Name: an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice
Uploaded: 2021-05-19T13:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

המחברים מודים לטי ימאמוטו וליורי על עזרתם בניסויים המורפוגליים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק בסיוע למחקר מדעי (C) מהחברה היפנית לקידום המדע (18K06871 ל M.O.K. ו 17K08536 ל H.M.).

<ol>
	<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+&#252;berlebenden+S&#228;ugethierherzen.">Untersuchungen am &#252;berlebenden S&#228;ugethierherzen.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Joshi-Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+plasticity+in+long-term+cultures+of+adult+ventricular+myocytes.">Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).</li><li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells.">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li><li>Zhou, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes:+methods+for+cellular+genetic+physiology.">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+sustained+K++current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle.">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> Journal of Physiology. 504, 557-563 (1997).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Sambrano, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+signalling+network+in+mouse+cardiac+myocytes.">Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.</a> Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cardiac+fibroblasts+in+post-myocardial+heart+tissue+repair.">The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair.</a> Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+self-beating+cardiomyocytes+in+adult+mouse+ventricles.">A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).</li><li>Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+TRPC3+increases+apoptosis+but+not+necrosis+in+response+to+ischemia-reperfusion+in+adult+mouse+cardiomyocytes.">Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+and+functional+role+of+the+rapidly+activating+delayed+rectifier+K(+)+current+in+left+and+right+atria+of+adult+mice.">Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice.</a> European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).</li><li>Milgroom, A., Ralston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+skeletal+muscle+with+CLARITY+for+light+microscopy+imaging.">Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging.</a> Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאז הלב רגיש מאוד איסכמיה, הזמן לקח כדי excise את הלב לטבול אותו CIB-EGTA קר כקרח כדי לעצור התכווצות צריך להישמר קצר ככל האפשר (<1 דקות). זהו השלב הקריטי הראשון בשיטה זו. הצעד הקריטי השני נוגע לכיוון הלב. האוריינטציה המסוימת של הלב שנכרת בשלב 2.1.2 מקלה על הצפייה וההסרה של רקמות השומן והחיבור סביב העורקים. לאחר ניקוי סביב העורקים, מניחים את הלב מהודק עם צד משטח לפנים על צלחת זלוף. השלב הקריטי האחרון כרוך החדרת מחט ההזרקה. בעת קידום המחט לכיוון הלב, מחט ההזרקה לא צריכה להיות מנותקת מצלחת הזלוף על מנת לשמור על מרחק קבוע מהצלחת. מיקום ההכנסה קרוב לשיא החדר השמאלי. הכנס את המחט בזהירות מבלי לסובב, שכן פיתול כזה עשוי להגדיל את החור. ניתן להעריך את עומק החדרת המחט על ידי צפייה בסימן האדום. אם המחט מוכנסת עמוק מדי, הקצה עשוי לנקב דרך מחיצת החדר ולהיכנס לחדר הימני או אם כי השסתום המיטרלי ולהיכנס לאטריום השמאלי. לאחר אישור היעלמות הדם מהקורק הכלילי, יש לתקן את המחט עם סרט הדבקה ללוחית הזלוף.
אורך ארוך יותר של העורקים מקשה על הידק של העורקים בתנוחה הנכונה. אם המהדק רחוק מדי מן האטריה, הלב עשוי להסתובב לאחר עירוי זלוף. כדי למנוע זאת, לחתוך את העורקים רק מתחת לעורק brachiocephalic כדי לקצר את כאבי העורקים לפני ההידוק.
אם הדם לא מתחיל לפרוק לאחר זלוף במהירות ראשונית של 0.5 מ"ל / דקה, להגדיל את המהירות ל 1 מ"ל / דקה. אם זה לא עוזר, מחט ההזרקה עשויה להיות ממוקמת באופן שגוי, כגון בחדר הימני, מחיצה חדרית או קיר שריר הלב השמאלי. במקרה כזה, להסיר את המחט מיד ולנסות להכניס אותו מחדש ליד השיא של החדר השמאלי. בעת החדרת המחט מספר פעמים, תאים מתעכלים עשויים לזרום החוצה מן החורים שנפתחו. שים לב כי זה בדרך כלל לא משפיע ברצינות על בידוד התא.
המפעילים יכולים לפקח על כל התהליך של זלוף antegrade של הלב באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי לבחון את השינויים בצבע ושקיפות והפעלה מחדש של מכות האטריה יחד עם העיכול. סך של 10 מ"ל של תערובת אנזימים צריך להיות המקסימום הנדרש, אפילו עבור לב ישן. בלבבות צעירים יותר (5-7 שבועות), אנו מפחיתים את הנפח ל 9 מ"ל, אשר דומה לגישה באמצעות זלוף מדרדר עם אותו תערובת אנזימים.
supernatant בצנטריפוגה הסופית מכיל פסולת, תאי דם, ולא מיוציטים ואילו, גלולה מכיל בעיקר cardiomyocytes וזיהום שאינם מיוציטים, כגון fibroblasts ותאי אנדותל. כדי לטהר את הקרדיומיוציטים, יש צורך בצעדים נוספים. באופן כללי, גלולה צריך להיות resuspended במדיום תרבות התא המתאים preplated במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על צלחת תרבית תא רקמה, ולאחר מכן בעדינות להסיר את cardiomyocytes על ידי pipetting ו preplating לתרבות.
תערובת האנזימים מכילה ריכוז נמוך של Ca2+ (0.3 מ"מ). לכן אנו דגירה תאים מתעכלים CIB-Ca2 +-BSA (1.2 mM Ca2+) לפני ההשעיה הסופית עם פתרון ההשעיה מחדש של התא (1.8 mM Ca2+), ואת הגידול ההדרגתי Ca2+ נמנע גרימת נזק לתא7. כל עוד הקרדיומיוציטים המבודדים שלמים (תאים רגיעה ללא התכווצות) הליך התאמה זה של Ca2+אינו משפיע על הכדאיות של התאים בעכברים. כמו התאים הפגועים מתים במהלך דגירה זו, אנו מקבלים כתוצאה מכך קבוצת תאים בריאה. באופן דומה, מיוציטים פרוזדוריים שלמים מבודדים (תאים רגיעה ללא התכווצות לא סדירה) ניתן לאחסן באותו פתרון ההשעיה מחדש של התא. עם זאת, myocytes הפרוזדורי נוטים להיות עדינים יותר כדי להיות מאוחסן להשוות את myocytes חדרית.
במעבדה, שיטת בידוד זו היא כמעט תמיד מוצלחת אלא אם כן החדרת המחט לחדר השמאלי נכשלת. הצלחנו גם לבודד תאים מהלב hypertrophied שהוכן על ידי התכווצות אבי העורקים רוחבית כירורגית. עם זאת, בעכברים מיושנים, שלעתים קרובות יש להם אוטם שריר לב קטן, הזלוף נפסק במקומות מסוימים, וכתוצאה מכך עיכול לא שלם ובכך תשואה נמוכה (איור 1C), בדומה לשיטת הנסיגה המבוססת על לנגנדורף. במקרים כאלה, ניתן לראות את הצורה המעוותת של הלב גם בתחילת הזחילה.
שיטת זלוף antegrade זו שימושית לבידוד תאי לב מעכברים בגילאים שונים אך לא מבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות ושפני ניסיונות. ייתכן שניתן יהיה ליישם שיטה זו על חולדות יילודים או נוער לפני התיישנות.
אחד היתרונות של שיטת זלוף antegrade זה הוא שזה מקטין את המכשולים הטכניים הקשורים באמצעות שיטת זלוף מדרדר מבוסס Langendorff עבור לבבות עכבר קטנים. הזמן הנדרש עבור זלוף הוא כ 7 דקות עם 10 מ"ל של האנזימים, תקופת עיכול קצרה זו מגבירה את הכדאיות של התאים. בנוסף, הוא מאפשר זלוף להתבצע באמצעות זרימת הדם הכלילית של הלב, גם לאחר שסתומי אבי העורקים כבר מתעכל. בידוד של מיוציטים פרוזדוריים בדרך כלל דורש זלוף מדרדר מבוסס Langendorff ודגרת נוספת עםאנזימים 17. גישה זו זלוף antegrade, עם זאת, יכול להחדיר עמוק את הרקמה עם האנזים כדי לבודד מיוציטים פרוזדוריים.
בניסויים באמצעות עכברים מרובים, יש לנקות את מנגנון לנגנדורף לפני שהוא מחלחל ללב הבא. עם זאת, בשיטת antegrade הנוכחית, כל עוד המספר הרצוי של ערכות מכשירים (למשל, מחטי מזרקים וצלחות זלוף) מוכנים מראש, זלוף יכול להתבצע ברציפות.
אנו מדווחים בזאת על המתודולוגיה הבסיסית של זלוף אנגרד של לב העכבר באמצעות אותם פתרונות כמו שיטת זלוף מדרדר מבוסס לנגנדורף ללא כימיקלים נוספים. ההרכב של perfusate ניתן לשנות כדי להתאים את מטרת הניסוי, כגון שימוש בחומר ניקוי המכיל EGTA במקום האנזימים כדי להפוך לב decellularized18.

בדרך כלל, הצעד הראשון של בידוד תא יחיד של רקמה מנותחת כרוך טחון הרקמה לחתיכות קטנות, ואחריו העיכול של רקמת החיבור מטריצה חוץ תאית עם אנזימים. עם זאת, לא ניתן לבודד קרדיומיוציטים בשיטת חיתוך כזו, שכן העשרה ברכיבי מטריצה חוץ-תאית, כולל סיבי קולגן ואלסטין, הופכת את שריר הלב לקשה מדי לטחון, והקרדיומיוציטים רגישים מאוד להיפוקסיה ולשינויים אחרים במיקרו-וירוס. לכן, באמצעות מערכת זלוף מדרדר מבוסס Langendorff1, שיטה לעיכול המטריצה חוץ תאית עם אנזימים פותחה כדי לבודד קרדיומיוציטים בודדים מהלב2,3,4.
בדגמי עכבר, זלוף מדרדר מבוסס Langendorff של הלב עם אנזימים משמש גם לבידוד של קרדיומיוציטים בודדים5,6,7,8. עם זאת, הכנרת של סיומת העכבר הקטנה והדקה וההרכבה שלה על מנגנון לנגנדורף לביצוע זלוף מדרדר דורשת רמה גבוהה של מיומנות, שכן קוטר העורקים בלב הבוגר הוא כ -1.2 מ"מ. יתר על כן, זה לוקח זמן לבצע ניסויים מרובים כמו מנגנון Langendorff יש לנקות לפני זלוף הלב הבא.
כחלופה זלוף מדרדר, שיטה חדשנית לבידוד cardiomyocytes מלב עכבר בוגר ללא מנגנון Langendorff פותחה. שיטה זו לייצור עידן התבססה על זלוף אנגרד של העורקים הכליליים9. לאחרונה שיפרנו כל שלב בפרוטוקול antegrade זה, כגון הידוק של העורקים, החדרת מחט ובקרת טמפרטורה, וניטרנו את כל הליכי הזלוף במיקרוסקופ10. אנו מדווחים בפירוט על עידון שיטת זלוף זו כדי לקצר את זמן הבידוד ולספק סרטון משלים. בשיטה זו, זלוף הלב לוקח בערך 7 דקות עם 10 מ"ל של האנזימים, ותקופת עיכול קצרה זו מגבירה את הכדאיות של התאים. זוהי שיטה פשוטה לבודד תאי לב בודדים באיכות גבוהה ללא צורך בתוספת של כימיקלים, כגון 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 או טאורין5,8. אנו מאמינים כי שיטה זו תוריד את סף המיומנות של הטכניקה ולשפר את התועלת של קרדיומיוציטים העכבר במחקר בסיסי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-actinin (ACTN)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>AB5490-I</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, USA</td>
			<td>2118</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle actin (SMA)</td>
			<td>Dako, Denmark</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Amersham, GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA934</td>
			<td>Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Biological material for adhesion of the cell or tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One Super&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>02230-14</td>
			<td>Chemiluminescent reagent used for western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 2</td>
			<td>Worthington Biochemicals, USA</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche, Germany</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>A mixture of several protease inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;6&#39;diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>11034-56</td>
			<td>Used for cell-impermeant nuclear stainig&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>including 4.5 g/L gluose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>X1-50</td>
			<td>Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC-8 patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Lab., Japan</td>
			<td></td>
			<td>outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP lithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal microelectrode puller&#160;</td>
			<td>Germany)</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Natsume Seisakusho, Japan</td>
			<td>KN-475-3-40</td>
			<td>Equipment to warm the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>TE-311</td>
			<td>Infusion syringe pump for antegrade perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injeciton needle (27 gauge)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>Needle for insertion into the left ventricle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (from bovine pancrease)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I5500</td>
			<td>Dissolve in 0.1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cordless grinder</td>
			<td>Funakoshi, Japan</td>
			<td>cG-4A</td>
			<td>Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09154-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G potassium</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26239-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26807-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>27575-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic multi-well culture plate</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>353226</td>
			<td>Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (20 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td>Use for infusion of CIB-EGTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (30 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-30ES</td>
			<td>Use for infusion of Enzyme-mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P5147</td>
			<td>A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Sample buffer solution</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>198-13282</td>
			<td>Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS polyacrylamide gel&#160; (15%)</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>193-14991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>32237-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09422-81</td>
			<td>Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T8003</td>
			<td>Trypsin from bovine Type 1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular clamp</td>
			<td>Karl Hammacher GmbH, Germany</td>
			<td>HSE 004-35</td>
			<td>Small straight vascular clamp used for clamping aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other reagents</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice

במחקר בסיסי באמצעות לב העכבר, בידוד קרדיומיוציטים בודדים קיימא הוא צעד טכני חיוני להתגבר. באופן מסורתי, בידוד קרדיומיוציטים מארנבים, שרקנים או חולדות בוצע באמצעות זלוף מדרדר של הלב עם אנזימים באמצעות מנגנון Langendorff. עם זאת, רמה גבוהה של מיומנות נדרשת כאשר שיטה זו משמשת עם לב עכבר קטן. שיטת זלוף antegrade שאינו משתמש במנגנדורף מנגנון דווח לאחרונה לבידוד של קרדיומיוציטים העכבר. אנו מדווחים בזאת פרוטוקול מלא עבור זלוף antegrade משופר של הלב שנכרת כדי לבודד תאי לב בודדים מעכברים בוגרים (8 - 108 שבועות). זלוף Antegrade מבוצע על ידי הזרקת perfusate ליד השיא של החדר השמאלי של הלב שנכרת, שאב העורקים של אשר היה מהודק, באמצעות משאבת עירוי. כל ההליכים מתבצעים על מחצלת תנור מחוממת מראש תחת מיקרוסקופ, המאפשרת ניטור של תהליכי ההזרקה והזלוף. התוצאות מראות כי מיוציטים חדריים ואקבריים, ופיברובלסטים יכולים להיות מבודדים היטב מעכבר בוגר יחיד בו זמנית.

העיקרון של שיטה זו הוא פשוט: perfusate זורם מן התא השמאלי, שסתום אבי העורקים נפתח, ואת perfusate פועל לתוך העורק הכלילי באותו כיוון כמו ריצת הדם, שכן אבי העורקים סגור על ידי הידוק, המאפשר זלוף עמוק של שריר הלב על מנת לעכל את המטריצה החוץ תאית.
מיוציטים חדריים מבודדים זה עתה בשיטה הנוכחית מוצגים באיור 1A. איור 1B מציג תמונות מוגדלות של מיוציטים חדריים ופטריים. הליך בידוד זה הביא לתשואה גבוהה (70%-80%) של מיוציטים חדריים רגיעה בצורת מוט מעכברים בוגרים (8-10 שבועות), שהיו זמינים בתוך כ 5 שעות לאחר הבידוד (איור 1C), מרווח דומה לזה בעת שימוש בהליך המסורתי מבוסס Langendorff7. עם זאת, היחס בין תאים בני קיימא שבודדו זה עתה היה נמוך יותר בעכברים בגילאי >2 שנים (איור 1C). המספר הכולל של מיוציטים חדריים שהושגו לכל לב בוגר באמצעות פרוטוקול זה היה כ 3 x 106 תאים, אשר היה דומה לערך שדווח בעבר7,12. פוטנציאל הפעולה שנרשם במיציטים החדריים והפרוצדורניים(איור 1D)היה דומה לזה של תאים שהושגו על ידי השיטה המבוססת על לנגנדורף10. ניתוח חיסוני אישר כי המבנה הסרקוומרי של מיוציטים חדריים היה מאורגן היטב עם קרום תא גלוי בבירור (איור 2A). הקרדיומיוציטים הבודדים המבודדים בשיטה זו יכולים לשמש ישירות בניסויים, כגון ניתוח אלקטרופיזיולוגי10 או ניסוי immunostaining.
פיברובלסטים לבביים קיימים בחללים ביניים. עיכול מספיק של המטריצה החוץ תאית גורם לבידוד של תאים אלה. פיברובלסטים לב מבודדים להתרבות בתנאי תרבות ניתן לעבור מספר פעמים או מאוחסן חנקן נוזלי בתמיסת מאגר התא המתאים. איור 2B מראה כי רוב פיברובלסטים לב תרבותיים הפכו myofibroblasts במהלך תת תרבות, כפי שאושר על ידי ביטוי מוגבר של α חלקה שריר actin13,14. כמו כן, אבות הלב יכולים להיות מבודדים עם השיטה הנוכחית ותרבית במדיום התרבות המתאים, אשר מתחילים להכות באופן אוטומטי10,15.
הומוגניזציה של שריר הלב חזק לא קל, במיוחד עבור רקמת לב מעכברים בגילאי, אשר בעל כמות גדולה של סיבים חוץ תאיים. לאחר זלוף אנגרד, חלבון מן האטריה החדרים ניתן הומוגנית בקלות במאגר התמוגה עם כוח אור כדי לחלץ חלבונים. ניתוח כתמים מערבי הדגים את הביטוי הספציפי של ANP באטריה אך לא בחדרים מעכברים בוגרים (בני 20 שבועות) ומבוגרים (בני 108 שבועות)(איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig1.jpg"> איור 1. קרדיומיוציטים מבודדים מעכברים. א. מיוציטים חדריים מבודדים זה עתה עם זלוף אנגרד, עם תמונות שנרכשו בהגדלה נמוכה. לאחר הכביסה הסופית, הקרדיומיוציטים נוצלו מחדש עם 2 מ"ל של פתרון ההשעיה מחדש של התא, 100 μL מתוכם הושלכו על צלחת התרבות בתחתית הזכוכית ויישוב התא חיכה. בר, 100 מיקרומטר.B. תמונות מוגדלות של מיוציטים חדריים מבודדים (עליון) ומיוציטים פרך (למטה). בר, 100 מיקרומטר.C. תאים מבודדים הושעו בתמיסת ההשעיה מחדש של התא ואחסנו ב 37 מעלות צלזיוס לתקופה הרצויה, ומספר מיוציטים חדריים חיים נספר ב 10-15 שדות תחת מיקרוסקופ. תאים מעוגלים נחשבו לפצועים או מתיםבאופן בלתיהפיך 16 . סמלים ירוקים, כחולים ואדומים התקבלו מ-3 עכברים בגיל 8-10 שבועות, וסמלים שחורים היו מעכבר בן 106 שבועות. סימן צהוב מציין את הממוצע של כל קבוצה. ד. פוטנציאל פעולה מייצג שנרשם ממיוציטים חדריים (שחורים) ופסוליים (אדומים) של 8-10 עכברים. הנתונים התקבלו מהתאים כ 3 שעות לאחר הבידוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig2.jpg"> איור 2. חיסון עבור α-actinin ב myocytes חדרי עכבר מבודדים α חלקה שרירים actin פיברובלסטים לב עכבר בתרבית. א. מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית של אימונוסטיין עבור α-אקטין (ירוק), כתמי DAPI עבור גרעינים (כחול) ותמונת DIC של מיוציטים חדריים מבודדים מלב העכבר עם זלוף אנגרד. בר, 50 מיקרומטר.B. Immunostaining עבור α חלקה שריר actin (ירוק), כתמי DAPI עבור גרעינים (כחול) ותמונה DIC של פיברובלסטים לב מבודדים מלב העכבר עם זלוף antegrade. פיברובלסטים לבביים היו תרבותיים במשך ארבעה ימים. בר, 100 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig2large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig3.jpg"> איור 3. ניתוחי כתמים מערביים של ANP באטריה ובחמלים. ניתוחי כתמים מערביים עבור פפטיד נטריורטיק סמן סמן פרך (ANP) ב atria (A) ו ventricles (V) מוכן ממבוגר (20 שבועות) ומעלה (108 שבועות) לבבות. ANP נוכח באטריה אך נעדר בחדרים. השתמש גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) כמו חלבון שליטה בית שמירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">פתרונות מלאי לבידוד תאי לב</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10X CIB (500 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>37.99 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCI</td>
			<td>2.01 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>2.5 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0.23 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (היפס)</td>
			<td>29.79 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>מילוי עד 500 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 מ"מ CaCl2 תפוגת מניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 </td>
			<td>100 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון מניית EGTA של 400 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>400 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון אינסולין</td>
		</tr>
<tr>
<td>אינסולין</td>
			<td>יחידה אחת/מ"ל ב- 0.1 M HCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">50X פתרון מלאי אנטיביוטיקה (20 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין</td>
			<td>100 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטרפטומיצין</td>
			<td>100 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>פנול אדום</td>
			<td>1.5 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>20 מ"ל וחיטוי באמצעות סינון</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון 10X Tyrode (1000 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>81.82 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>4.03 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0.47 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (היפס)</td>
			<td>11.92 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>נאוה</td>
			<td>0.8 גר'</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>מילוי עד 1000 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">סולוטין מלאי לחיסון</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מלאי DAPI</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>2 מ"ג/מ"ל במתנול</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרונות מלאי עבור כתמים מערביים</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר HEPES (100 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>0.88 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>400 מ"מ אגטה</td>
			<td>0.25 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (היפס)</td>
			<td>0.24 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M נאוה</td>
			<td>התאמת pH ל- 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>מילוי עד 500 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">קוקטייל מעכבי פרוטאז</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיני שלם</td>
			<td>טאבלט אחד</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>0.4 מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1. תיאור פתרונות המלאי. שמור על פתרונות מלאי ב 4 °C (69 °F). מעכבי פרוטאז Aliquot קוקטייל לאחסון ב -20 מעלות צלזיוס.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">פתרונות לבודד תאי לב</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB (200 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>10X CIB</td>
			<td>20 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פתרון אינסולין</td>
			<td>0.01 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>גלוקוז</td>
			<td>0.79 גרם</td>
		</tr><tr><td>1M נאוה</td>
			<td>התאמת pH ל- 7.4</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>מילוי עד 200 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">תמיסת תערובת אנזימים (30 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>סוג קולגנאז2</td>
			<td>30 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>טריפסין (נסיון)</td>
			<td>1.8 מ"ג (1.8 מ"ג)</td>
		</tr><tr><td>פרוטאז</td>
			<td>1.8 מ"ג (1.8 מ"ג)</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניות CaCl2 של 100 מ"מ</td>
			<td>0.09 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>30 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-Ca2+-BSA (15 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>30 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניות CaCl2 של 100 מ"מ</td>
			<td>0.18 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>15 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-אגטה (150 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניית EGTA של 400 מ"מ</td>
			<td>0.150 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>150 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון טיירוד (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניית טיירוד 10X</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>גלוקוז</td>
			<td>0.99 גרם</td>
		</tr><tr><td>1M CaCl2
</td>
			<td>1.8 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>1M נאוה</td>
			<td>התאמת pH ל- 7.4</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>מילוי עד 1000 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון שימוש חוזר בתאים (15 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>30 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>פתרון מלאי אנטיביוטיקה 50X</td>
			<td>0.3 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פתרון טיירוד</td>
			<td>15 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרונות לחיסון</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון דבק תא (0.3 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>תא-טאק</td>
			<td>0.01 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>0.1 M נהקו3 (עמ' 8.0)</td>
			<td>0.285 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>0.1 מ' נאוה</td>
			<td>0.005 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון חסימה-פרמביליזטין (10 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>סרום שור עוברי</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>טריטון X-100</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פי 10 PBS</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>7 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">K+ פתרון פיפטה עשיר</td>
		</tr><tr><td>אשלגן אספרטט</td>
			<td>70 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>KCl</td>
			<td>50 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4
</td>
			<td>10 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>MgSO4
</td>
			<td>1 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>מלח דיסודיום ATP</td>
			<td>3 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>מלח ליתיום GTP</td>
			<td>0.1 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>5 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>היפס (היפס)</td>
			<td>5 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>קו ה- KOH</td>
			<td>ה-pH מותאם ל-7.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרונות כתמים מערביים</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר תמוגה (1 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>מאגר HEPES</td>
			<td>0.86 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>לא אידיט-P40</td>
			<td>0.1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>קוקטייל מעכבי פרוטאז</td>
			<td>0.04 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר הפעלה (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>10X TG (0.25 מטר טריס ו-1.92 מ' גליצין)</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>SDS (SDS)</td>
			<td>1 גרם</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>900 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר העברה (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>10X TG</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>מתנול (רתנול)</td>
			<td>200 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>700 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר סופג (TBST) (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>5M NaCl</td>
			<td>20 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>2M טריס-HCl (עמ' 7.5)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>10% טווין 20</td>
			<td>10 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>965 מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>שולחן 2. תיאור פתרונות העבודה לבודד תאי לב, חיסונים וכתמים מערביים. הכינו את כל פתרונות העבודה ממש לפני הניסויים.
איור משלים 1. קו המתאר של בידוד התא. תרשים זרימה של בידוד מיוציטים חדריים ואסטריים ופיברובלסטים לב מלב אחד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/SupplementaryFig1R.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

פיתחנו שיטה פשוטה ללא לנגנדורף לבידוד תאי לב בודדים של העכבר בטכניקת אריזה. שיטה זו מאפשרת בידוד של תאי לב מעכברים צעירים ומבוגרים יותר. זלוף מדרדר המבוסס על לנגנדורף נחשב לסטנדרט זהב לבידוד מיוציטים לבביים בבעלי חיים ניסיוניים שונים.עם זאת, קנול של LTA הוא קשה מבחינה טכנית בעכברים בשל גודלם הקטן. עבור קציר לב העכבר, לאחר אישור המתת חסד וגילוח הבטן, לפתוח את חלל בית החזה במהירות כדי לחשוף את הלב ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך בערך את גודל הלב למצוץ את הלב לתוך פיפטה. הרם את הפיפט כדי ליצור מספיק מקום להכניס מספריים מעוגלים ולהשתמש במספריים כדי להוציא את הלב מהצד הגבי דואג כדי למנוע פגיעה atria.מיד, מניחים את הלב לתוך זכוכית 30 מיליליטר המכיל CIB-EGTA קר כקרח במשך כדקה אחת. כאשר הצירים נעצרו, מניחים את הלב בצלחת תרבות 35 מיליליטר המכיל CIB-EGTA קר כקרח, ולהסיר את הריאה ורקמות גלויות אחרות. מניחים את הלב המנוקה בגסות על דוכן לב מלא בצד CIB-EGTA קריר למטה ומניחים את המעמד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.הסר את השומן ואת רקמות החיבור מסביב לאבי העורקים. אם אורך העורקים החתוכים ארוך מדי, קיצצו את העורקים ממש מתחת לעורק הברכיוצפלי וכוונו את הלב כך שהמשטח הקדמי פונה קדימה. השתמש בפינצטה כדי להרים את קצה העורקים ולהשתמש מהדק כלי דם קטן כדי להדק את העורקים ליד אטריה תוך בעדינות דוחף למטה על אטריה.לאחר מכן מניחים את הלב מהודק על צלחת זלוף עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה לחות הלב עם כמה טיפות של CIB-EGTA. עבור זלוף antegrade, לטעון מזרק 20 מיליליטר המכיל CIB-EGTA מראש מחובר צינור הרחבה גמישה מחט הזרקה מסומן על משאבת עירוי ולהתחיל את המשאבה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. כאשר המחט והמשאבה מולאו, מניחים את מחט ההזרקה על צלחת הזלוף עם הצד הקצר יותר של הצורה האלכסונית מלפנים ומחליקים את המחט עד שהיא רק נוגעת בשיא הלב.בזהירות, להכניס את המחט ליד השיא של החדר השמאלי לתוך החדר מבלי לסובב או לנתק את המחט מהצלחת, צופה בסימן כדי להעריך את עומק החדרת המחט. כאשר החדרת המחט הושלמה, הדם צריך להתחיל לזרום מן העורק הכלילי. השתמש בסרט הדבקה כדי לתקן את מחט ההזרקה לצלחת ולהגדיל את מהירות המשאבה למיליליטר אחד לדקה.אם הלב חדור בהצלחה, זרימת החיץ נימי צריך להיות גלוי ממש מתחת לאפיקרדיום. לאחר 2-3 מיליליטר של זלוף CIB-EGTA, החלף את מאגר הזלוף בתמהיל אנזימים. לאחר מיליליטר אחד עד שני מיליליטר כבר perfused, להגדיל את מהירות המשאבה ל 1.5 מיליליטר לדקה.השתמש פיפטה כדי להסיר את זלוף המכיל דם שנצבר זורם מהלב לפי הצורך ולעצור את זלוף כאשר הנפח הכולל של אנזים perfused מגיע 10 מיליליטר. בסוף הזלוף, מעבירים 10 מיליליטר של תערובת אנזימים מהמזרק לצלחת תרבות של 60 מילימטר על מחצלת תנור ומוסיפים 20 מיליגרם BSA למנה. בעדינות מערבולת את המנה כדי להמיס את האבקה ולהסיר את מחט ההזרקה ואת מהדק מהלב.הסר את החדרים ואת atria מהלב ומניחים את הרקמות לתערובת אנזים BSA בתוספת. כדי לבודד את מיוציטים חדרית, להשתמש בשני זוגות פינצטה כדי לתפוס את epicardium בעדינות למשוך את החדרים לחתיכות קטנות. כאשר כל שברי החדר נוצרו, לפזר את התאים כ 30 פעמים עם צינור עדין לסנן את הפסולת מעוכל דרך מסננת 100 מיקרון רשת התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה cardiomyocyte ב CIB מראש הוסיף סידן ו- BSA ולהדגיר את התאים במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend קרדיומיוציטים מזרזים בנפח המתאים של פתרון ההשעיה התא לתחזוקתם ב 37 מעלות צלזיוס עד ניתוח במורד הזרם. כדי לבודד את מיוציטים פרוזדוריים, להעביר את atria למיכל של CIB מראש התחרה בתוספת סידן ו- BSA ולקרוע את האטריה לחתיכות כפי שהוכח.השתמש פיפטה 20 microliter להגדיר 10 microliters לשבש את הרקמות על ידי pipetting ולאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן התשען מחדש את התא התוך-מדינתי בנפח מתאים של פתרון שימוש חוזר בתאים. בתמונה זו, מיוציטים חדריים מבודדים טריים ניתן לראות.הליך בידוד זה גורם לתפוקה של 70 עד 80% של מיוצ'יטים חדריים רגיעה בצורת מוט משמונה עד עשרה שבועות עכברים בתוך כחמש שעות של בידוד. היחס בין תאים בני קיימא שבודדו זה עתה נמוך יותר בעכברים מעל גיל שנתיים. פוטנציאל הפעולה שנרשם במיציטים החדריים והפוריים דומה לאלה הנמדדים בתאים המתקבלים על ידי השיטה המבוססת על לנגנדורף.ניתוח immunostaining יכול לשמש כדי להעריך את הארגון של המבנה הסרקוומרי של מיוציטים חדריים ואת הטרנספורמציה של פיברובלסטים לב לתוך myofibroblasts לאחר תת תרבות. ניתוח כתם מערבי מומלץ לקבוע את הביטוי הספציפי של חלבונים של עניין אטריה החדרים לאחר העיבוד. לאחר זלוף עם אנזימים, חלבונים מן האטריה החדרים ניתן הומוגנית בקלות מאגר תמוגזה עם כוח אור עבור מיצוי חלבון.חשוב לשלוט בכיוון ובמעמקי החדרת המחט. בעת החדרת המחט לתוך החדר השמאלי, להיזהר לא לנקב את מחיצת החדר או לחדור את השסתום. אתה יכול לשנות את ההרכב של perfusate בהתאם למטרת הניסוי.לדוגמה, חומר ניקוי בתוספת EGTA יכול לשמש להכנת פיגום ללא תאים של הלב.

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים Conifer

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

שיטת Alternant את המודל המסורתי של נאס&quot;א פריקה Hindlimb ב עכברים

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...