynamikken til proteinene til deres biologiske funksjon er en langt vanskeligere oppgave, som krever komplekse matematiske modeller og datastøttede dynamikksimuleringer. Betydningen av nøytronspektroskopi for analyse av proteinbevegelser har blitt understreket i flere godt mottatte og anerkjente studier 1,2,3,4,5. Før du utforsker det mangfoldige energilandskapet for intern proteindynamikk, er det nødvendig med en kort oversikt over de dynamiske prosessene i myk materie og hvordan nøytroner kan få tilgang til dem.
Nøytronenes følsomhet overfor isotopisk konfigurasjon og typen interaksjoner de viser med myk materie, gjør nøytronspredning til en av de mest allsidige undersøkelsesteknikkene6. Det er et bredt spekter av korrelasjonslengdeskalaer og korrelasjonstider som nøytroner kan få tilgang til, fra kjernefysiske eksitasjoner og atomvibrasjoner til kollektive bevegelser og langsomme avslapningsprosesser som isotropiske rotasjoner og diffusive bevegelser. Når man undersøker de spredte nøytronene for deres energioverføring, kan tre hovedinteraksjoner skilles: den elastiske spredningen, der det ikke er energiutveksling mellom innkommende nøytron og partikkel i prøven; den uelastiske spredningen, med en stor, kvantifiserbar energiutveksling mellom nøytron og partikkel; og det særegne tilfellet av kvasi-elastisk spredning som betegner en svært liten energioverføring sammenlignet med den innfallende nøytronenergien 1,7. Disse interaksjonene gir presis informasjon om det undersøkte materialet og danner det teoretiske grunnlaget for et bredt spekter av nøytronspredningsteknikker.
I elastisk spredning registrerer detektoren retningene til nøytronene som et diffraksjonsmønster, som viser posisjonen til prøveatomene i forhold til hverandre. Informasjon om korrelasjonene mellom atomposisjoner er anskaffet (dvs. integrert intensitet S (Q) angående momentumoverføringen Q, som gjelder strukturell informasjon alene). Dette prinsippet danner grunnlaget for nøytrondiffraksjon8.
Kompleksitet oppstår når energioverføringen ikke lenger er null på grunn av eksitasjoner og interne svingninger i prøvematerialet. Dette danner grunnlaget for nøytronspektroskopi, der de spredte nøytronene undersøkes som en funksjon av både energioverføringen E og momentumoverføringen Q. Dynamisk og strukturell informasjon oppnås. Nøytronspektroskopi måler den samme integrerte intensiteten S (Q) for energioverføring (dvs. hastighetsendring av nøytronene på grunn av prøvespredning, S (Q, ω) = S (Q, E), som også refereres til som den dynamiske strukturfaktoren) 9.
For å beregne spredningen fra et materiale er det mer tilstrekkelig å bruke parkorrelasjonsfunksjonen 7,10. I diffraksjonstilfellet gir den statiske parkorrelasjonsfunksjonen G (r) sannsynligheten for å finne sentrum av en partikkel i en gitt avstand r fra sentrum av en annen partikkel. Spektroskopien generaliserer den statiske parkorrelasjonsfunksjonen og inkluderer energi/ frekvens / tid i spredningsligningen. Parkorrelasjonsfunksjonen G(r) blir en funksjon av tid G(r, t), som kan dekomponeres i en distinkt atomparkorrelasjonsfunksjon GD(r, t), og en selvkorrelasjonsfunksjon GS(r, t). Disse beskriver to typer korrelasjoner: parkorrelerte bevegelser av atomer som styrer den sammenhengende spredningen, og selvkorrelasjon som styrer den usammenhengendespredningen 10.
Koherent spredning er spredningen fra "gjennomsnittet" og avhenger av den relative fasen av de spredte bølgene. I det små vinkelspredningsregimet forstyrrer de spredte nøytronbølgene fra forskjellige spredningssentre (forskjellige atomer) konstruktivt (har lignende faser), og atomenes kollektive bevegelse observeres med sterk intensitetsforbedring. Koherent spredning beskriver i hovedsak spredningen av et enkelt nøytron fra alle kjernene i prøven10.
Når det ikke oppstår noen konstruktiv interferens mellom de spredte nøytronbølgene fra forskjellige sentre, følges et enkelt atom i tid, og selvkorrelasjonen mellom atomets posisjon på tid t = 0 og det samme atomet på tidspunktet t observeres. Dermed går informasjonen om atomenes relative posisjoner tapt, og fokuset er bare på lokale svingninger. Spredning fra lokale svingninger styrer usammenhengende spredning. Usammenhengende spredning er isotropisk, bidrar til bakgrunnssignalet og forringer signal-til-støy10,11.
Ved å kombinere alt det ovennevnte skiller vi fire store nøytronspredningsprosesser10: (1) elastisk koherent (måler korrelasjonene til atomposisjoner), (2) uelastisk koherent (måler kollektive bevegelser av atomer), (3) elastisk usammenhengende (bidrar til bakgrunnen, reduserer spredningsintensiteten ved Debye-Waller-faktor (DWF) og måler elastisk usammenhengende strukturfaktor (EISF), som beskriver geometrien til diffusive bevegelser i begrenset geometri, og (4) uelastisk usammenhengende (måler enkeltatomdynamikk og selvkorrelasjon).
Dynamikkprosesser som nøytroner kan få tilgang til i biologi spenner fra demping av lavfrekvente atom- og molekylære vibrasjoner, samspillet mellom løsningsmiddelmolekyler og biooverflater og diffusjonsprosesser i hydreringslaget av makromolekyler og begrenset geometri, til kortdistanse translasjonelle, rotasjons- og tumblingdiffusjonive bevegelser, og proteindomener og allosteriske bevegelser1 . Det store mangfoldet av nøytronmetoder og instrumenter for måling av proteindynamikk er basert på hvordan akromatiseringen av hendelsen eller den utgående nøytronstrålen oppnås og hvordan energianalysen av de spredte nøytronene utføres. Fra trippelakse til flytid, backscattering og spinn-ekko-spektrometre kan man utforske dynamiske prosesser med karakteristiske tider mellom 1 x 10-14 s og 1 x 10-6 s (femtosekund til mikrosekunder)12.
Oak Ridge National Laboratory, med sine to anerkjente nøytronkilder, Spallation Neutron Source - SNS13 og High Isotope Flux Reactor - HFIR14, har en av de beste suitene med spektrometre for å undersøke dynamikk i biomaterialer. Noen av de mest veltalende eksemplene inkluderer bruken av det kalde nøytronhakkerspektrometeret (CNCS) ved SNS15 for å undersøke dynamisk forstyrrelse av hydreringsvann rundt grønt fluorescerende protein i løsning16 eller subpikosekund kollektive vibrasjoner av flere proteiner17. Et tilbakevendende problem med uelastiske nøytronspredningsundersøkelser er at noen biologiske prosesser er for sakte til å bli observert. Uten ekstreme oppsett som fører til et stort tap av nøytronintensitet, er flytidsspektrometre begrenset til 10 μeV energioppløsning, tilsvarende en maksimal tidsskala på ~ 200 ps10,11. Dette er ikke tilstrekkelig til å observere store bevegelser i proteiner. Derfor er det ofte behov for instrumenter med høyere energioppløsning som backscattering-spektrometrene. Å kombinere time-of-flight og backscattering-teknikkene har vist seg å være kraftig for å undersøke endringen i den interne dynamikken til Cytochrome P450cam (CYP101), et enzym som katalyserer hydroksylerings kamfer18.
Mikroskopisk diffusivitet målt ved backscattering-spektrometeret ved SNS-BASIS19 var overraskende godt definert og kunne skilles i diffusiviteten til vann (hydrering, cytoplasmatisk og bulklignende vann) og diffusiviteten til cellebestanddeler i planariske flatorm, det første levende dyret som ble studert ved nøytronspredning20 . Backscattering er en høyoppløselig spektroskopisk teknikk, men den er også begrenset til flere μeV = flere nanosekunder, mens den langsomme dynamikken i biomaterialer også manifesterer seg som overlevelsestiden for korrelasjon mellom atomposisjon eller spinnorientering (f.eks. Avslapningsprosesser, som regelmessig skjer i tidsområdet ti til hundrevis av nanosekunder).
Nøytron spinn ekko spektroskopi (NSE) er den eneste nøytronspredningsteknikken som når så høy oppløsning. I motsetning til andre nøytronteknikker krever NSE ikke akromatisering av strålen siden den bruker den kvantemekaniske fasen til nøytronene, som er deres magnetiske øyeblikk. Manipuleringen av magnetiske øyeblikk tillater bruk av en bred nøytronstrålebølgelengdefordeling, mens teknikken er følsom for svært små nøytronhastighetsendringer i størrelsesorden 1 x 10-4. NSE har med hell blitt brukt til å undersøke den langsomme dynamikken til proteiner i løsning for mange proteiner. Blant disse mange pionerstudiene anerkjenner vi studiet av segmentfleksibiliteten til grisimmunoglobulin21; de koblede domenebevegelsene i Taq-polymerase22; domenebevegelsene i tetrameren av gjæralkohol dehydrogenase23; endringen av konformasjon i fosfoglyseratkinase ved substratbinding3; aktivering av domenebevegelser og dynamisk forplantning av allosteriske signaler i Na+/H+ utvekslingsregulatorisk kofaktor 1 (NHERF1) protein 4,24,25; dynamikken i en kompakt tilstand av kvikksølvionreduktase26; og diffusjonen av hemoglobin i røde blodlegemer27. To nyere studier i proteindynamikk har eksponert fleksibiliteten til humant antistoff Immunoglobulin G (IgG) som en entropisk fjær28 og egenskapene til løsemiddelbidrag til dynamikken til indre uordnet myelin basisk protein (MBP)5.
Denne artikkelen forklarer de grunnleggende prinsippene for NSE, de mange forberedende metodene som anbefales for en grundig proteindynamikkundersøkelse, samt metodikken og den eksperimentelle protokollen for NSE-datainnsamling ved NSE-spektrometeret ved SNS, SNS-NSE. Protokollen karakteriserer to proteiner: IgG, et vanlig humant antistoffprotein, og det indre uordnede proteinet MBP. De biofysiske implikasjonene, forskningsrelevansen til eksemplene og begrensningene i teknikken diskuteres kort.
NSE-spektroskopi, metoden for langsomme dynamikkmålinger NSE er en polarisert teknikk som bruker nøytrontid for å måle utveksling av energi (tap av polarisasjon) på grunn av den kvasi-elastiske interaksjonen mellom nøytroner og atomer i en prøve. Kjernen i NSE-spektroskopi ligger to grunnleggende prinsipper: (1) nøytronspinnets evne til å presesere i magnetfeltet med en frekvens proporsjonal med magnetisk styrke <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">, nemlig Larmor-frekvensen29, og (b) spinn-ekkoet eller Hann-ekkoet, som representerer manipulering og refokusering av polarisasjonssignalet ved bruk av en serie radiofrekvenspulser30.
Det grunnleggende i NSE-prosessen kan oppsummeres i noen få enkle trinn 6,11 ved hjelp av figur 1. (1) Nøytronstrålen produsert av kilden (posisjon 1) polariseres (posisjon 2), styres og transporteres (posisjon 3), og kommer til inngangen til NSE-spektrometeret, hvor den roteres med 90 ° av den første pi-halvflipperen (posisjon 4). (2) Den polariserte strålen (f.eks. nøytronmagnetiske øyeblikk) blir vinkelrett på den første magnetens magnetfeltlinjer (første presesjonssone, posisjon 5) og begynner å presesere. (3) På slutten av magneten akkumulerer nøytronspinn en viss presesjonsvinkel proporsjonal med magnetfeltstyrken og flytiden som brukes inne (i utgangspunktet omvendt proporsjonal med nøytronhastigheten). De individuelle nøytronhastighetene er kodet innenfor presesjonsvinkelen på slutten av den første presesjonssonen. (4) Nær prøveposisjonen reverserer pi-flipperen (posisjon 6) retningen til spinnet med 180 °, og endrer tegnet på presesjonsvinkelen. (5) Nøytronene interagerer med prøvens molekyler (posisjon 7) og blir spredt. (6) De spredte nøytronene kommer inn og preseserer i den andre presesjonssonen (posisjon 8), men blir reversert orientert. (7) En annen pi-halv flipper (posisjon 9) brukes til å rotere orienteringen av spinnet fra vinkelrett til horisontal retning. Dette vil stoppe presesjonen, oversette presesjonsvinkelen φ til polarisasjon proporsjonal med cos (φ). (8) Analysatoren (posisjon 10) velger nøytronene basert på en orientering. Hvis interaksjonen med prøven er elastisk, vil nøytronets hastighet ikke endres. Nøytronene vil bruke like mye tid på å fly i første og andre presesjonssone, og de akkumulerte presesjonsvinklene blir fullstendig gjenvunnet. Den fulle polarisasjonen gjenopprettes på detektoren (posisjon 11) som et ekko av den opprinnelige polarisasjonen (dvs. spinn-ekko). (9) I NSE er imidlertid spredningen kvasi-elastisk, så en liten energiutveksling mellom nøytroner og prøvemolekyler fører til forskjellige nøytronhastigheter etter spredning av prøven. På grunn av de forskjellige hastighetene vil nøytronene bruke ekstra tid på å fly gjennom den andre presesjonssonen og vil ikke ha gjenopprettet presesjonsvinkelen på riktig måte. En partiell polarisasjon hentes på detektoren, og tapet av polarisasjon på grunn av spinnavslapping er proporsjonalt med cos-Fourier-transformasjonen av spektralfunksjonen S(Q, ω), den mellomliggende spredningsfunksjonen F(Q, t). (10) Tidsparameteren for funksjonen F(Q, t) er proporsjonal med presesjonens magnetfeltstyrke. Skanning av tap av polarisasjon som en funksjon av magnetfeltstyrke gir derfor en avslapningsfunksjon som avhenger av de dynamiske prosessene i prøven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figur 1: Fotografi av NSE-spektrometeret ved SNS (SNS-NSE) og nøytronfluebane skjematisk med de viktigste funksjonelle komponentene. Fra høyre til venstre: 1 = nøytronkilde; 2 = choppers-bender-polarizer-sekundær lukkersystem; 3 = stråletransport guider; 4 = pi/2 flipper for første 90° spinn-sving; 5 = første presesjonssone; 6 = pi flipper for 180 ° spin-turn; 7 = prøveområde og prøvemiljø (her vises kryoovnen); 8 = andre presesjonssone; 9 = pi/2 flipper for andre 90° spinn-sving; 10 = analysator; 11 = detektor. (Merk at deler av 3, samt 2 og 1, ligger bak den blå veggen inne i skjermingen; helikoptrene erstattes av en hastighetsvelger for reaktorbasert NSE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

De fleste menneskekroppsproteiners aktivitet og funksjonalitet er relatert til konfigurasjonsendringer av hele underdomener i proteinkrystallstrukturen. Krystallstrukturene bygger grunnlaget for enhver beregning som beskriver strukturen eller dynamikken til et protein, mesteparten av tiden med sterke geometriske begrensninger. Disse begrensningene fra krystallstrukturen er imidlertid ikke til stede i løsningen. Strukturen av proteinene i løsningen kan avvike fra krystallet på grunn av omorganiseringer av løkker eller underdomener på pico til nanosekund tidsskala (dvs. det interne proteindynamikktidsregimet). Det nåværende arbeidet beskriver hvordan sakte bevegelser på tidsskalaer på flere titalls nanosekunder kan nås ved hjelp av nøytronspredning. Spesielt er den dynamiske karakteriseringen av to store humane proteiner, et iboende uordnet protein som mangler en veldefinert sekundær struktur og et klassisk antistoffprotein, adressert ved nøytronspinnekkospektroskopi (NSE) kombinert med et bredt spekter av laboratoriekarakteriseringsmetoder. Ytterligere innsikt i proteindomenedynamikk ble oppnådd ved hjelp av matematisk modellering for å beskrive eksperimentelle nøytrondata og bestemme krysningen mellom kombinert diffusive og interne proteinbevegelser. Ekstraksjonen av det interne dynamiske bidraget til den mellomliggende spredningsfunksjonen oppnådd fra NSE, inkludert tidsskalaen for de forskjellige bevegelsene, tillater ytterligere syn på de mekaniske egenskapene til enkeltproteiner og mykheten til proteiner i deres nesten naturlige miljø i den overfylte proteinløsningen.

IgG-protein fra humant serum og MBP-proteiner fra storfe ble rekonstituert ved høye konsentrasjoner (~50 mg/ml) i D2O-basebuffere. Siden proteinene ble oppløst i høye konsentrasjoner, var de oppnådde løsningene overfylte proteinløsninger. Dynamikken som undersøkes ved bruk av NSE lider av det overfylte miljøet som proteinene befinner seg i (strukturfaktorinteraksjoner og hydrodynamiske effekter)5,28,39. DLS bl...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Denne protokollen beskriver metoder for å undersøke strukturen og dynamikken til to modellproteiner som har en viktig rolle i menneskers helse. Teknikken kombinerer benk-topp biofysisk karakterisering med nøytronspinn ekkospektroskopi for å få tilgang til dynamikken på tids- og lengdeskalaer som er relevante for proteininterdomainbevegelser.

Studie av proteindynamikk via nøytron spin ekko spektroskopi

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Følgende protokoll presenterer hvordan du setter opp et Neutron Spin Echo-eksperiment for å måle den mellomliggende spredningsfunksjonen og undersøke dynamikken til proteiner i løsning. Den største fordelen med Neutron Spin Echo Spectroscopy er dens evne til å se på omorganisering av proteindomener og underdomener på pico til nanosekund tidsskala, som er rekkevidden av sakte bevegelser i proteiner i deres nesten naturlige miljø, og i den overfylte proteinløsningen. Neutron Spin Echo er også følsom for isotopisk konfigurasjon, noe som tillater svært spesifikke og målrettede studier ved hjelp av kontrastmatching.Innsikt i proteindomenedynamikk er en stor del av biofysisk forskning i den pågående vanskelige oppgaven med å videresende proteinenes domenebevegelser med sin biologiske funksjonalitet. Protokollen som presenteres her kan generelt brukes på enhver Neutron Spin Echo-måling utført ved SNS-NSE-spektrometeret, uavhengig av valg av prøver, hvis man holder seg innenfor riket av myke materialer. For å sette opp eksperimentet begynner du med å velge tykkelsen på celleprøven, basert på konsentrasjonen av proteinprøven, temperaturen som trengs for måling, og mengden løsning som er tilgjengelig.Rengjør cellen med fosfatfritt oppvaskmiddel, avionisert vann og 70% dietanol. Tørk cellen i konveksjonsovnen. Last fire milliliter proteinoppløsning inn i cellen, og lukk med caps.Bruk voksfilm eller et hvilket som helst tetningsmiddel for å forsegle prøvecellene. Last fire milliliter dialysebuffer i en identisk beholder som proteinprøven og forseglingen. Transportprøver til strålelinjen.Lukk lukkeren, og gå inn i spektrometerkapslingshulen. Monter prøvecellen på aluminiumsprøveholderen ved å stramme skruene og holdeplatene. Monter grafittprøven og aluminiumoksidpulverprøven lastet i en identisk beholder som proteinprøven.Plasser den samme holderen ved å skyve den forsiktig inn i boksen til temperaturpådrivsystemet. Lukk lokket på temperaturpådrivsystemet, og sett temperaturen til ønsket verdi ved å gå til den interaktive skjermen til temperaturpådrivsystemet. Monter nøytronkameraet for justering av prøvene til strålen.For å samle inn Neutron Spin Echo Spectroscopy-dataene, juster prøven i nøytronstrålen ved hjelp av nøytronkameraet og de fire uavhengige prøveåpningene. Åpne Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy datainnsamlingsprogramvare, og samle prøvestatistikk ved å kjøre defraksjonsskanninger for de ønskede spredningsvinklene og bølgelengden. Definer måleparameterne basert på statistikken som samles inn for hvert utvalg, ved å redigere målemakroene fra forskerinstrumentet.Begynn å skanne ved å skrive inn protokollnavnet ved ledeteksten og hente ekko for prøven. Logg på Neutron Sciences Remote Analysis-klyngen med ORNL-brukerlegitimasjonen og trykk på startøktknappen. I brukerkatalogen åpner du et terminalvindu og skriver inn kommandoen for programvareoppsett.Deretter skriver du inn miljøkommandoen. Opprett en mappe for datareduksjon i hjemmekatalogen, og kopier de angitte skriptene og makroene fra den delte katalogen. Rediger, gi nytt navn til og lagre reduksjonsmakroen som er angitt tilsvarende.Skriv drspine"ved ledeteksten og trykk Enter for å starte programvarereduksjonsmiljøet. Skriv inn navnet på reduksjonsmakroen i ledeteksten i programvaremiljøet, og trykk Enter. Rediger Python-skriptet fra Assisting Instrument Scientist med navnene på de reduserte fildataene.Rediger funksjonen slik at den passer fra biblioteket som følger med. Skriv inn navnet på det redigerte skriptet i ledeteksten, og trykk ENTER for å lese, tilpasse og tegne inn reduserte NSE-data. Den mellomliggende spredningsfunksjonen målt ved NSE for IgG- og MBP-proteiner viser et klart avvik fra en enkel diffusjonslignende avslapningsprosess på den korte fireårs tidsskalaen, noe som indikerer tilgjengeligheten av proteinintern dynamikk ved NSE, og behovet for en mer kompleks modell for å beskrive de observerte dynamiske prosessene.Resultatene av mellomliggende spredningsfunksjonsberegninger montert ved atommodellering av begge proteiner ved hjelp av modeller utviklet av, var i utmerket samsvar med de eksperimentelle NSE-dataene. Resultatene viste at langsommere dynamikk observert ved lengre furrier-tider kan tilskrives de generelle translasjons- og rotasjonsdiffusjonsprosessene, mens dynamikken observert på de korte tidsskalaene kan tilskrives dynamikken til proteindomener. En viktig ting å huske er behovet for godt forberedte og rene prøver for NSE-målinger.En god prøve for et Spin Echo har et flip-forhold høyere enn tre, som er forholdet mellom sammenhengende og usammenhengende spredning av prøven. Også under prøvepreparering og prøveinnlasting i NSE-cellene, skal prøveløsningen holdes trygg og fri for kjemisk eller biologisk krysskontaminering. Av sikkerhetsmessige årsaker bør inngangen i spektrometerkabinettet bare forsøkes etter at lukkeren er lukket, og ytterligere en halv time er tillatt for strålingskjøling av kabinettet.Small-Angle Neutron Scattering anbefales for å vurdere formen og strukturen av proteiner i en konsentrert løsning. Det kan gjøres før eller parallelt med NSE-eksperimentet. Ytterligere metoder som dynamisk lysspredning og viskositetsmålinger gir informasjon om translasjonsdiffusjonen og hydrodynamikkinteraksjonen i den konsentrerte proteinløsningen, og anbefales også.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Echo Particle Image Velocimetry

Ekko Particle Bilde Velocimetry

The transport of mass, momentum, and energy in fluid flows is ultimately determined by spatiotemporal distributions of the fluid velocity field.1 ...

Angle-resolved Photoemission Spectroscopy At Ultra-low Temperatures

Vinkel-løst photoemission Spectroscopy At Ultra-lave temperaturer

The physical properties of a material are defined by its  electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;)  and momentum ...

Gradient Echo Quantum Memory in Warm Atomic Vapor

Gradient Echo Quantum Minne i Warm Atomic Vapor

Gradient  echo memory (GEM) is a protocol for storing optical quantum states of light in  atomic ensembles. The primary motivation for such a technology ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Måling Material Microstructure Under Flow Bruke 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Spredning

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Using Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering to Investigate Organic Solar Cell Materials

Bruke nøytronspinke ekko løst beiteforekomst spredning for å undersøke organiske solcellematerialer

The spin echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) technique has been used to probe the length-scales associated with irregularly shaped ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Rask Imaging teknikken til å studere Drop Impact Dynamics of Non-Newtonske væsker

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Proton Transfer og Protein konformasjon Dynamics i Lysfølsomme Proteiner av Time-løst Step-skanne Fourier-transform infrarød spektroskopi

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraksjon Bruke Spesiallagde Lithium-ion batterier

Li-ion batteries are widely used in portable electronic devices and are considered as promising candidates for higher-energy applications such as electric ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Frihånds Lys Aktuatorer - Fabrikasjon og kontroll av aktivering i Mikroskopisk Scale

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

Rekombinasjon Dynamics i Thin-film Photovoltaic Materialer via Time-løst Mikrobølgeovn konduktivitet

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...