Name: coculture of axotomized rat retinal ganglion neurons with olfactory ensheathing glia, as an in vitro model of adult axonal regeneration
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das Projekt SAF2017-82736-C2-1-R von Ministerio de Ciencia e Innovacién bis MTM-F und durch die Stiftung Universidad Francisco de Vitoria an JS finanziell unterstützt.

HINWEIS: Tierversuche wurden von nationalen und institutionellen Bioethik-Ausschüssen genehmigt.
1. ihOEG (Ts12 und Ts14) Kultur
HINWEIS: Dieses Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einem Gewebekultur-Biosicherheitsschrank durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie 50 ml ME10 OEG-Kulturmedium wie in Tabelle 1vorgesehen vor.</li>
	<li>Bereiten Sie 5 ml DMEM/F12-FBS, wie in Tabelle 1vorgesehen, in einem 15 ml konischen Rohr vor.</...

<ol>
	<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair:+Its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus.">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).</li><li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury.">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).</li><li>Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+olfactory+mesenchymal+stromal+cell+transplants+promote+remyelination+and+earlier+improvement+in+gait+coordination+after+spinal+cord+injury.">Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury.</a> Glia. 65 (4), 639-656 (2017).</li><li>Moreno-Flores, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+cell+line+from+immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promotes+functional+recovery+in+the+injured+spinal+cord.">A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord.</a> Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).</li><li>Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair.">Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair.</a> Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).</li><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Su, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells:+biology+in+neural+development+and+regeneration.">Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration.</a> Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).</li><li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+for+spinal+cord+injury:+sniffing+out+the+issues.">Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues.</a> Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).</li><li>G&#243;mez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+spinal+cord+injury+with+olfactory+ensheathing+glia+cells+(OECs).">Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs).</a> Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).</li><li>Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+glia:+repairing+injury+to+the+mammalian+visual+system.">Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system.</a> Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+olfactory+ensheathing+cells+restore+retinal+function+in+a+rat+model+of+light-induced+retinal+damage+by+inhibiting+oxidative+stress.">Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress.</a> Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).</li><li>Pastrana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+associated+with+adult+axon+regeneration+promoted+by+olfactory+ensheathing+cells:+a+new+role+for+matrix+metalloproteinase+2.">Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2.</a> The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).</li><li>Pastrana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+production+by+olfactory+ensheathing+cells+contributes+to+axonal+regeneration+of+cultured+adult+CNS+neurons.">BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons.</a> Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).</li><li>Sim&#243;n, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+by+olfactory+ensheathing+glia+promotes+axonal+regeneration.">Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration.</a> Glia. 59, 1458-1471 (2011).</li><li>Lim, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+immortalized+human+olfactory+ensheathing+glia+from+an+elderly+donor+maintain+neuroregenerative+capacity.">Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity.</a> Glia. 58, 546-558 (2010).</li><li>Garc&#237;a-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+senescence+progression+in+reversibly+immortalized+human+ensheathing+glia+permits+their+survival+after+deimmortalization.">Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization.</a> Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).</li><li>Garc&#237;a-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuroregenerative+human+ensheathing+glia+cell+line+with+conditional+rapid+growth.">A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth.</a> Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).</li><li>Plaza, N., Sim&#243;n, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+an+immortalized+olfactory+ensheathing+glia+cell+line+with+the+green+fluorescent+protein+(GFP)+gene:+Evaluation+of+its+neuroregenerative+capacity+as+a+proof+of+concept.">Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept.</a> Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).</li><li>Deumens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+glial+cells+stimulates+directional+neurite+growth+of+CNS+neurons+in+vitro.">Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro.</a> Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).</li><li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+promote+neurite+sprouting+of+injured+axons+in+vitro+by+direct+cellular+contact+and+secretion+of+soluble+factors.">Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).</li><li>Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+ensheathing+glia+promote+the+long-distance+growth+of+adult+retinal+ganglion+cell+neurites+in+vitro.">Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro.</a> Glia. 53 (5), 467-476 (2006).</li><li>Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+exert+a+trophic+effect+on+the+hypothalamic+neurons+in+vitro.">Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro.</a> Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).</li><li>Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+represent+an+optimal+substrate+for+hippocampal+neurons:+an+in+vitro+study.">Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).</li><li>Runyan, S. A., Phelps, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+olfactory+ensheathing+glia+enhance+axon+outgrowth+on+a+myelin+substrate+in+vitro.">Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro.</a> Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).</li><li>Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+promote+corticospinal+axonal+outgrowth+by+a+L1+CAM-dependent+mechanism.">Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism.</a> Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).</li><li>Roloff, F., Ziege, S., Baumg&#228;rtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell-free+adult+canine+olfactory+ensheathing+cell+preparations+from+olfactory+bulb+and+mucosa+display+differential+migratory+and+neurite+growth-promoting+properties+in+vitro.">Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro.</a> BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).</li><li>Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cell-neurite+alignment+enhances+neurite+outgrowth+in+scar-like+cultures.">Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures.</a> Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).</li><li>Wigley, C. B., Berry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+adult+rat+retinal+ganglion+cell+processes+in+monolayer+culture:+comparisons+between+cultures+of+adult+and+neonatal+neurons.">Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons.</a> Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).</li><li>Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+olfactory+nerve+ensheathing+cells+are+effective+promoters+of+adult+central+nervous+system+neurite+outgrowth+in+coculture.">Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture.</a> Glia. 25 (3), 256-269 (1999).</li><li>Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+olfactory+ensheathing+cell+signaling+mechanisms:+effects+on+their+support+for+neurite+regrowth+from+adult+CNS+neurons+in+coculture.">Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture.</a> Glia. 44 (3), 232-241 (2003).</li><li>Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+and+interactions+between+phenotypic+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+in+promoting+CNS+axonal+regeneration.">Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration.</a> Glia. 50 (1), 12-20 (2005).</li><li>Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Mart&#237;n-Bermejo, M. J., D&#237;az-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promote+axonal+regeneration+of+rat+retinal+ganglion+neurons.">Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).</li><li>Garc&#237;a-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+olfactory+mucosa+cells+but+not+lung+or+skin+fibroblasts+mediate+axonal+regeneration+of+retinal+ganglion+neurons.">Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons.</a> Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).</li><li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ.">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li><li>S&#225;nchez Martin, C., D&#237;az-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+site-specific+phosphorylation+of+the+microtubule-associated+protein+2+during+the+development+of+cultured+neurons.">Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons.</a> Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).</li><li>Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+cell+purification+and+determination+of+cell+purity:+crucial+aspects+of+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+repair.">Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair.</a> Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).</li></ol>

OEG-Transplantation an ZNS-Verletzungsstellen gilt aufgrund ihrer konstitutiven pro-neuroregenerativen Eigenschaften7,8,9als vielversprechende Therapie für ZNS-Verletzungen. Je nach Gewebequelle – Olfaktorische Schleimhaut (OM-OEG) versus Olfaktorinde (OB-OEG) – oder dem Alter des Spenders besteht jedoch eine erhebliche Veränderung in dieser Kapazität26,31,</...

Adult Central Nervous System (ZNS) Neuronen haben begrenzte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen oder Krankheiten. Eine gemeinsame Strategie zur Förderung der ZNS-Regeneration ist die Transplantation von Zelltypen an der Verletzungsstelle, die axonales Wachstum induzieren, wie Stammzellen, Schwannzellen, Astrozyten oder olfaktorische Ensheathing-Glia (OEG)-Zellen1,2,3,4,5.
OEG leitet sich vom Neuralkamm6 ab und lokalisiert in der riech-Mukose und in der Riechbirne. Bei Erwachsenen sterben olfaktorische sensorische Neuronen regelmäßig als Folge der Umweltexposition und werden durch neu differenzierte Neuronen ersetzt. OEG umgibt und führt diese neuen olfaktorischen Axone in die Riechbirne und um neue Synapsen mit ihren Zielen in der CNS7zuetablieren. Aufgrund dieser physiologischen Eigenschaften, OEG wurde in Modellen der ZNS-Verletzung wie Rückenmark oder Sehnerv-Verletzung verwendet und seine neuroregenerativen und neuroprotektive Eigenschaften werden bewiesen8,9,10,11. Mehrere Faktoren wurden als verantwortlich für die pro-regenerativen Eigenschaften dieser Zellen identifiziert, einschließlich extrazellulärer Matrixproteasen Produktion oder Sekretion von neurotrophen und axonalen Wachstumsfaktoren12,13,14.
Angesichts der technischen Einschränkungen zur Erweiterung primärer OEG-Zellen haben wir zuvor reversible, unsterblichen humane OEG (ihOEG) Klonlinien etabliert und charakterisiert, die eine unbegrenzte Versorgung mit homogenen OEG bieten. Diese ihOEG-Zellen stammen aus Primärkulturen, die aus olfaktorischen Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien gewonnen werden. Sie wurden durch Transduktion der telomerase katalytischen Untereinheit (TERT) und des Onkogens Bmi-1 verewigt und mit dem SV40-Virus großes T-Antigen15,16,17,18modifiziert. Zwei dieser ihOEG-Zelllinien sind Ts14, das die Regenerationsfähigkeit der ursprünglichen Kulturen beibehält, und Ts12, eine niedrige regenerative Linie, die in diesen Experimenten als niedrige Regenerationskontrolle verwendet wird18.
Zur Bewertung der OEG-Fähigkeit zur Förderung der axonalen Regeneration nach neuralen Verletzungen wurden mehrere In-vitro-Modelle implementiert. In diesen Modellen wird OEG auf Kulturen unterschiedlicher neuronaler Herkunft angewendet und Neuritenbildung und Dehnung – als Reaktion auf gliaale Kokultur – werden als Assay untersucht. Beispiele für solche neuronalen Quellen sind neonatale Ratte kortikale Neuronen19, Kratzwunden an Ratten embryonalen Neuronen aus kortikalen Gewebedurchgeführt 20, Ratte Netzhautexplante21, Ratte hypothalamische oder hippocampale postnatale Neuronen22,23, postnatale Ratte dorsale Wurzel Ganglion Neuronen24, postnatale Maus kortikospinalen Trakt Neuronen25, menschliche NT2 Neuronen26, oder postnatale zerebrale kortikale Neuronen auf reaktive Astrozyten Narben-ähnliche Kulturen27.
In diesen Modellen beruht der Regenerationstest jedoch auf embryonalen oder postnatalen Neuronen, die eine intrinsische Plastizität aufweisen, die bei verletzten erwachsenen Neuronen fehlt. Um diesen Nachteil zu überwinden, präsentieren wir ein Modell der erwachsenen axonalen Regeneration in Kokulturen von OEG-Linien mit erwachsenen retinalen Ganglionneuronen (RGNs), basierend auf dem ursprünglich von Wigley et al.28,29,30,31 und modifiziert und von unserer Gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kurz gesagt, Netzhautgewebe wird von erwachsenen Ratten extrahiert und mit Papain verdaut. Die Netzhautzellsuspension wird dann entweder auf polylysinbehandelten Abdeckungen oder auf Ts14- und Ts12-Monolayern plattiert. Kulturen werden 96 h lang gepflegt, bevor sie fixiert werden, und dann wird immunfluoreszenz für axonale (MAP1B- und NF-H-Proteine)34 und somatodendritische (MAP2A und B)35 Marker durchgeführt. Die axonale Regeneration wird als Prozentsatz der Neuronen mit Axon quantifiziert, in Bezug auf die Gesamtpopulation der RGNs und der axonale Regenerationsindex wird als mittlere axonale Länge pro Neuron berechnet. Dieses Protokoll ist nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody 514</td>
			<td>Reference 34</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody SMI-31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283967</td>
			<td>NMDA receptor inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Nuclei fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11573397</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-Hyclone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16291082</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH-USA)</td>
			<td></td>
			<td>Image software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuronal cells culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>For use in neural cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>H3BE02-017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745E</td>
			<td>Bacteriostatic and bactericidal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly -L- lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-003-M</td>
			<td></td>
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coculture of axotomized rat retinal ganglion neurons with olfactory ensheathing glia, as an in vitro model of adult axonal regeneration

Olfaktorische Ensheathing-Glia-Zellen (OEG) werden von der Riechschleimhaut bis hin zur Riechnervenschicht (ONL) der Riechbirne lokalisiert. Während des gesamten Erwachsenenlebens sind sie der Schlüssel für den axonalen Anbau von neu erzeugten olfaktorischen Neuronen, von der Lamina propria bis zum ONL. Aufgrund ihrer pro-regenerativen Eigenschaften wurden diese Zellen verwendet, um die axonale Regeneration in Rückenmarks- oder Sehnervenverletzungsmodellen zu fördern.
Wir präsentieren ein In-vitro-Modell, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen und zu messen. In diesem Modell wird reversibel verewigtes menschliches OEG (ihOEG) als Monolayer kultiviert, Netzhaut werden aus erwachsenen Ratten extrahiert und Retinalganglionneuronen (RGN) werden auf die OEG-Monoschicht kokultiviert. Nach 96 h werden axonale und somatodendritische Marker in RGNs durch Immunfluoreszenz analysiert und die Anzahl der RGNs mit Axon und die mittlere axonale Länge/Neuron quantifiziert.
Dieses Protokoll hat den Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Assays, die auf embryonalen oder postnatalen Neuronen basieren, dass es die neuroregenerativen OEG-Eigenschaften im erwachsenen Gewebe bewertet. Es ist auch nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.

In diesem Protokoll stellen wir ein In-vitro-Modell vor, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen. Wie in Abbildung 1dargestellt, ist die OEG-Quelle eine reversible verewigte menschliche OEG-Klonzelllinie -Ts14 und Ts12-, die aus Primärkulturen stammt, die aus geruchserhaltenden Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien15,17,18hergestellt werden. Netzha...

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Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...