Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Bu araştırma, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı tarafından işletilen Bilim Kullanıcı Tesisi'nin bir DOE Ofisi olan Spallation Neutron Source'taki (BL-15, BL-6, Biyoloji ve Kimya laboratuvarları) kaynakları kullandı. Bu araştırma aynı zamanda MLZ-FRM2 reaktörü Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) ve Forschungszentrum Jülich GmbH, Almanya'daki JCNS1'deki kaynakları da kullandı. Yazar, modelleme konusundaki yardımları ve hem IgG hem de MBP protein araştırmalarına katkıları için Dr. Ralf Biehl ve Dr. Andreas Stadler'a, NSE veri azaltma desteği için Dr. Piotr A. Żołnierczuk'a, SANS ölçümlerine destek için Dr. Changwoo Do'ya ve SNS biyokimya laboratuvarı desteği için Rhonda Moody ve Dr. Kevin Weiss'a teşekkür ediyor.

Bu çalışma iki proteini karakterize ediyor: düzenli bir insan antikor proteini IgG ve özünde düzensiz MBP. Proteinlerin liyofilize formu ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Protein numunesi hazırlama
<ol><li>İlgili katı reaktifleri ağır suda (D2O) tartarak ve çözerek 50 mM sodyum fosfat + 0,1 M NaCl tamponu hazırlayın (bkz. Bu, IgG için deuterated tampon çözücüsüdür.<ol>
<li>...

NSE spektroskopisi, diğer spektroskopik tekniklerin üretemediği proteinlerin dinamiklerinin benzersiz ve ayrıntılı bir görünümünü sunar. Uzun bir zaman ölçeğindeki ölçümler, burada sunulduğu gibi, hem proteinlerin translasyonel hem de rotasyonel difüzyonunun gözlemlerini sağlar. Segmental dinamikler ve diğer iç salınımlar kendilerini kısa bir zaman ölçeğinde tutarlı saçılma fonksiyonu S(Q, t)'nin güçlü bir bozunumu olarak ortaya çıkarır ve genel difüzyonel gevşeme süreçl...

Yumuşak maddenin nötronlarla sondalama dinamikleri Proteinlerin ve peptitlerin dinamik özelliklerini araştırmak, biyofiziksel araştırmanın önemli bir parçasıdır ve günümüzde çok çeşitli enerji manzaralarına erişmek için birçok iyi geliştirilmiş yöntembulunmaktadır 1. Proteinlerin deneysel olarak ortaya çıkan dinamiklerini biyolojik işlevleriyle ilişkilendirmek, karmaşık matematiksel modeller ve bilgisayar destekli dinamik simülasyonları gerektiren çok daha zor bir iştir. Protein hareketlerinin analizi için nötron spektroskopisinin önemi, iyi karşılanan ve yaygın olarak tanınan birkaç çalışmada vurgulanmıştır 1,2,3,4,5. İç protein dinamiklerinin çeşitli enerji manzarasını keşfetmeden önce, yumuşak maddedeki dinamik süreçlere ve nötronların bunlara nasıl erişebileceğine dair kısa bir genel bakış gereklidir.
Nötronların izotopik konfigürasyona duyarlılığı ve yumuşak madde ile gösterdikleri etkileşimlerin türü, nötron saçılımını en çok yönlü araştırma tekniklerinden biri haline getirir6. Nötronların erişebileceği geniş bir korelasyon uzunluğu ölçekleri ve korelasyon süreleri spektrumu vardır, nükleer uyarımlardan ve atomik titreşimlerden kolektif hareketlere ve izotropik rotasyonlar ve difüzif hareketler gibi yavaş gevşeme süreçlerine kadar. Dağınık nötronları enerji transferleri için araştırırken, üç ana etkileşim ayırt edilebilir: numunede gelen nötron ve parçacık arasında enerji alışverişinin olmadığı elastik saçılma; nötron ve parçacık arasında büyük, ölçülebilir bir enerji değişimi ile elastik olmayan saçılma; ve olay nötron enerjisine kıyasla çok küçük bir enerji transferini gösteren tuhaf yarı-elastik saçılma durumu 1,7. Bu etkileşimler, araştırılan malzeme hakkında kesin bilgi verir ve çok çeşitli nötron saçılma tekniklerinin teorik temelini oluşturur.
Elastik saçılmada, dedektör nötronların yönlerini, örnek atomların birbirlerine göre konumunu gösteren bir kırınım paterni olarak kaydeder. Atomik konumların korelasyonları hakkında bilgi edinilir (yani, yalnızca yapısal bilgiyle ilgili olan momentum transferi Q ile ilgili entegre yoğunluk S ( Q). Bu ilke nötron kırınımının temelini oluşturur8.
Karmaşıklık, numune malzemesindeki uyarılmalar ve iç dalgalanmalar nedeniyle enerji transferi artık sıfır olmadığında ortaya çıkar. Bu, dağınık nötronların hem enerji transferi E hem de momentum transferi Q'nun bir fonksiyonu olarak araştırıldığı nötron spektroskopisinin temelini oluşturur. Dinamik ve yapısal bilgiler elde edilir. Nötron spektroskopisi, enerji transferi için aynı entegre yoğunluk S(Q)'yu ölçer (yani, numune saçılması nedeniyle nötronların hız değişimi, S(Q,ω) = S(Q, E), dinamik yapı faktörü olarak da adlandırılır)9.
Bir malzemeden saçılımı hesaplamak için, 7,10 çift korelasyon fonksiyonunu kullanmak daha yeterlidir. Kırınım durumunda, statik çift korelasyon fonksiyonu G(r), bir parçacığın merkezini başka bir parçacığın merkezinden belirli bir mesafe r'de bulma olasılığını verir. Spektroskopi, statik çift korelasyon fonksiyonunu genelleştirir ve saçılma denklemine enerji / frekans / zaman içerir. Çift korelasyon fonksiyonu G(r), ayrı bir atom çifti korelasyon fonksiyonu G D(r, t) ve bir öz-korelasyon fonksiyonu G S(r, t) olarak ayrıştırılabilen G(r, t) zamanının bir fonksiyonu haline gelir. Bunlar iki tür korelasyonu tanımlar: tutarlı saçılımı yöneten atomların çift korelasyonlu hareketleri ve tutarsız saçılımı yöneten kendi kendine korelasyon10.
Tutarlı saçılma, "ortalama" dan saçılmadır ve dağınık dalgaların göreceli fazına bağlıdır. Küçük açılı saçılma rejiminde, farklı saçılma merkezlerinden (farklı atomlar) gelen saçılan nötron dalgaları yapıcı bir şekilde müdahale eder (benzer fazlara sahiptir) ve atomların kolektif hareketi güçlü yoğunluk artışı ile gözlenir. Tutarlı saçılma esas olarak örnek10'daki tüm çekirdeklerden tek bir nötronun saçılmasını tanımlar.
Farklı merkezlerden gelen dağınık nötron dalgaları arasında yapıcı bir girişim meydana gelmediğinde, zaman içinde tek bir atom takip edilir ve atomun t = 0 zamanındaki konumu ile t zamanındaki aynı atom arasındaki öz korelasyon gözlenir. Böylece, atomların göreceli konumları hakkındaki bilgiler kaybolur ve odak noktası sadece yerel dalgalanmalardır. Yerel dalgalanmalardan kaynaklanan saçılma, tutarsız saçılımı yönetir. Tutarsız saçılma izotropiktir, arka plan sinyaline katkıda bulunur ve sinyalden gürültüye 10,11'i bozar.
Yukarıdakilerin hepsini birleştirerek, dört ana nötron saçılma işlemini ayırt ediyoruz10: (1) elastik tutarlı (atomik konumların korelasyonlarını ölçer), (2) elastik olmayan tutarlı (atomların kolektif hareketlerini ölçer), (3) elastik tutarsız (arka plana katkıda bulunur, Debye-Waller faktörü (DWF) ile saçılma yoğunluğunu azaltır ve sınırlı geometrideki difüzyon hareketlerinin geometrisini tanımlayan elastik tutarsız yapı faktörünü (EISF) ölçer, ve (4) elastik tutarsız (tek atom dinamiklerini ve kendi kendine korelasyonu ölçer).
Nötronların biyolojide erişebileceği dinamik süreçler, düşük frekanslı atomik ve moleküler titreşimlerin sönümlenmesinden, çözücü moleküllerinin biyo-yüzeylerle etkileşiminden ve makromoleküllerin hidrasyon tabakasındaki difüzyon işlemlerinden ve sınırlı geometriden, kısa menzilli translasyonel, rotasyonel ve yuvarlanan difüzyon hareketlerine ve protein alanlarına ve allosterik hareketlere kadaruzanır1 . Protein dinamiklerini ölçmek için nötron yöntemlerinin ve araçlarının geniş çeşitliliği, olayın veya giden nötron ışınının akromatizasyonunun nasıl elde edildiğine ve dağınık nötronların enerji analizinin nasıl yapıldığına dayanmaktadır. Üç eksenden uçuş zamanına, geri saçılmaya ve spin-echo spektrometrelerine kadar, 1 x 10-14 s ile 1 x 10-6 s (femtosaniyelerden mikrosaniyelere)12 arasındaki karakteristik sürelere sahip dinamik süreçler keşfedilebilir.
Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, iki ünlü nötron kaynağı olan Spallation Neutron Source - SNS13 ve High Isotop Flux Reactor - HFIR14 ile, biyo-malzemelerdeki dinamikleri araştırmak için en iyi spektrometre paketlerinden birine sahiptir. En anlamlı örneklerden bazıları, SNS15'teki soğuk nötron kıyıcı spektrometresinin (CNCS), çözelti16'daki yeşil floresan proteini etrafındaki hidrasyon suyunun dinamik pertürbasyonunu veya birkaç proteinin pikosaniye altı kolektif titreşimlerini araştırmak için kullanılmasıdır17. Elastik olmayan nötron saçılma araştırmalarının tekrarlayan bir problemi, bazı biyolojik süreçlerin gözlemlenemeyecek kadar yavaş olmasıdır. Büyük bir nötron yoğunluğu kaybına yol açan aşırı kurulumlar olmadan, uçuş süresi spektrometreleri, ~ 200 ps 10,11'lik maksimum zaman ölçeğine karşılık gelen10 μeV enerji çözünürlüğü ile sınırlıdır. Bu, proteinlerdeki büyük ölçekli hareketleri gözlemlemek için yeterli değildir. Bu nedenle, geri saçılma spektrometreleri gibi daha yüksek enerji çözünürlüğüne sahip cihazlara sıklıkla ihtiyaç duyulur. Uçuş süresi ve geri saçılma tekniklerini birleştirmek, hidroksilasyon kafuru18'i katalize eden bir enzim olan Sitokrom P450cam'ın (CYP101) iç dinamiklerindeki değişimi araştırmak için güçlü olduğunu kanıtlamıştır.
SNS-BASIS19'daki geri saçılma spektrometresi tarafından ölçülen mikroskobik difüzyon şaşırtıcı derecede iyi tanımlanmıştır ve suyun difüzyonuna (hidrasyon, sitoplazmik ve toplu benzeri su) ve nötron saçılması ile incelenen ilk canlı hayvan olan planarian yassı solucanlardaki hücre bileşenlerinin difüzyonuna ayrılabilir20 . Geri saçılma yüksek çözünürlüklü spektroskopik bir tekniktir, ancak aynı zamanda birkaç μeV = birkaç nanosaniye ile sınırlıdır, biyomalzemelerdeki yavaş dinamikler aynı zamanda atomik konum veya spin oryantasyonları arasındaki korelasyonun hayatta kalma süresi olarak da kendini gösterir (örneğin, on ila yüzlerce nanosaniye zaman aralığında düzenli olarak gerçekleşen gevşeme süreçleri).
Nötron spin eko spektroskopisi (NSE), bu kadar yüksek çözünürlüğe ulaşan tek nötron saçılma tekniğidir. Diğer nötron tekniklerinin aksine, NSE, nötronların manyetik momentleri olan kuantum mekanik fazını kullandığı için ışının akromatizasyonunu gerektirmez. Manyetik momentlerin manipülasyonu, geniş bir nötron ışını dalga boyu dağılımının kullanılmasına izin verirken, teknik 1 x 10-4 sırasına göre çok küçük nötron hızı değişikliklerine duyarlıdır. NSE, birçok protein için çözeltideki proteinlerin yavaş dinamiklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bu birçok öncü çalışma arasında, domuz immünoglobulin21'in segmental esnekliğinin incelenmesini kabul ediyoruz; Taq polimeraz22'deki birleştirilmiş alan hareketleri; maya alkol dehidrogenaz23'ün tetramerindeki etki alanı hareketleri; substrat bağlanması üzerine fosfogliserat kinazdaki konformasyonun değişmesi3; alan hareketlerinin aktivasyonu ve Na+/H+ değişim düzenleyici kofaktör 1 (NHERF1) proteini4,24,25'teki allosterik sinyallerin dinamik yayılımı; merkürik iyon redüktaz26'nın kompakt bir durumunun dinamiği; ve hemoglobinin kırmızı kan hücrelerinde difüzyonu27. Protein dinamiği üzerine yapılan iki yeni çalışma, insan antikoru İmmünoglobulin G'nin (IgG) entropik bir yay28 olarak esnekliğini ve çözücünün içsel olarak bozulmuş miyelin bazik proteininin (MBP) dinamiklerine katkısının özelliklerini ortaya koymuştur5.
Bu makalede, NSE'nin temel ilkeleri, kapsamlı bir protein dinamiği araştırması için önerilen çoklu hazırlık yöntemleri ve ayrıca SNS, SNS-NSE'deki NSE spektrometresinde NSE veri toplama metodolojisi ve deneysel protokolü açıklanmaktadır. Protokol iki proteini karakterize eder: IgG, normal bir insan antikor proteini ve özünde düzensiz protein MBP. Biyofiziksel etkileri, örneklerin araştırma ile ilgisi ve tekniğin sınırlamaları kısaca tartışılmıştır.
NSE spektroskopisi, yavaş dinamik ölçümleri için yöntem NSE, bir numunedeki nötronlar ve atomlar arasındaki yarı-elastik etkileşim nedeniyle enerji değişimini (polarizasyon kaybı) ölçmek için nötron uçuş süresini kullanan polarize bir tekniktir. NSE spektroskopisinin özünde iki temel ilke yatmaktadır: (1) nötron spininin manyetik alanda manyetik kuvvetle <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">orantılı bir frekansla presese kabiliyeti, yani Larmor frekansı29 ve (b) bir dizi radyofrekans darbesi uygulanırken polarizasyon sinyalinin manipülasyonunu ve yeniden odaklanmasını temsil eden spin-echo veya Hann echo30.
NSE sürecinin temelleri, Şekil 1 kullanılarak birkaç basit adımda 6,11 olarak özetlenebilir. (1) Kaynak tarafından üretilen nötron ışını (konum 1) polarize edilir (konum 2), yönlendirilir ve taşınır (konum 3) ve NSE spektrometresinin girişine ulaşır, burada ilk pi-yarı palet (konum 4) tarafından 90 ° döndürülür. (2) Polarize ışın (örneğin, nötron manyetik momentleri) ilk mıknatısın manyetik alan çizgilerine (ilk presesyon bölgesi, pozisyon 5) dik hale gelir ve presese başlar. (3) Mıknatısın sonunda, nötron dönüşleri, manyetik alan kuvveti ve içeride harcanan uçuş süresi ile orantılı olarak belirli bir presesyon açısı biriktirir (temel olarak nötron hızıyla ters orantılıdır). Bireysel nötron hızları, ilk presesyon bölgesinin sonundaki presesyon açıları içinde kodlanır. (4) Numune konumuna yakın olan pi-palet (konum 6), presesyon açısının işaretini değiştirerek spinin yönünü 180 ° tersine çevirir. (5) Nötronlar numunenin molekülleriyle etkileşime girer (konum 7) ve dağılır. (6) Dağınık nötronlar ikinci presesyon bölgesine (pozisyon 8) girer ve presese girer, ancak ters yönelimli hale gelir. (7) Spin yönünü dikten yatay yöne döndürmek için başka bir pi-yarım palet (konum 9) kullanılır. Bu, presesyon açısını φ cos(φ) ile orantılı polarizasyona çevirerek presesyonu durduracaktır. (8) Analizör (konum 10) nötronları bir yöne göre seçer. Numune ile etkileşim elastik ise, nötronun hızı değişmeyecektir. Nötronlar, birinci ve ikinci presesyon bölgelerinde uçmak için aynı miktarda zaman harcayacak ve biriken presesyon açıları tamamen geri kazanılacaktır. Tam polarizasyon, dedektörde (pozisyon 11) orijinal polarizasyonun (yani spin-echo) bir yankısı olarak geri yüklenir. (9) Bununla birlikte, NSE'de saçılma yarı-elastiktir, bu nedenle nötronlar ve numune molekülleri arasındaki küçük bir enerji değişimi, numune tarafından saçıldıktan sonra farklı nötron hızlarına yol açar. Farklı hızlar nedeniyle, nötronlar ikinci presesyon bölgesinden uçmak için ek bir zaman harcayacak ve presesyon açılarını düzgün bir şekilde geri kazanamayacaktır. Dedektör üzerinde kısmi bir polarizasyon alınır ve spin gevşemesine bağlı polarizasyon kaybı, spektral fonksiyon S(Q, ω), ara saçılma fonksiyonu F(Q, t)'nin cos-Fourier dönüşümü ile orantılıdır. (10) F(Q, t) fonksiyonunun zaman parametresi, presesyon manyetik alan kuvveti ile orantılıdır. Polarizasyon kaybının manyetik alan kuvvetinin bir fonksiyonu olarak taranması, bu nedenle, numune içindeki dinamik süreçlere bağlı bir gevşeme fonksiyonu verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Resim 1: SNS'DE (SNS-NSE) NSE SPEKTROMETRESININ VE EN ÖNEMLI FONKSIYONEL BILEŞENLERLE NÖTRON SINEK YOLU ŞEMASıNıN FOTOĞRAFı. Sağdan sola: 1 = nötron kaynağı; 2 = doğrayıcılar-bükücü-polarizör-ikincil deklanşör sistemi; 3 = kiriş taşıma kılavuzları; İlk 90° spin-turn için 4 = pi/2 palet; 5 = ilk presesyon bölgesi; 6 = 180 ° spin-turn için pi flipper; 7 = numune alanı ve numune ortamı (burada, kriyo-fırın gösterilmiştir); 8 = ikinci presesyon bölgesi; İkinci 90° spin-turn için 9 = pi/2 palet; 10 = analizör; 11 = dedektör. (3'ün yanı sıra 2 ve 1'in bölümlerinin ekranlamanın içindeki mavi duvarın arkasında yer aldığını unutmayın; Kıyıcılar, reaktör tabanlı NSE için bir hız seçici ile değiştirilir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

Çoğu insan vücudu proteininin aktivitesi ve işlevselliği, protein kristal yapısı içindeki tüm alt alanların konfigürasyonel değişiklikleri ile ilgilidir. Kristal yapılar, çoğu zaman güçlü geometrik kısıtlamalarla bir proteinin yapısını veya dinamiklerini tanımlayan herhangi bir hesaplamanın temelini oluşturur. Bununla birlikte, kristal yapıdan gelen bu kısıtlamalar çözeltide mevcut değildir. Çözeltideki proteinlerin yapısı, piko-nanosaniye zaman ölçeğindeki döngülerin veya alt alanların yeniden düzenlenmesi nedeniyle kristalden farklı olabilir (yani, iç protein dinamiği zaman rejimi). Bu çalışma, onlarca nanosaniyelik zaman ölçeklerindeki yavaş hareketlere nötron saçılması kullanılarak nasıl erişilebileceğini açıklamaktadır. Özellikle, iki ana insan proteininin, iyi tanımlanmış bir ikincil yapıya ve klasik bir antikor proteinine sahip olmayan, özünde düzensiz bir proteinin dinamik karakterizasyonu, çok çeşitli laboratuvar karakterizasyon yöntemleriyle birlikte nötron spin eko spektroskopisi (NSE) ile ele alınmaktadır. Deneysel nötron verilerini tanımlamak ve kombine difüzyon ve iç protein hareketleri arasındaki geçişi belirlemek için matematiksel modelleme kullanılarak protein etki alanı dinamikleri hakkında daha fazla bilgi elde edildi. Çeşitli hareketlerin zaman çizelgesi de dahil olmak üzere NSE'den elde edilen ara saçılma fonksiyonuna iç dinamik katkının ekstraksiyonu, tek proteinlerin mekanik özelliklerine ve kalabalık protein çözeltisindeki neredeyse doğal ortamlarında proteinlerin yumuşaklığına daha fazla görüş sağlar.

İnsan serumu ve sığır MBP proteinlerinden elde edilen IgG proteini,D2O-baz tamponlarında yüksek konsantrasyonlarda (~ 50 mg / mL) yeniden oluşturuldu. Proteinler yüksek konsantrasyonlarda çözündüğü için, elde edilen çözeltiler kalabalık protein çözeltileriydi. NSE kullanılarak araştırılan dinamikler, proteinlerin içinde bulunduğu kalabalık ortamdan muzdariptir (yapı faktörü etkileşimleri ve hidrodinamik etkiler)5,28,39.<s...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Bu protokol, insan sağlığında önemli bir role sahip olan iki model proteinin yapısını ve dinamiklerini araştırmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknik, protein etki alanları arası hareketlerle ilgili zaman ve uzunluk ölçeklerindeki dinamiklere erişmek için tezgah üstü biyofiziksel karakterizasyonu nötron spin eko spektroskopisi ile birleştirir.

Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Aşağıdaki protokol, ara saçılma fonksiyonunu ölçmek ve çözeltideki proteinlerin dinamiklerini araştırmak için bir Nötron Spin Yankı deneyinin nasıl kurulacağını sunmaktadır. Nötron Spin Yankı Spektroskopisinin temel avantajı, protein alanlarının ve alt alanlarının pikodan nanosaniyeye kadar yeniden düzenlenmesine bakma yeteneğidir; bu, proteinlerdeki neredeyse doğal ortamlarında ve kalabalık protein çözeltisindeki ağır hareketlerin aralığıdır. Neutron Spin Echo ayrıca kontrast eşleştirme kullanarak çok spesifik ve hedefli çalışmalara izin veren izotopik konfigürasyona duyarlıdır.Protein etki alanı dinamiklerine ilişkin içgörüler, proteinlerin etki alanı hareketlerini biyolojik işlevleriyle aktarmak için devam eden zor görevde biyofiziksel araştırmanın önemli bir parçasıdır. Burada sunulan protokol, SNS-NSE spektrometresinde gerçekleştirilen herhangi bir Nötron Spin Yankı ölçümüne, yumuşak madde malzemeleri alanında kalırsa, numune seçiminize bakılmaksızın genel olarak uygulanabilir. Deneyi kurmak için, protein numunesinin konsantrasyonuna, ölçüm için gereken sıcaklığa ve mevcut çözelti miktarına bağlı olarak hücre numunesi yüklemesinin kalınlığını seçerek başlayın.Hücreyi fosfatsız bulaşık deterjanı, deiyonize su ve% 70 dietanol ile temizleyin. Hücreyi konveksiyonlu fırında kurutun. Hücreye dört mililitre protein çözeltisi yükleyin ve kapaklarla kapatın.Numune hücrelerini kapatmak için balmumu filmi veya herhangi bir sızdırmazlık maddesi kullanın. Dört mililitre diyaliz tamponunu protein numunesi ve conta ile aynı kaba yükleyin. Numuneleri kiriş hattına taşıyın.Deklanşörü kapatın ve spektrometre muhafazası mağara alanına girin. Vidaları ve tutma plakalarını sıkarak numune hücresini alüminyum numune tutucuya monte edin. Grafit numunesini ve alüminyum oksit tozu numunesini, protein numunesiyle aynı kaba yükleyin.Aynı tutucuyu, sıcaklık zorlama sisteminin kutusuna hafifçe kaydırarak yerleştirin. Sıcaklık zorlama sistemi kapağını kapatın ve sıcaklık zorlama sisteminin etkileşimli ekranına erişerek sıcaklığı istenen değere ayarlayın. Numunelerin ışına hizalanması için nötron kamerayı takın.Nötron Spin Yankı Spektroskopisi verilerini toplamak için, nötron kamerasını ve dört bağımsız örnek açıklığını kullanarak nötron ışınındaki numuneyi hizalayın. Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy veri toplama yazılımını açın ve istenen saçılma açıları ve dalga boyu için kırılma taramaları çalıştırarak örnek istatistikler toplayın. Yardımcı Cihaz Bilimcisi tarafından sağlanan ölçüm makrolarını düzenleyerek her numune için toplanan istatistiklere dayanarak ölçüm parametrelerini ayarlayın.Komut istemine protokol adını yazarak ve örnek için yankılar alarak taramaya başlayın. Neutron Sciences Remote Analysis kümesinde ORNL kullanıcı kimlik bilgileriyle oturum açın ve oturumu başlat düğmesine basın. Kullanıcı dizininde bir terminal penceresi açın ve yazılım kurulum komutunu yazın.Ardından, ortam komutunu yazın. Giriş dizininde veri azaltma için bir klasör oluşturun ve sağlanan komut dosyalarını ve makroları paylaşılan dizinden kopyalayın. Buna göre sağlanan azaltma makrosunu düzenleyin, yeniden adlandırın ve kaydedin.Komut istemine drspine" yazın ve yazılım azaltma ortamını başlatmak için Enter tuşuna basın. Yazılım ortamındaki komut istemine azaltma makrosunun adını yazın ve Enter tuşuna basın. Assisting Instrument Scientist tarafından sağlanan Python betiğini azaltılmış dosya verilerinin adlarıyla düzenleyin.İşlevi, sağlanan kitaplıktan sığacak şekilde düzenleyin. Komut istemine düzenlenen komut dosyasının adını yazın ve azaltılmış NSE verilerini okumak, sığdırmak ve çizmek için Enter tuşuna basın. IgG ve MBP proteinleri için NSE tarafından ölçülen ara saçılma fonksiyonu, dört yıllık kısa zaman ölçeğinde basit bir difüzyon benzeri gevşeme sürecinden açık bir sapma göstererek, protein iç dinamiklerinin NSE tarafından erişilebilirliğini ve gözlemlenen dinamik süreçleri tanımlamak için daha karmaşık bir modele duyulan ihtiyacı göstermektedir.Her iki proteinin atomik modellemesi ile donatılan ara saçılma fonksiyonu hesaplamalarının sonuçları, deneysel NSE verileriyle mükemmel bir uyum içindeydi. Sonuçlar, daha uzun kürklü zamanlarda gözlenen daha yavaş dinamiklerin genel translasyonel ve rotasyonel difüzyon süreçlerine atfedilebileceğini, kısa zaman ölçeklerinde gözlenen dinamiklerin ise protein alanlarının dinamiklerine atfedilebileceğini kanıtladı. Hatırlanması gereken önemli bir şey, NSE ölçümleri için iyi hazırlanmış ve temiz numunelere duyulan ihtiyaçtır.Bir Spin Echo için iyi bir numune, numunenin tutarlı ve tutarsız saçılması arasındaki oran olan üçten daha yüksek bir çevirme oranına sahiptir. Ayrıca numune hazırlama ve NSE hücrelerine numune yükleme sırasında, numune çözeltisi güvenli tutulmalı ve herhangi bir kimyasal veya biyolojik çapraz kontaminasyondan uzak tutulmalıdır. Güvenlik nedeniyle, spektrometre muhafazasına giriş sadece deklanşör kapatıldıktan sonra denenmelidir ve muhafazanın radyasyonla soğutulması için yarım saat daha süre tanınmıştır.Konsantre bir çözeltideki proteinlerin şeklini ve yapısını değerlendirmek için Küçük Açılı Nötron Saçılması önerilir. NSE deneyinden önce veya NSE deneyine paralel olarak yapılabilir. Dinamik ışık saçılması ve viskozite ölçümleri gibi ek yöntemler, konsantre protein çözeltisi içindeki translasyonel difüzyon ve hidrodinamik etkileşim hakkında bilgi sağlar ve ayrıca önerilir.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Echo Particle Image Velocimetry

Parçacık Hızı Echo

The transport of mass, momentum, and energy in fluid flows is ultimately determined by spatiotemporal distributions of the fluid velocity field.1 ...

Angle-resolved Photoemission Spectroscopy At Ultra-low Temperatures

Ultra-düşük sıcaklıklarda Açı çözüldü Photoemission Spektroskopi

The physical properties of a material are defined by its  electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;)  and momentum ...

Gradient Echo Quantum Memory in Warm Atomic Vapor

Sıcak Atom Vapor Gradient Echo Kuantum Hafıza

Gradient  echo memory (GEM) is a protocol for storing optical quantum states of light in  atomic ensembles. The primary motivation for such a technology ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

1-2 Düzlem Flow-Küçük Açı Nötron Saçılma kullanma Malzeme Mikroyapı altında Akış Ölçme

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Using Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering to Investigate Organic Solar Cell Materials

Nötron Spin Echo'nun Kullanılması, Organik Güneş Hücresi Malzemelerini Araştırmak İçin Otlatma İnsidansını Dağıtmayı Çözdü

The spin echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) technique has been used to probe the length-scales associated with irregularly shaped ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Non-Newtonian Akışkanlar Bırak Etkisi Dynamics Eğitim Hızlı Görüntüleme Tekniği

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

Yerinde Nötron Toz Kırınım olarak Ismarlama Lityum-iyon Piller kullanma

Li-ion batteries are widely used in portable electronic devices and are considered as promising candidates for higher-energy applications such as electric ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Serbest biçimli Işık Aktüatörler - Mikroskobik Ölçeğinde imalat ve çalıştırma Kontrolü

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

Zaman çözülmesi Mikrodalga İletkenlik aracılığıyla İnce film Fotovoltaik Malzemeler rekombinasyon Dinamikleri

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...