Name: an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice
Uploaded: 2021-05-19T13:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

يشكر المؤلفان ت. ياماموتو وY. موري على مساعدتهما في التجارب المورفولوجية. وقد دعم هذا العمل منحة في المعونة للبحوث العلمية (C) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (18K06871 إلى M.O.K. و 17K08536 إلى H.M).

<ol>
	<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+&#252;berlebenden+S&#228;ugethierherzen.">Untersuchungen am &#252;berlebenden S&#228;ugethierherzen.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Joshi-Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+plasticity+in+long-term+cultures+of+adult+ventricular+myocytes.">Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).</li><li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells.">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li><li>Zhou, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes:+methods+for+cellular+genetic+physiology.">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+sustained+K++current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle.">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> Journal of Physiology. 504, 557-563 (1997).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Sambrano, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+signalling+network+in+mouse+cardiac+myocytes.">Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.</a> Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cardiac+fibroblasts+in+post-myocardial+heart+tissue+repair.">The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair.</a> Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+self-beating+cardiomyocytes+in+adult+mouse+ventricles.">A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).</li><li>Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+TRPC3+increases+apoptosis+but+not+necrosis+in+response+to+ischemia-reperfusion+in+adult+mouse+cardiomyocytes.">Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+and+functional+role+of+the+rapidly+activating+delayed+rectifier+K(+)+current+in+left+and+right+atria+of+adult+mice.">Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice.</a> European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).</li><li>Milgroom, A., Ralston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+skeletal+muscle+with+CLARITY+for+light+microscopy+imaging.">Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging.</a> Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

نظرا لأن القلب عرضة بشدة للإصابة بالكيمياء ، فيجب الحفاظ على الوقت المستغرق لاستئصال القلب وغمره في CIB-EGTA البارد لوقف الانكماش قصيرا قدر الإمكان (<1 دقيقة). هذه هي الخطوة الهامة الأولى من هذا الأسلوب. وتتعلق الخطوة الحرجة الثانية باتجاه القلب. التوجه الخاص للقلب المقتطع في الخطوة 2.1.2 يجعل من السهل رؤية وإزالة الدهون والأنسجة الضامة حول الشريان الأورطي. بعد التنظيف حول الشريان الأورطي، ضع القلب المشدون مع الجانب السطحي الأمامي على لوحة التشوه. الخطوة الحاسمة الأخيرة تنطوي على إدخال إبرة الحقن. عند التقدم الإبرة نحو القلب، لا ينبغي فصل إبرة الحقن من لوحة التشوه من أجل الحفاظ على مسافة ثابتة من لوحة. يقع موضع الإدخال بالقرب من قمة البطين الأيسر. أدخل الإبرة بعناية دون التواء ، لأن مثل هذا التواء قد تكبير الحفرة. يمكن تقدير عمق إدخال الإبرة من خلال مشاهدة العلامة الحمراء. إذا تم إدخال الإبرة عميقة جدا، قد يخترق الطرف الحاجز البطيني ويدخل البطين الأيمن أو على الرغم من الصمام التاجي ويدخل الأذين الأيسر. بعد التأكد من اختفاء الدم من الشريان التاجي ، يجب إصلاح الإبرة بشريط على لوحة التشوه.
طول الأبهر أطول يجعل من الصعب المشبك الشريان الأورطي في الموقف الصحيح. إذا كان المشبك بعيدا جدا عن الأذين ، فقد يدور القلب بعد التسريب. لمنع هذا، قطع الشريان الأورطي فقط تحت الشريان العضدي لتقصير الشريان الأورطي قبل لقط.
إذا لم يبدأ الدم في التصريف بعد التشوه بسرعة أولية تبلغ 0.5 مل/دقيقة، فرفع السرعة إلى 1 مل/دقيقة. إذا لم يساعد ذلك، فقد يتم وضع إبرة الحقن بشكل غير صحيح، كما هو الحال في البطين الأيمن أو الحاجز البطيني أو جدار عضلة القلب الأيسر. في مثل هذه الحالة، قم بإزالة الإبرة على الفور وحاول إعادة إدخالها بالقرب من قمة البطين الأيسر. عند إدخال الإبرة عدة مرات، قد تتدفق الخلايا المهضومة من الثقوب المفتوحة. لاحظ أن هذا لا يؤثر عادة بشكل خطير على عزل الخلية.
يمكن للمشغلين مراقبة العملية الكاملة للتشويش المسبق للقلب باستخدام مجهر مجسم لمراقبة التغيرات في اللون والشفافية وإعادة تشغيل ضرب الأذينين جنبا إلى جنب مع الهضم. وينبغي أن يكون ما مجموعه 10 مل من مزيج الانزيم الحد الأقصى المطلوب، حتى بالنسبة للقلب القديم. في قلوب الشباب (5-7 أسابيع من العمر)، ونحن خفض حجم إلى 9 مل، وهو ما يشبه النهج عن طريق التغلغل الرجعية مع نفس مزيج الانزيم.
يحتوي الناطور في الطرد المركزي النهائي على حطام وخلايا دم وخلايا غير عضلية في حين أن الكريات تحتوي بشكل رئيسي على خلايا القلب وتلوث الخلايا غير العضلية ، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. لتنقية خلايا القلب، هناك حاجة إلى مزيد من الخطوات. بشكل عام، يجب إعادة إنفاق بيليه في الوسط المناسب لثقافة الخلية وpreplateed لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية على طبق زراعة الخلايا النسيجية، ومن ثم إزالة بلطف cardiomyocytes عن طريق الأنابيب وprelating للثقافة.
يحتوي مزيج الإنزيم على تركيز منخفض من Ca2+ (0.3 mM). لذلك نحن احتضان الخلايا المهضومة في CIB-Ca2+-BSA (1.2 mM Ca2+) قبل إعادة الإنفاق النهائي مع محلول إعادة إنفاق الخلية (1.8 mM Ca2+) ، والزيادة التدريجية في Ca2 + تتجنب التسبب في تلف الخلايا7. طالما أن خلايا القلب المعزولة سليمة (خلايا هادئة بدون انكماش) فإن إجراء التكيف Ca2+هذا لا يؤثر على صلاحية الخلية في الفئران. وبما أن الخلايا التالفة تموت أثناء هذا الحضانة، فإننا نحصل بالتالي على مجموعة خلايا سليمة. وبالمثل، يمكن تخزين الخلايا العضلية الأذينية المعزولة السليمة (الخلايا الكوزة دون انكماش غير منتظم) في نفس محلول إعادة الإنفاق على الخلايا. ومع ذلك ، فإن الخلايا العضلية الأذينية تميل إلى أن تكون أكثر حساسية ليتم تخزينها مقارنة بالخلايا العضلية البطينية.
في المختبر، تكون طريقة العزل هذه ناجحة دائما تقريبا ما لم يفشل إدخال الإبرة في البطين الأيسر. كما نجحنا في عزل الخلايا عن القلب المتضخم الذي أعده الانقباض الأبهري العرضي الجراحي. ومع ذلك ، في الفئران القديمة ، والتي غالبا ما يكون احتشاءات عضلة القلب الصغيرة ، يتوقف التغلغل في بعض الأماكن ، مما يؤدي إلى هضم غير مكتمل وبالتالي انخفاض العائد(الشكل 1C)، على غرار طريقة الرجعية المستندة إلى Langendorff. في مثل هذه الحالات ، يمكن ملاحظة الشكل المشوه للقلب حتى في بداية التشوه.
هذه الطريقة التغلغلية السابقة للتحلل مفيدة لعزل خلايا القلب عن الفئران من مختلف الأعمار ولكن ليس الحيوانات الكبيرة ، مثل الأرانب والخنازير الغينية. قد يكون من الممكن تطبيق هذه الطريقة على الفئران الوليدية أو الصغيرة قبل فطمها.
واحدة من مزايا هذه الطريقة التغلغل قبل التحلل هو أنه يقلل من العقبات التقنية المرتبطة باستخدام أسلوب التغلغل الرجعي القائم على Langendorff لقلوب الفئران الصغيرة. الوقت اللازم للتشويش هو حوالي 7 دقائق مع 10 مل من الإنزيمات ، تزيد فترة الهضم القصيرة هذه من صلاحية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمكن من إجراء التشوه من خلال الدورة الدموية التاجية للقلب ، حتى بعد هضم الصمامات الأبهري. عزل الخلايا العضلية الأذينية عادة ما يتطلب Langendorff القائم على التحلل الرجعي والحضانة مزيد من الانزيمات17. هذا النهج التغلغل قبل التحلل، ومع ذلك، يمكن أن يتغلغل بعمق الأنسجة مع الانزيم لعزل الخلايا العضلية الأذينية.
في التجارب التي تستخدم الفئران متعددة، وينبغي تنظيف جهاز Langendorff قبل التغلغل في القلب التالي. ومع ذلك ، في الطريقة الحالية السابقة للتحلل ، طالما يتم إعداد العدد المطلوب من مجموعات الأدوات (مثل إبر المحاقن ولوحات التشويش) مسبقا ، يمكن إجراء التشوه بشكل مستمر.
نحن هنا تقرير المنهجية الأساسية للتشويش السابق للقلب الماوس باستخدام نفس الحلول مثل طريقة التغلغل الرجعية Langendorff القائم مع عدم وجود مواد كيميائية إضافية. يمكن تغيير تكوين البيرفوسات ليناسب الغرض من التجربة ، مثل استخدام المنظفات التي تحتوي على EGTA بدلا من الإنزيمات لصنع قلب منزوعالخلايا 18.

عموما، الخطوة الأولى من عزلة خلية واحدة من الأنسجة تشريح ينطوي على قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة، تليها هضم النسيج الضام ومصفوفة خارج الخلية مع الإنزيمات. ومع ذلك ، لا يمكن عزل خلايا القلب مع مثل هذه الطريقة التقطيع ، حيث أن الإثراء بمكونات المصفوفة خارج الخلية ، بما في ذلك ألياف الكولاجين والإيلاستين ، يجعل عضلة القلب صعبة للغاية على المفروم ، وخلايا القلب حساسة للغاية لنقص الأكبسجة والتغيرات الأخرى في البيئة الدقيقة. وهكذا، باستخدام نظام الارتخاء الرجعي القائم على Langendorff1،تم تطوير طريقة لهضم المصفوفة خارج الخلية مع الإنزيمات لعزل خلايا القلب الفردية من القلب2،3،4.
في نماذج الماوس، Langendorff المستندة إلى الرجعية perfusion القلب مع الانزيمات يستخدم أيضا لعزل خلايا القلب الفردية5،6،7،8. ومع ذلك ، فإن علبة الشريان الأورطي الماوس الصغيرة والرقيقة وتصاعدها على جهاز Langendorff لأداء التخثر الرجعي يتطلب درجة عالية من المهارة ، لأن قطر الشريان الأورطي في قلب البالغين يبلغ حوالي 1.2 مم. وعلاوة على ذلك، فإنه يأخذ وقتا لإجراء تجارب متعددة كما ينبغي تنظيف جهاز Langendorff قبل التغلغل في القلب التالي.
كبديل للتشويش الرجعي ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل خلايا القلب من قلب فأر بالغ دون جهاز Langendorff. واستند هذا الأسلوب صنع عصر على التغلغل قبلغراد من الشرايين التاجية9. قمنا مؤخرا بتحسين كل خطوة من هذا البروتوكول السابق للتحلل ، مثل لقط الشريان الأورطي ، وإدخال الإبر ، والتحكم في درجة الحرارة ، ورصد جميع إجراءات التشوه بالمجهر10. نحن هنا تقرير بالتفصيل صقل هذه الطريقة التغلغل قبلغراد لتقصير الوقت للعزلة وتوفير شريط فيديو تكميلي. في هذه الطريقة ، يستغرق تغلغل القلب حوالي 7 دقائق مع 10 مل من الإنزيمات ، وتزيد فترة الهضم القصيرة هذه من صلاحية الخلايا. هذه طريقة بسيطة لعزل خلايا القلب المفردة بجودة عالية دون الحاجة إلى إضافة مواد كيميائية ، مثل 2،3 بوتانديون monoxime (BDM)6،11 أو تورين5،8. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة سوف تخفض عتبة المهارة من هذه التقنية وتعزيز فائدة خلايا القلب الماوس في البحوث الأساسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-actinin (ACTN)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>AB5490-I</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, USA</td>
			<td>2118</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle actin (SMA)</td>
			<td>Dako, Denmark</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Amersham, GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA934</td>
			<td>Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Biological material for adhesion of the cell or tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One Super&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>02230-14</td>
			<td>Chemiluminescent reagent used for western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 2</td>
			<td>Worthington Biochemicals, USA</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche, Germany</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>A mixture of several protease inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;6&#39;diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>11034-56</td>
			<td>Used for cell-impermeant nuclear stainig&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>including 4.5 g/L gluose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>X1-50</td>
			<td>Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC-8 patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Lab., Japan</td>
			<td></td>
			<td>outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP lithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal microelectrode puller&#160;</td>
			<td>Germany)</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Natsume Seisakusho, Japan</td>
			<td>KN-475-3-40</td>
			<td>Equipment to warm the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>TE-311</td>
			<td>Infusion syringe pump for antegrade perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injeciton needle (27 gauge)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>Needle for insertion into the left ventricle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (from bovine pancrease)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I5500</td>
			<td>Dissolve in 0.1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cordless grinder</td>
			<td>Funakoshi, Japan</td>
			<td>cG-4A</td>
			<td>Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09154-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G potassium</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26239-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26807-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>27575-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic multi-well culture plate</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>353226</td>
			<td>Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (20 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td>Use for infusion of CIB-EGTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (30 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-30ES</td>
			<td>Use for infusion of Enzyme-mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P5147</td>
			<td>A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Sample buffer solution</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>198-13282</td>
			<td>Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS polyacrylamide gel&#160; (15%)</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>193-14991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>32237-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09422-81</td>
			<td>Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T8003</td>
			<td>Trypsin from bovine Type 1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular clamp</td>
			<td>Karl Hammacher GmbH, Germany</td>
			<td>HSE 004-35</td>
			<td>Small straight vascular clamp used for clamping aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other reagents</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice

في البحوث الأساسية باستخدام قلب الماوس، عزل خلايا القلب الفردية قابلة للحياة هو خطوة تقنية حاسمة للتغلب عليها. تقليديا، تم إجراء عزل خلايا القلب من الأرانب والخنازير غينيا أو الفئران عن طريق التغلغل إلى الوراء من القلب مع الإنزيمات باستخدام جهاز Langendorff. ومع ذلك، مطلوب درجة عالية من المهارة عند استخدام هذه الطريقة مع قلب الماوس صغيرة. تم الإبلاغ مؤخرا عن طريقة التغلغل التي لا تستخدم جهاز Langendorff لعزل خلايا القلب الماوس. نحن هنا تقرير بروتوكول كامل لتحسين التغلغل قبل التحلل من القلب المقتطع لعزل خلايا القلب الفردية من الفئران البالغة (8-108 أسابيع من العمر). يتم إجراء التشوه الأمامي عن طريق حقن اليرفوسات بالقرب من قمة البطين الأيسر للقلب المقتطع ، الذي تم تثبيت الشريان الأورطي منه ، باستخدام مضخة ضخ. يتم تنفيذ جميع الإجراءات على حصيرة سخان مسبقة الدفء تحت المجهر ، مما يسمح بمراقبة عمليات الحقن والتشويش. تشير النتائج إلى أن الخلايا العضلية البطينية والأبطية ، والخلايا الليفية يمكن عزلها بشكل جيد عن فأر بالغ واحد في وقت واحد.

مبدأ هذه الطريقة بسيط: يتدفق التغلغل من الغرفة اليسرى ، ويتم فتح الصمام الأبهري ، ويمتد التغلغل إلى الشريان التاجي في نفس اتجاه تشغيل الدم ، حيث يتم إغلاق الشريان الأبهري عن طريق اللقط ، مما يتيح التغلغل العميق في عضلة القلب من أجل هضم المصفوفة خارج الخلية.
تظهر الخلايا الن البطينية المعزولة حديثا مع الطريقة الحالية في الشكل 1A. يظهر الشكل 1B صورا مكبرة للخلايا العضلية البطينية والبطينية. وقد أسفر هذا الإجراء عن ارتفاع الغلة (70٪-80٪) من الخلايا البطينية على شكل قضيب من الفئران البالغة (8-10 أسابيع) ، والتي كانت متاحة في غضون 5 ساعات تقريبا بعد العزلة (الشكل 1C) ، وهو فاصل زمني مماثل لذلك عند استخدام الإجراء التقليدي القائم على Langendorff7. ومع ذلك ، كانت نسبة الخلايا القابلة للحياة المعزولة حديثا أقل في الفئران القديمة من >2 سنة(الشكل 1C). كان العدد الإجمالي للخلايا الن البطينية التي تم الحصول عليها لكل قلب بالغ باستخدام هذا البروتوكول حوالي 3 × 106 خلايا ، والتي كانت مماثلة للقيمة المبلغ عنها سابقا7،12. وكانت إمكانات العمل المسجلة في الخلايا العضلية البطينية والبطينية(الشكل 1D)مماثلة لتلك الموجودة في الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال الطريقة10المستندة إلى Langendorff . أكد تحليل المناعة أن الهيكل الساركوميري للخلايا العضلية البطينية كان منظما بشكل جيد مع غشاء خلية مرئي بوضوح(الشكل 2A). يمكن استخدام خلايا القلب الفردية المعزولة مع هذه الطريقة مباشرة في التجارب ، مثل التحليل الكهربي10 أو تجربة التخبز المناعي.
توجد الخلايا الليفية القلبية في المساحات الخلالية. الهضم الكافي للمصفوفة خارج الخلية يؤدي إلى عزل تلك الخلايا. تتكاثر الخلايا الليفية القلبية المعزولة في ظل ظروف الثقافة ويمكن تمريرها عدة مرات أو تخزينها في النيتروجين السائل في محلول خزان الخلايا المناسب. الشكل 2B يظهر أن معظم الخلايا الليفية القلبية المستزرعة قد تحولت إلى الخلايا العضلية الليفية خلال الثقافة الفرعية، كما أكد التعبير المتزايد عن α العضلات الملساء actin13،14. أيضا ، يمكن عزل السلف القلبية مع الطريقة الحالية ومثقفة في وسط الثقافة المناسبة ، والتي تبدأ الضرب تلقائيا10،15.
تجانس عضلة القلب القوية ليس سهلا ، خاصة بالنسبة للأنسجة القلبية من الفئران القديمة ، التي تمتلك كمية كبيرة من الألياف خارج الخلية. بعد التخثر المسبق ، يمكن تجانس البروتين من الأذينين والبطينين بسهولة في حاجز التحلل مع قوة الضوء لاستخراج البروتينات. أظهر تحليل لطخة غربية التعبير المحدد عن ANP في الأذينين ولكن ليس في البطينين من البالغين (20 أسبوعا) والذين تتراوح أعمارهم بين (108 أسابيع من العمر) الفئران(الشكل 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 خلايا القلب المعزولة من الفئران. A. الخلايا العضلية البطينية معزولة حديثا مع التخبط قبل التحلل، مع الصور المكتسبة مع التكبير منخفضة. بعد الغسيل النهائي ، تم إعادة إنفاق خلايا القلب مع 2 مل من محلول إعادة الإنفاق الخلوي ، تم إسقاط 100 ميكرولتر منها على طبق ثقافة الزجاج السفلي وتسوية الخلية المنتظرة. شريط، 100 ميكرومتر.B. صور مكبرة من الخلايا العضلية البطينية المعزولة (العلوي) والخلايا العضلية الأذينية (أقل). بار، 100 ميكرومتر.C. تم تعليق الخلايا المعزولة في محلول إعادة تعليق الخلية وتخزينها عند 37 درجة مئوية للفترة المطلوبة، وتم حساب عدد الخلايا العضلية البطينية الحية في 10-15 حقلا تحت المجهر. واعتبرت الزنزانات المستديرة مصابة أو ميتة بصورة لا رجعة فيها16. تم الحصول على رموز خضراء وزرقاء وحمراء من 3 فئران في عمر 8-10 أسابيع ، وكانت الرموز السوداء من الماوس القديم 106 أسابيع. يشير الرمز الأصفر إلى متوسط كل مجموعة. دال - إمكانات العمل التمثيلية المسجلة من الخلايا العضلية البطينية (السوداء) والأذيان (الحمراء) من الفئران 8-10. تم الحصول على البيانات من الخلايا حوالي 3 ساعة بعد العزل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم المناعة α-actinin في الخلايا العضلية البطين الماوس معزولة والعضلات α الملساء actin في الخلايا الليفية القلبية الماوس المستزرعة. أ. فحص الليزر Confocal المجهر من المناعة لsin α (الأخضر)، DAPI تلطيخ لنوى (الأزرق) وصورة DIC من الخلايا العضلية البطيني معزولة عن قلب الماوس مع التشوه قبل التحلل. شريط، 50 ميكرومتر.B. المناعة لactin العضلات α على نحو سلس (الأخضر)، DAPI تلطيخ لنوى (الأزرق) وصورة DIC من الخلايا الليفية القلبية معزولة عن قلب الماوس مع التشوه قبل التحلل. تم استزراع الخلايا الليفية القلبية لمدة أربعة أيام. شريط، 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig3.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تحليلات بقعة الغربية من ANP في الأذينين والبطينين. تحليلات لطخة الغربية للببتيد ناتريوريتيك الأذينية علامة (ANP) في الأذينين (A) والبطينين (V) أعدت من الكبار (20 أسبوعا) والذين تتراوح أعمارهم بين (108 أسابيع) قلوب. ANP موجود في الأذينين ولكن غائبة في البطينين. استخدام غليسيرالدهيد 3 فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH) كبروتين مراقبة حفظ المنزل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">حلول المخزون لعزل خلايا القلب</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10X CIB (500 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>37.99 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCI</td>
			<td>2.01 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م م م2
</td>
			<td>2.5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0.23 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيبس</td>
			<td>29.79 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاف</td>
			<td>تعبئة حتى 500 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mM CaCl2 الأسهم soution</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاكل2 </td>
			<td>100 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">400 mM EGTA الأسهم الحل</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
			<td>400 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">محلول الأنسولين</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنسولين</td>
			<td>وحدة واحدة/مل في 0.1 م هكل</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">50X المضادات الحيوية الأسهم حل (20 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>بنسلين</td>
			<td>100 ملغ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ستريبتومايسين</td>
			<td>100 ملغ</td>
		</tr>
<tr>
<td>فينول الأحمر</td>
			<td>1.5 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاف</td>
			<td>20 مل وتعقيم مع تصفية</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">حل 10X التيرود (1000 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>81.82 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>4.03 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م م م2
</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0.47 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيبس</td>
			<td>11.92 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناوه</td>
			<td>0.8 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاف</td>
			<td>تعبئة حتى 1000 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الأسهم الذوبان لتثبيط المناعة</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">أسهم DAPI</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>2 ملغم/مل في الميثانول</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">حلول الأسهم لللطخات الغربية</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEPES العازلة (100 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>0.88 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>400 متر EGTA</td>
			<td>0.25 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>هيبس</td>
			<td>0.24 غرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M ناوه</td>
			<td>ضبط درجة الحموضة إلى 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاف</td>
			<td>تعبئة حتى 500 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">كوكتيل مثبطات البروتيز</td>
		</tr>
<tr>
<td>مصغرة كاملة</td>
			<td>1 قرص</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاف</td>
			<td>0.4 مل</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - الجداول وصف حلول المخزون. حافظ على حلول المخزون عند 4 درجة مئوية. Aliquot مثبطات البروتيز كوكتيل للتخزين في -20 درجة مئوية.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">حلول لخلايا القلب متساوية الالتهاز</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB (200 مل)</td>
		</tr><tr><td>10X CIB</td>
			<td>20 مل</td>
		</tr><tr><td>محلول الأنسولين</td>
			<td>0.01 مل</td>
		</tr><tr><td>الجلوكوز</td>
			<td>0.79 غرام</td>
		</tr><tr><td>1M ناوه</td>
			<td>درجة الحموضة ضبط إلى 7.4</td>
		</tr><tr><td>جاف</td>
			<td>تعبئة حتى 200 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">محلول مزيج الإنزيم (30 مل)</td>
		</tr><tr><td>كولاجيناز type2</td>
			<td>30 ملغ</td>
		</tr><tr><td>تريبسين</td>
			<td>1.8 ملغ</td>
		</tr><tr><td>بروتياز</td>
			<td>1.8 ملغ</td>
		</tr><tr><td>100 mM CaCl2 حل الأسهم</td>
			<td>0.09 مل</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>30 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-Ca2+- BSA (15 مل)</td>
		</tr><tr><td>جيش صرب البوسنه</td>
			<td>30 ملغ</td>
		</tr><tr><td>100 mM CaCl2 حل الأسهم</td>
			<td>0.18 مل</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>15 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-EGTA (150 مل)</td>
		</tr><tr><td>400 mM EGTA الأسهم الحل</td>
			<td>0.150 مل</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>150 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حل التيرود (1000 مل)</td>
		</tr><tr><td>10X تايرود الأسهم الحل</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td>الجلوكوز</td>
			<td>0.99 غرام</td>
		</tr><tr><td>1M كاتال2
</td>
			<td>1.8 مل</td>
		</tr><tr><td>1M ناوه</td>
			<td>درجة الحموضة ضبط إلى 7.4</td>
		</tr><tr><td>جاف</td>
			<td>تعبئة حتى 1000 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">محلول إعادة إعادة الإنفاق الخلوي (15 مل)</td>
		</tr><tr><td>جيش صرب البوسنه</td>
			<td>30 ملغ</td>
		</tr><tr><td>50X المضادات الحيوية الأسهم الحل</td>
			<td>0.3 مل</td>
		</tr><tr><td>حل تايرود</td>
			<td>15 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حلول لتثبيط المناعة</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حل معتنق للخلية (0.3 مل)</td>
		</tr><tr><td>خلية تاك</td>
			<td>0.01 مل</td>
		</tr><tr><td>0.1 م ناهكو3 (pH8.0)</td>
			<td>0.285 مل</td>
		</tr><tr><td>0.1 م ناوه</td>
			<td>0.005 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حظر-permeabilizatin الحل (10 مل)</td>
		</tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr><tr><td>تريتون X-100</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr><tr><td>10X برنامج تلفزيوني</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr><tr><td>جاف</td>
			<td>7 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">K+ حل ماصة الغنية</td>
		</tr><tr><td>أسبارتات البوتاسيوم</td>
			<td>70 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>KCl</td>
			<td>50 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4
</td>
			<td>10 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>مغسو4
</td>
			<td>1 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>ملح دي الصوديوم ATP</td>
			<td>3 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>GTP ملح الليثيوم</td>
			<td>0.1 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>5 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>هيبس</td>
			<td>5 مليون متر</td>
		</tr><tr><td>كوه</td>
			<td>درجة الحموضة ضبط إلى 7.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حلول لللطخات الغربية</td>
		</tr><tr><td colspan="2">تحلل العازلة (1 مل)</td>
		</tr><tr><td>عازل HEPES</td>
			<td>0.86 مل</td>
		</tr><tr><td>نونيدت-P40</td>
			<td>0.1 مل</td>
		</tr><tr><td>كوكتيل مثبطات البروتيز</td>
			<td>0.04 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">المخزن المؤقت Runnning (1000 مل)</td>
		</tr><tr><td>10X TG (0.25 متر تريس و 1.92 M غليسين)</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td>الحزب الديمقراطي الصربي</td>
			<td>1 غرام</td>
		</tr><tr><td>جاف</td>
			<td>900 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">نقل المخزن المؤقت (1000 مل)</td>
		</tr><tr><td>10X TG</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td>ميثانول</td>
			<td>200 مل</td>
		</tr><tr><td>جاف</td>
			<td>700 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">المخزن المؤقت النشاف (TBST) (1000 مل)</td>
		</tr><tr><td>5M ناكل</td>
			<td>20 مل</td>
		</tr><tr><td>2M تريس-HCl (رقم الحموضة 7.5)</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr><tr><td>10٪ توين 20</td>
			<td>10 مل</td>
		</tr><tr><td>جاف</td>
			<td>965 مل</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2 - الأرباح وصف حلول العمل لعزل خلايا القلب، و المناعة و النشاف الغربي. إعداد جميع حلول العمل قبل التجارب مباشرة.
الشكل التكميلي 1 - الأرقام التكميلية 1- الأرقام التكميلية 1 مخطط تفصيلي لعزل الخلية. رسم بياني تدفق لعزل الخلايا العضلية البطينية والأبطية والخلايا الليفية القلبية من قلب واحد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/SupplementaryFig1R.pdf" target="_blank">يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

طورنا طريقة simple لعزل خلايا قلب الفأر الفردية عالية الجودة عن طريق تقنية التشويش المسبق. هذه الطريقة خالية من Langendorff ومفيدة لعزل الخلايا العضلية البطينية والأبطية أو الخلايا الخلالية ، مثل الخلايا الليفية القلبية أو السلف.

طريقة ال perfusion أنتيغراد لعزل القلب من الفئران

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

طورنا طريقة بسيطة خالية من Langendorff لعزل خلايا قلب الماوس الفردية عن طريق تقنية التعبئة والتغليف antegrade. تسمح هذه الطريقة بعزل خلايا القلب من الفئران الصغيرة إلى الأكبر سنا. وقد اعتبر التغلغل الرجعية المستندة إلى Langendorff كمعيار ذهبي لعزل الخلايا العضلية القلبية في مختلف الحيوانات التجريبية.ومع ذلك ، فإن علبة LTA صعبة تقنيا في الفئران بسبب صغر حجمها. لحصاد قلب الفأر، بعد تأكيد القتل الرحيم وحلق البطن، افتح تجويف الصدر بسرعة لفضح القلب واستخدام ماصة نقل البلاستيك مع قطع طرف إلى ما يقرب من حجم القلب لامتصاص القلب في ماصة. رفع ماصة لخلق مساحة كافية لإدراج مقص المنحني واستخدام مقص لاستئصال القلب من الجانب الظهري مع الحرص على تجنب إتلاف الأذينين.على الفور، ضع القلب في كوب زجاجي 30 ملليلتر يحتوي على الجليد البارد CIB-EGTA لمدة دقيقة واحدة تقريبا. عندما تتوقف الانقباضات، ضع القلب في طبق ثقافة 35 ملليلتر يحتوي على الجليد البارد CIB-EGTA، وإزالة الرئة والأنسجة المرئية الأخرى. ضع القلب النظيف تقريبا على حامل قلب مليء بجانب قمة CIB-EGTA المبردة إلى الأسفل ووضع الحامل تحت مجهر مجسم.إزالة الدهون والأنسجة الضامة من جميع أنحاء الشريان الأورطي. إذا كان طول الشريان الأورطي قطع طويلة جدا، تقليم الشريان الأورطي فقط تحت الشريان العضدي وتوجيه القلب بحيث السطح الأمامي تواجه إلى الأمام. استخدام ملاقط لرفع نهاية الشريان الأورطي واستخدام المشبك الأوعية الدموية الصغيرة لمشبك الشريان الأورطي بالقرب من الأذينين في حين دفع بلطف إلى أسفل على الأذين.ثم ضع القلب المشدد على طبق من التشوه مع الجانب الأمامي الذي يواجه القلب وترطيبه ببضع قطرات من CIB-EGTA. للتشويش المسبق، قم بتحميل حقنة 20 ملليلتر تحتوي على CIB-EGTA مسبقة الحرب متصلة بأنبوب تمديد مرن وإبرة حقن ملحوظة على مضخة التسريب وابدأ المضخة بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة. عندما يتم ملء الإبرة والمضخة، ضع إبرة الحقن على لوحة النفخ مع الجانب الأقصر من الشكل القطري في الأمام وحرك الإبرة حتى تلمس قمة القلب فقط.أدخل الإبرة بعناية بالقرب من قمة البطين الأيسر في الغرفة البطينية دون التواء الإبرة أو فصلها عن اللوحة، ومشاهدة العلامة لتقدير عمق إدخال الإبرة. عند اكتمال إدخال الإبرة، يجب أن يبدأ الدم في التدفق من الشريان التاجي. استخدام الشريط لإصلاح إبرة الحقن إلى لوحة وزيادة سرعة المضخة إلى ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة.إذا كان القلب هو perfused بنجاح ، وتدفق العازلة في الشعرية ينبغي أن تكون مرئية فقط تحت epicardium. بعد 2-3 ملليلتر من تغلغل CIB-EGTA ، استبدل حاجز التشوه بمزيج إنزيم. بعد أن يتم تغلغل 1-2 ملليلتر، قم بزيادة سرعة المضخة إلى 1.5 ملليلتر في الدقيقة.استخدام ماصة لإزالة البيرفوسات المتراكمة التي تحتوي على الدم المتدفقة من القلب حسب الضرورة ووقف التغلغل عندما يصل الحجم الإجمالي للأنزيم المتغلغل إلى 10 ملليلتر. في نهاية التشوه، نقل 10 ملليلتر من مزيج الانزيم من الحقنة إلى طبق ثقافة 60 ملليمتر على حصيرة سخان وإضافة 20 ملليغرام من BSA إلى الطبق. دوامة بلطف الطبق لإذابة مسحوق وإزالة إبرة الحقن والمشبك من القلب.إزالة البطينين والأدريا من القلب ووضع الأنسجة في مزيج الانزيم المكملة ب BSA. لعزل الخلايا الن البطينية، استخدم زوجين من الملاقط لفهم البيكارديوم وسحب البطينين برفق إلى قطع صغيرة. عندما يتم إنشاء جميع شظايا البطين، تفريق الخلايا حوالي 30 مرة مع pipetting لطيف وتصفية الحطام غير المهضوم من خلال مصفاة خلية شبكة 100 ميكرون في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.بعد الطرد المركزي، وإعادة إنفاق بيليه عضلة القلب في CIB prewarmed تكملها الكالسيوم وBSA واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وإعادة إنفاق خلايا القلب عجلت في حجم مناسب من محلول إعادة إيقاف الخلية لصيانتها في 37 درجة مئوية حتى تحليل المصب. لعزل الخلايا العضلية الأذينية، نقل الأذين إلى وعاء من CIB قبل الحرب تستكمل مع الكالسيوم وBSA وتمزيق الأذينين إلى قطع كما هو موضح.استخدام ماصة 20 ميكرولتر تعيين إلى 10 ميكرولتر لتعطيل الأنسجة عن طريق الأنابيب وجمع الخلايا المفككة عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة إنفاق الخلية الأذينية في حجم مناسب من محلول إعادة الإنفاق الخلية. في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة الخلايا العضلية البطينية المعزولة حديثا.يؤدي إجراء العزل هذا إلى إنتاجية تتراوح بين 70 و80٪ من الخلايا البطينية البطينية على شكل قضيب من الفئران التي يتراوح عمرها بين ثمانية أسابيع و10 أسابيع في غضون خمس ساعات تقريبا من العزلة. نسبة الخلايا القابلة للحياة المعزولة حديثا أقل في الفئران التي يزيد عمرها عن عامين. إمكانات العمل المسجلة في الخلايا العضلية البطينية والبطينية مماثلة لتلك التي تقاس في الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال الطريقة القائمة على Langendorff.يمكن استخدام تحليل المناعة لتقييم تنظيم الهيكل الساركوميري للخلايا العضلية البطينية وتحويل الخلايا الليفية القلبية إلى الخلايا الليفية العضلية بعد الثقافة الفرعية. يوصى بتحليل البقع الغربية لتحديد التعبير المحدد للبروتينات ذات الاهتمام في الأذينين والبطينين بعد المعالجة. بعد التخثر مع الانزيمات، يمكن تجانس البروتينات من الأذينين والبطينين بسهولة في عازلة التحلل مع قوة الضوء لاستخراج البروتين.من المهم التحكم في اتجاه وأعماق إدخال الإبرة. عند إدخال الإبرة في البطين الأيسر، يجب الحرص على عدم اختراق الحاجز البطيني أو اختراق الصمام. يمكنك تغيير تكوين perfusate اعتمادا على الغرض من التجربة.على سبيل المثال، يمكن استخدام المنظفات المكملة EGTA لجعل سقالة خالية من الخلايا من القلب.

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

طريقة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي من الصنوبر Loblolly ( P. taeda L.) والأنواع الأخرى الصنوبرية

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

أسلوب Alternant لنموذج ناسا التقليدية تفريغ Hindlimb في الفئران

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

عزل الخلايا الليفية بوابة الجرذ من قبل<em&gt; في الموقع</em&gt; الكبد الإرواء

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

الجاذبة الإرواء كطريقة لتصور الأوعية الدموية في<em&gt; أمبيستوما ميكسيكانوم</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

عزل النوى عن الأنسجة الكاملة باستخدام المنظفات وطريقة خالية من الانزيم

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...