Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
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Esta investigación utilizó recursos en la Fuente de Neutrones de Espalación (BL-15, BL-6, laboratorios de Biología y Química), una Oficina del DOE de la Instalación de Usuarios de Ciencia operada por el Laboratorio Nacional de Oak Ridge. Esta investigación también utilizó recursos en el reactor MLZ-FRM2 Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) y el JCNS1 en Forschungszentrum Jülich GmbH, Alemania. El autor reconoce al Dr. Ralf Biehl y al Dr. Andreas Stadler por su ayuda con el modelado y su contribución a la investigación de proteínas IgG y MBP, al Dr. Piotr A. Żołnierczuk por el apoyo a la reducción de datos de NSE, al Dr. Changwoo Do por su apoyo con las mediciones de SANS, y a Rhonda Moody y al Dr. Kevin Weiss por el apoyo del laboratorio de bioquímica de SNS.

El presente trabajo caracteriza dos proteínas: una proteína igG de anticuerpos humanos regulares y la MBP intrínsecamente desordenada. La forma liofilizada de las proteínas se obtuvo de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de muestras de proteínas
<ol><li>Prepare un tampón de fosfato de sodio de 50 mM + 0,1 M de NaCl pesando y disolviendo los reactivos sólidos respectivos en agua pesada (D2O) (ver Tabla de ...

La espectroscopia NSE ofrece una visión única y detallada de la dinámica de las proteínas, que otras técnicas espectroscópicas no pueden producir. Las mediciones a lo largo de una escala de tiempo extendida proporcionan observaciones de la difusión traslacional y rotacional de las proteínas, como se presenta aquí. La dinámica segmentaria y otras oscilaciones internas se revelan como una fuerte desintegración de la función de dispersión coherente S(Q, t) en una escala de tiempo corta y están bien se...

Dinámica de sondeo de la materia blanda con neutrones La investigación de las propiedades dinámicas de las proteínas y los péptidos es una parte importante de la investigación biofísica, y hoy en día existen muchos métodos bien desarrollados para acceder a una amplia gama de paisajes energéticos1. Relacionar la dinámica revelada experimentalmente de las proteínas con su función biológica es una tarea mucho más difícil, que requiere modelos matemáticos complejos y simulaciones dinámicas asistidas por computadora. La importancia de la espectroscopia de neutrones para el análisis de los movimientos de las proteínas ha sido enfatizada en varios estudios bien recibidos y ampliamente reconocidos 1,2,3,4,5. Antes de explorar el diverso panorama energético de la dinámica interna de proteínas, se requiere una breve descripción de los procesos dinámicos en la materia blanda y cómo los neutrones pueden acceder a ellos.
La sensibilidad de los neutrones a la configuración isotópica y el tipo de interacciones que muestran con la materia blanda hace que la dispersión de neutrones sea una de las técnicas de investigación más versátiles6. Existe un amplio espectro de escalas de longitud de correlación y tiempos de correlación a los que los neutrones pueden acceder, desde excitaciones nucleares y vibraciones atómicas hasta movimientos colectivos y procesos de relajación lentos como rotaciones isotrópicas y movimientos difusivos. Al investigar los neutrones dispersos para su transferencia de energía, se pueden distinguir tres interacciones principales: la dispersión elástica, en la que no hay intercambio de energía entre el neutrón entrante y la partícula en la muestra; la dispersión inelástica, con un gran intercambio de energía cuantificable entre neutrones y partículas; y el peculiar caso de la dispersión cuasielástica que designa una transferencia de energía muy pequeña en comparación con la energía neutrónica incidente 1,7. Estas interacciones proporcionan información precisa sobre el material investigado y forman la base teórica de una amplia variedad de técnicas de dispersión de neutrones.
En la dispersión elástica, el detector registra las direcciones de los neutrones como un patrón de difracción, que muestra la posición de los átomos de muestra entre sí. Se adquiere información sobre las correlaciones de las posiciones atómicas (es decir, la intensidad integrada S (Q) con respecto a la transferencia de momento Q, que se refiere solo a la información estructural). Este principio constituye la base de la difracción de neutrones8.
La complejidad surge cuando la transferencia de energía ya no es cero debido a excitaciones y fluctuaciones internas en el material de la muestra. Esto forma la base de la espectroscopia de neutrones, en la que los neutrones dispersos se investigan en función tanto de la transferencia de energía E como de la transferencia de momento Q. Se obtiene información dinámica y estructural. La espectroscopia de neutrones mide la misma intensidad integrada S(Q) para la transferencia de energía (es decir, el cambio de velocidad de los neutrones debido a la dispersión de la muestra, S(Q,ω) = S(Q, E), que también se conoce como el factor de estructura dinámica)9.
Para calcular la dispersión a partir de un material, es más adecuado utilizar la función de correlación de pares 7,10. En el caso de difracción, la función de correlación de pares estáticos G(r) da la probabilidad de encontrar el centro de una partícula a una distancia dada r del centro de otra partícula. La espectroscopia generaliza la función de correlación de pares estáticos e incluye energía/frecuencia/tiempo en la ecuación de dispersión. La función de correlación de pares G(r) se convierte en una función del tiempo G(r, t), que puede descomponerse en una función de correlación de pares de átomos distinta GD(r, t), y una función de autocorrelación GS(r, t). Estos describen dos tipos de correlaciones: movimientos correlacionados por pares de átomos que gobiernan la dispersión coherente y autocorrelación que gobierna la dispersión incoherente10.
La dispersión coherente es la dispersión de "la media" y depende de la fase relativa de las ondas dispersas. En el régimen de dispersión de ángulo pequeño, las ondas de neutrones dispersas de diferentes centros de dispersión (diferentes átomos) interfieren constructivamente (tienen fases similares), y el movimiento colectivo de los átomos se observa con una fuerte mejora de intensidad. La dispersión coherente describe esencialmente la dispersión de un solo neutrón de todos los núcleos de la muestra10.
Cuando no se produce ninguna interferencia constructiva entre las ondas de neutrones dispersas de diferentes centros, se sigue un solo átomo en el tiempo, y se observa la autocorrelación entre la posición del átomo en el tiempo t = 0 y el mismo átomo en el tiempo t. Por lo tanto, la información sobre las posiciones relativas de los átomos se pierde, y el enfoque está solo en las fluctuaciones locales. La dispersión de las fluctuaciones locales gobierna la dispersión incoherente. La dispersión incoherente es isotrópica, contribuye a la señal de fondo y degrada la señal a ruido10,11.
Combinando todo lo anterior, distinguimos cuatro procesos principales de dispersión de neutrones10: (1) coherente elástico (mide las correlaciones de las posiciones atómicas), (2) coherente inelástico (mide los movimientos colectivos de los átomos), (3) elástico incoherente (contribuye al fondo, reduce la intensidad de dispersión por el factor de Debye-Waller (DWF) y mide el factor de estructura incoherente elástica (EISF), describiendo la geometría de los movimientos difusivos en geometría confinada, y (4) incoherente inelástica (mide la dinámica de un solo átomo y la autocorrelación).
Los procesos dinámicos a los que los neutrones pueden acceder en biología van desde la amortiguación de vibraciones atómicas y moleculares de baja frecuencia, la interacción de moléculas de solvente con biosuperficies y procesos de difusión en la capa de hidratación de macromoléculas y geometría confinada, hasta movimientos difusivos de traslación, rotación y caída de corto alcance, y dominios de proteínas y movimientos alostéricos1 . La amplia diversidad de métodos e instrumentos de neutrones para medir la dinámica de las proteínas se basa en cómo se logra la acromatización del haz de neutrones incidente o saliente y cómo se realiza el análisis energético de los neutrones dispersos. Desde el triple eje hasta el tiempo de vuelo, la retrodispersión y los espectrómetros de espín-eco, se pueden explorar procesos dinámicos con tiempos característicos entre 1 x 10-14 s y 1 x 10-6 s (femtosegundos a microsegundos)12.
El Laboratorio Nacional de Oak Ridge, con sus dos fuentes de neutrones de renombre, la Fuente de Neutrones de Espalación - SNS13 y el Reactor de Alto Flujo de Isótopos - HFIR14, tiene uno de los mejores conjuntos de espectrómetros para investigar la dinámica en biomateriales. Algunos de los ejemplos más elocuentes incluyen el uso del espectrómetro de picador de neutrones fríos (CNCS) en SNS15 para investigar la perturbación dinámica del agua de hidratación alrededor de la proteína fluorescente verde en la solución16 o las vibraciones colectivas sub-picosegundos de varias proteínas17. Un problema recurrente de las investigaciones de dispersión de neutrones inelásticos es que algunos procesos biológicos son demasiado lentos para ser observados. Sin configuraciones extremas que conduzcan a una gran pérdida de intensidad de neutrones, los espectrómetros de tiempo de vuelo están limitados a una resolución de energía de 10 μeV, lo que corresponde a una escala de tiempo máxima de ~ 200 ps10,11. Esto no es suficiente para observar movimientos a gran escala en las proteínas. Por lo tanto, a menudo se necesitan instrumentos con una mayor resolución de energía, como los espectrómetros de retrodispersión. La combinación de las técnicas de tiempo de vuelo y retrodispersión ha demostrado ser poderosa para investigar el cambio en la dinámica interna del citocromo P450cam (CYP101), una enzima que cataliza la hidroxilación alcanfor18.
La difusividad microscópica medida por el espectrómetro de retrodispersión en SNS-BASIS19 estaba sorprendentemente bien definida y podía separarse en la difusividad del agua (hidratación, citoplasmática y agua a granel) y la difusividad de los constituyentes celulares en gusanos planos planarios, el primer animal vivo que se estudió mediante dispersión de neutrones20 . La retrodispersión es una técnica espectroscópica de alta resolución, pero también se limita a varios μeV = varios nanosegundos, mientras que la dinámica lenta en los biomateriales también se manifiesta como el tiempo de supervivencia de la correlación entre la posición atómica o las orientaciones de espín (por ejemplo, procesos de relajación, que ocurren regularmente en el rango de tiempo de diez a cientos de nanosegundos).
La espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE) es la única técnica de dispersión de neutrones que alcanza una resolución tan alta. A diferencia de otras técnicas de neutrones, NSE no requiere la acromatización del haz, ya que utiliza la fase mecánica cuántica de los neutrones, que son sus momentos magnéticos. La manipulación de momentos magnéticos permite el uso de una amplia distribución de longitud de onda del haz de neutrones, mientras que la técnica es sensible a cambios de velocidad de neutrones muy pequeños del orden de 1 x 10-4. NSE se ha utilizado con éxito para investigar la dinámica lenta de las proteínas en solución para muchas proteínas. Entre estos muchos estudios pioneros, reconocemos el estudio de la flexibilidad segmentaria de la inmunoglobulina porcina21; los movimientos de dominio acoplado en la polimerasaTaq 22; los movimientos del dominio en el tetrámero de levadura alcohol deshidrogenasa23; el cambio de conformación en la fosfoglicerato quinasa sobre la unión al sustrato3; la activación de los movimientos de dominio y la propagación dinámica de señales alostéricas en la proteína 4,24,25 del cofactor regulador del intercambio Na+/H+ (NHERF1); la dinámica de un estado compacto de iones mercúricos reductasa26; y la difusión de hemoglobina en los glóbulos rojos27. Dos estudios más recientes en dinámica de proteínas han expuesto la flexibilidad del anticuerpo humano Inmunoglobulina G (IgG) como primavera entrópica28 y las características de la contribución de disolventes a la dinámica de la proteína básica de mielina intrínsecamente desordenada (MBP)5.
El presente artículo explica los principios básicos de NSE, los múltiples métodos preparatorios recomendados para una investigación exhaustiva de la dinámica de proteínas, así como la metodología y el protocolo experimental para la adquisición de datos de NSE en el espectrómetro NSE en SNS, SNS-NSE. El protocolo caracteriza dos proteínas: IgG, una proteína de anticuerpos humanos regulares, y la proteína intrínsecamente desordenada MBP. Las implicaciones biofísicas, la relevancia de la investigación de los ejemplos y las limitaciones de la técnica se discuten brevemente.
Espectroscopia NSE, el método para mediciones de dinámica lenta NSE es una técnica polarizada que utiliza el tiempo de vuelo de neutrones para medir el intercambio de energía (pérdida de polarización) debido a la interacción cuasi-elástica entre neutrones y átomos en una muestra. En el núcleo de la espectroscopia NSE se encuentran dos principios básicos: (1) la capacidad del espín de neutrones para precesar en el campo magnético con una frecuencia proporcional a la fuerza <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">magnética, a saber, la frecuencia de Larmor29, y (b) el espín-eco o eco de Hann, que representa la manipulación y reenfoque de la señal de polarización al aplicar una serie de pulsos de radiofrecuencia30.
Los conceptos básicos del proceso NSE se pueden resumir en unos sencillos pasos 6,11 utilizando la Figura 1. (1) El haz de neutrones producido por la fuente (posición 1) es polarizado (posición 2), guiado y transportado (posición 3), y llega a la entrada del espectrómetro NSE, donde se gira 90° por la primera aleta pi-half (posición 4). (2) El haz polarizado (por ejemplo, momentos magnéticos de neutrones) se vuelve perpendicular a las líneas del campo magnético del primer imán (primera zona de precesión, posición 5) y comienza a precesar. (3) Al final del imán, los espines de neutrones acumulan un cierto ángulo de precesión proporcional a la intensidad del campo magnético y al tiempo de vuelo pasado en su interior (básicamente inversamente proporcional a la velocidad del neutrón). Las velocidades de neutrones individuales están codificadas dentro de su ángulo de precesión al final de la primera zona de precesión. (4) Cerca de la posición de la muestra, el pi-flipper (posición 6) invierte la orientación del espín en 180°, cambiando el signo del ángulo de precesión. (5) Los neutrones interactúan con las moléculas de la muestra (posición 7) y se dispersan. (6) Los neutrones dispersos entran y precesan en la segunda zona de precesión (posición 8) pero se orientan hacia atrás. (7) Se utiliza otra aleta pi-half (posición 9) para girar la orientación del giro de perpendicular a la dirección horizontal. Esto detendrá la precesión, traduciendo el ángulo de precesión φ en polarización proporcional a cos(φ). (8) El analizador (posición 10) selecciona los neutrones en función de una orientación. Si la interacción con la muestra es elástica, la velocidad del neutrón no cambiará. Los neutrones pasarán una cantidad idéntica de tiempo volando en la primera y segunda zonas de precesión, y los ángulos de precesión acumulados se recuperan por completo. La polarización completa se restaura en el detector (posición 11) como un eco de la polarización original (es decir, espín-eco). (9) Sin embargo, en NSE, la dispersión es cuasi elástica, por lo que un pequeño intercambio de energía entre neutrones y moléculas de muestra conduce a diferentes velocidades de neutrones después de la dispersión por la muestra. Debido a las diferentes velocidades, los neutrones pasarán un tiempo adicional volando a través de la segunda zona de precesión y no habrán recuperado adecuadamente su ángulo de precesión. Se recupera una polarización parcial en el detector, y la pérdida de polarización debido a la relajación del espín es proporcional a la transformada cos-Fourier de la función espectral S(Q, ω), la función de dispersión intermedia F(Q, t). (10) El parámetro de tiempo de la función F(Q, t) es proporcional a la intensidad del campo magnético de precesión. El escaneo de la pérdida de polarización en función de la intensidad del campo magnético produce, por lo tanto, una función de relajación que depende de los procesos dinámicos dentro de la muestra.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figura 1: Fotografía del espectrómetro NSE en SNS (SNS-NSE) y esquema de trayectoria de vuelo de neutrones con los componentes funcionales más importantes. De derecha a izquierda: 1 = fuente de neutrones; 2 = choppers-bender-polarizador-sistema de obturador secundario; 3 = guías de transporte de vigas; 4 = pi/2 flipper para el primer giro de 90°; 5 = primera zona de precesión; 6 = pi flipper para 180° spin-turn; 7 = área de muestra y entorno de muestra (aquí, se muestra el crio-horno); 8 = segunda zona de precesión; 9 = pi/2 flipper para el segundo giro de 90°; 10 = analizador; 11 = detector. (Tenga en cuenta que las porciones de 3, así como 2 y 1, están situadas detrás de la pared azul dentro del blindaje; los helicópteros se reemplazan por un selector de velocidad para NSE basado en reactores). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

La actividad y funcionalidad de la mayoría de las proteínas del cuerpo humano están relacionadas con cambios de configuración de subdominios completos dentro de la estructura cristalina de la proteína. Las estructuras cristalinas construyen la base para cualquier cálculo que describa la estructura o dinámica de una proteína, la mayoría de las veces con fuertes restricciones geométricas. Sin embargo, estas restricciones de la estructura cristalina no están presentes en la solución. La estructura de las proteínas en la solución puede diferir del cristal debido a los reordenamientos de bucles o subdominios en la escala de tiempo de pico a nanosegundo (es decir, el régimen de tiempo de dinámica interna de proteínas). El presente trabajo describe cómo se puede acceder a cámaras lentas en escalas de tiempo de varias decenas de nanosegundos utilizando la dispersión de neutrones. En particular, la caracterización dinámica de dos proteínas humanas principales, una proteína intrínsecamente desordenada que carece de una estructura secundaria bien definida y una proteína de anticuerpo clásica, se aborda mediante espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE) combinada con una amplia gama de métodos de caracterización de laboratorio. Se lograron más conocimientos sobre la dinámica del dominio de las proteínas utilizando modelos matemáticos para describir los datos experimentales de neutrones y determinar el cruce entre los movimientos difusivos e internos combinados de las proteínas. La extracción de la contribución dinámica interna a la función de dispersión intermedia obtenida de NSE, incluida la escala de tiempo de los diversos movimientos, permite una mayor visión de las propiedades mecánicas de las proteínas individuales y la suavidad de las proteínas en su entorno casi natural en la solución de proteína abarrotada.

La proteína IgG de las proteínas MBP humanas y bovinas se reconstituyó a altas concentraciones (~ 50 mg / ml) en tampones de base O D2. Dado que las proteínas se disolvieron en altas concentraciones, las soluciones obtenidas fueron soluciones de proteínas abarrotadas. La dinámica investigada con NSE adolece del ambiente abarrotado en el que residen las proteínas (interacciones de factores de estructura y efectos hidrodinámicos)5,28,39</sup...

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Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

El presente protocolo describe métodos para investigar la estructura y la dinámica de dos proteínas modelo que tienen un papel importante en la salud humana. La técnica combina la caracterización biofísica de sobremesa con la espectroscopia de eco de espín de neutrones para acceder a la dinámica en escalas de tiempo y longitud relevantes para los movimientos entre dominios de proteínas.

Estudio de la dinámica de proteínas a través de la espectroscopia de eco de espín de neutrones

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

El siguiente protocolo presenta cómo configurar un experimento de eco de espín de neutrones para medir la función de dispersión intermedia e investigar la dinámica de las proteínas en solución. La principal ventaja de la espectroscopia de eco de espín de neutrones es su capacidad para observar el reordenamiento de los dominios y subdominios de proteínas en la escala de tiempo de pico a nanosegundo; que es el rango de cámaras lentas en proteínas en su entorno casi natural y en la solución de proteínas abarrotada. Neutron Spin Echo también es sensible a la configuración isotópica, lo que permite estudios muy específicos y específicos utilizando la coincidencia de contraste.La comprensión de la dinámica del dominio de las proteínas es una parte importante de la investigación biofísica en la difícil tarea en curso de transmitir los movimientos del dominio de las proteínas con su funcionalidad biológica. El protocolo presentado aquí se puede aplicar generalmente a cualquier medición de neutron spin echo realizada en el espectrómetro SNS-NSE, independientemente de su elección de muestras, si una se mantiene dentro del ámbito de los materiales de materia blanda. Para configurar el experimento, comience seleccionando el grosor de la carga de la muestra celular, en función de la concentración de la muestra de proteína, la temperatura necesaria para la medición y la cantidad de solución disponible.Limpie la célula con detergente para platos sin fosfato, agua desionizada y 70% de dietanol. Seque la celda en el horno de convección. Cargue cuatro mililitros de solución de proteína en la célula y cierre con tapas.Use una película de cera o cualquier sellador para sellar las células de la muestra. Cargue cuatro mililitros de tampón de diálisis en un recipiente idéntico al de la muestra de proteína y el sello. Transportar muestras a la línea de haz.Cierre el obturador e ingrese al área de la cueva del recinto del espectrómetro. Monte la celda de muestra en el portamuestras de aluminio apretando los tornillos y las placas de sujeción. Monte la muestra de grafito y la muestra de polvo de óxido de aluminio cargada en un recipiente idéntico al de la muestra de proteína.Coloque el mismo soporte deslizándolo suavemente en la lata del sistema de forzamiento de temperatura. Cierre la tapa del sistema de forzamiento de temperatura y ajuste la temperatura al valor deseado accediendo a la pantalla interactiva del sistema de forzamiento de temperatura. Monte la cámara de neutrones para la alineación de las muestras con el haz.Para recopilar los datos de la espectroscopia de eco de espín de neutrones, alinee la muestra en el haz de neutrones utilizando la cámara de neutrones y las cuatro aberturas de muestra independientes. Abra el software de recopilación de datos Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy y recopile estadísticas de muestra ejecutando escaneos de defracción para los ángulos de dispersión y la longitud de onda deseados. Configure los parámetros de medición en función de las estadísticas recopiladas para cada muestra editando las macros de medición proporcionadas por el Científico de Instrumentos Asistente.Comience a escanear escribiendo el nombre del protocolo en el símbolo del sistema y adquiriendo ecos para la muestra. Inicie sesión en el clúster de análisis remoto de Neutron Sciences con las credenciales de usuario de ORNL y pulse el botón de sesión de inicio. En el directorio de usuario, abra una ventana de terminal y escriba el comando de configuración del software.A continuación, escriba el comando de entorno. Cree una carpeta para la reducción de datos en el directorio principal y copie los scripts y macros proporcionados desde el directorio compartido. Edite, cambie el nombre y guarde la macro de reducción proporcionada en consecuencia.Escriba drspine" en el símbolo del sistema y presione Entrar para iniciar el entorno de reducción de software. Escriba el nombre de la macro de reducción en el símbolo del sistema dentro del entorno de software y presione Entrar. Edite el script de Python proporcionado por el científico de instrumentos asistente con los nombres de los datos de archivo reducidos.Edite la función para que se ajuste desde la biblioteca proporcionada. Escriba el nombre del script editado en el símbolo del sistema y presione Entrar para leer, ajustar y trazar datos NSE reducidos. La función de dispersión intermedia medida por NSE para las proteínas IgG y MBP muestra una clara desviación de un proceso de relajación simple similar a la difusión en la escala de tiempo corta de cuatro años, lo que indica la accesibilidad de la dinámica interna de la proteína por NSE, y la necesidad de un modelo más complejo para describir los procesos dinámicos observados.Los resultados de los cálculos de la función de dispersión intermedia ajustados por el modelado atómico de ambas proteínas utilizando modelos desarrollados por fueron excelentes con los datos experimentales de NSE. Los resultados demostraron que la dinámica más lenta observada en tiempos más largos puede atribuirse a los procesos generales de difusión traslacional y rotacional, mientras que la dinámica observada en las escalas de tiempo cortas se puede atribuir a la dinámica de los dominios de proteínas. Una cosa importante a recordar es la necesidad de muestras bien preparadas y limpias para las mediciones de NSE.Una buena muestra para un Spin Echo tiene una relación de volteo superior a tres, que es la relación entre la dispersión coherente e incoherente de la muestra. También durante la preparación de la muestra y la carga de la muestra en las células NSE, la solución de muestra debe mantenerse segura y libre de cualquier contaminación cruzada química o biológica. Por razones de seguridad, la entrada en el recinto del espectrómetro solo debe intentarse después de que se cierre la persiana, y se ha permitido un tiempo adicional de media hora para el enfriamiento por radiación del recinto.Se recomienda la dispersión de neutrones de ángulo pequeño para evaluar la forma y la estructura de las proteínas en una solución concentrada. Se puede hacer antes o en paralelo con el experimento NSE. Los métodos adicionales como la dispersión dinámica de la luz y las mediciones de viscosidad proporcionan información sobre la difusión traslacional y la interacción hidrodinámica dentro de la solución de proteína concentrada, y también se recomiendan.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Echo Particle Image Velocimetry

Echo velocimetría por imágenes de partículas

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Investigación

Ingeniería

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In Situ de neutrones polvo Difracción Uso de baterías de litio-ion por encargo

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