Name: an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice
Uploaded: 2021-05-19T13:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

Авторы благодарят Т. Ямамото и Ю. Мори за помощь в морфологических экспериментах. Эта работа была поддержана грантом на научные исследования (C) от Японского общества содействия науке (18K06871 для M.O.K. и 17K08536 для H.M.).

<ol>
	<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+&#252;berlebenden+S&#228;ugethierherzen.">Untersuchungen am &#252;berlebenden S&#228;ugethierherzen.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Joshi-Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+plasticity+in+long-term+cultures+of+adult+ventricular+myocytes.">Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).</li><li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells.">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li><li>Zhou, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes:+methods+for+cellular+genetic+physiology.">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+sustained+K++current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle.">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> Journal of Physiology. 504, 557-563 (1997).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Sambrano, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+signalling+network+in+mouse+cardiac+myocytes.">Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.</a> Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cardiac+fibroblasts+in+post-myocardial+heart+tissue+repair.">The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair.</a> Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+self-beating+cardiomyocytes+in+adult+mouse+ventricles.">A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).</li><li>Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+TRPC3+increases+apoptosis+but+not+necrosis+in+response+to+ischemia-reperfusion+in+adult+mouse+cardiomyocytes.">Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+and+functional+role+of+the+rapidly+activating+delayed+rectifier+K(+)+current+in+left+and+right+atria+of+adult+mice.">Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice.</a> European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).</li><li>Milgroom, A., Ralston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+skeletal+muscle+with+CLARITY+for+light+microscopy+imaging.">Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging.</a> Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Поскольку сердце очень восприимчиво к ишемии, время, необходимое для иссечения сердца и погружения его в ледяной CIB-EGTA для остановки сокращения, должно быть как можно короче (<1 мин). Это первый критический шаг этого метода. Второй критический шаг касается направления сердца. Особая ориентация иссеченного сердца на этапе 2.1.2 облегчает просмотр и удаление жира и соединительных тканей вокруг аорты. После очистки вокруг аорты поместите зажатое сердце передней стороной поверхности вверх на перфузионную пластину. Последний критический этап включает в себя введение инъекционной иглы. При продвижении иглы к сердцу инъекционная игла не должна отделяться от перфузионной пластины, чтобы поддерживать постоянное расстояние от пластины. Положение вставки находится вблизи вершины левого желудочка. Вставляйте иглу осторожно, не скручивая, так как такое скручивание может увеличить отверстие. Глубину введения иглы можно оценить, наблюдая за красной меткой. Если игла вставлена слишком глубоко, наконечник может проткнуть желудочковую перегородку и войти в правый желудочек или через митральный клапан и войти в левое предсердие. После подтверждения исчезновения крови из коронарной артерии иглу следует закрепить скотчем к перфузионной пластине.
Более длинная длина аорты затрудняет зажим аорты в правильном положении. Если зажим находится слишком далеко от предсердий, сердце может вращаться после инфузии перфусата. Чтобы предотвратить это, отрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией, чтобы укоротить аорту перед зажатием.
Если кровь не начинает отступать после перфузии с начальной скоростью 0,5 мл/мин, увеличьте скорость до 1 мл/мин. Если это не помогает, инъекционная игла может быть расположена неправильно, например, в правом желудочке, перегородке желудочков или левой стенке миокарда. В таком случае немедленно извлеките иглу и попробуйте повторно вставить ее возле вершины левого желудочка. При введении иглы несколько раз переваренные клетки могут вытекать из открытых отверстий. Обратите внимание, что это обычно не оказывает серьезного влияния на изоляцию клеток.
Операторы могут контролировать весь процесс антеградной перфузии сердца с помощью стереоскопического микроскопа, чтобы наблюдать изменения цвета и прозрачности и перезапуск биения предсердий вместе с пищеварением. В общей сложности 10 мл ферментной смеси должны быть максимально необходимыми, даже для старого сердца. В молодых сердцах (5-7 недель) мы уменьшаем объем до 9 мл, что аналогично подходу через ретроградную перфузию с той же смесью ферментов.
Супернатант при конечной центрифугировании содержит мусор, клетки крови и немиоциты, тогда как гранула содержит в основном кардиомиоциты и загрязняющие немиоциты, такие как фибробласты и эндотелиальные клетки. Чтобы очистить кардиомиоциты, необходимо больше шагов. В общем, гранулу следует повторно суспендировали в соответствующей среде клеточного культивирования и предварительно наносили в течение 2 ч при 37°С на чашку для культуры клеток ткани, а затем осторожно удалять кардиомиоциты путем пипетирования и предварительного покрытия для культивирования.
Ферментная смесь содержит низкую концентрацию Ca2+ (0,3 мМ). Поэтому мы инкубируем переваренные клетки в CIB-Ca2+-BSA (1,2 мМ Ca2+)перед окончательным повторным суспензией раствором для повторного суспензии клеток (1,8 мМ Ca2+),и постепенное увеличение Ca2+ позволяет избежать повреждения клеток7. До тех пор, пока изолированные кардиомиоциты неповреждены (покоящиеся клетки без сокращения), эта процедура адаптации Ca2+не влияет на жизнеспособность клеток у мышей. Поскольку поврежденные клетки умирают во время этой инкубации, мы, следовательно, получаем здоровую группу клеток. Аналогичным образом, изолированные интактные предсердные миоциты (покоятся клетки без нерегулярного сокращения) могут храниться в том же растворе для ресуспензии клеток. Тем не менее, предсердные миоциты, как правило, более деликатны для хранения по сравнению с желудочковыми миоцитами.
В лаборатории этот метод изоляции почти всегда успешен, если только введение иглы в левый желудочек не дает сбоя. Нам также удалось изолировать клетки из гипертрофированного сердца, полученные хирургическим поперечным сужением аорты. Однако у пожилых мышей, у которых часто возникают небольшие инфаркты миокарда, перфузия прекращается в некоторых местах, что приводит к неполному пищеварению и, следовательно, низкому выходу(рисунок 1С),аналогично ретроградный метод на основе Лангендорфа. В таких случаях искаженная форма сердца может наблюдаться даже в начале перфузии.
Этот метод антеградной перфузии полезен для выделения клеток сердца у мышей разного возраста, но не от более крупных животных, таких как кролики и морские свинки. Возможно, удастся применить этот метод к неонатальным или молодым крысам перед отлучением от отлучения от детей.
Одним из преимуществ этого метода антеградной перфузии является то, что он уменьшает технические препятствия, связанные с использованием метода ретроградной перфузии на основе Лангендорфа для маленьких мышечных сердец. Время, необходимое для перфузии, составляет примерно 7 мин с 10 мл ферментов, этот короткий период пищеварения повышает жизнеспособность клеток. Кроме того, он позволяет проводить перфузию через коронарную циркуляцию сердца, даже после того, как аортальные клапаны были переварены. Выделение предсердных миоцитов обычно требует ретроградной перфузии на основе Лангендорфа и дальнейшей инкубации с ферментами17. Этот антеградный перфузионный подход, однако, может глубоко перфузить ткань ферментом для выделения предсердных миоцитов.
В экспериментах с использованием нескольких мышей аппарат Лангендорфа следует очистить перед перфузией следующего сердца. Однако в настоящем антеградном способе, если желаемое количество наборов инструментов (например, иглы для шприцев и перфузионных пластин) приготовлено заранее, перфузию можно выполнять непрерывно.
Здесь мы сообщаем основную методологию антеградной перфузии сердца мыши с использованием тех же растворов, что и метод ретроградной перфузии на основе Лангендорфа без дополнительных химических веществ. Состав перфусата может быть изменен в соответствии с целью эксперимента, например, с использованием моющего средства, содержащего EGTA, вместо ферментов для создания децеллюляризованного сердца18.

Как правило, первый этап выделения одноклеточной рассеченной ткани включает измельчение ткани на мелкие кусочки с последующим перевариванием соединительной ткани и внеклеточного матрикса ферментами. Однако кардиомиоциты нельзя выделить таким методом измельчения, так как обогащение компонентами внеклеточного матрикса, включая коллагеновые и эластиновые волокна, делает миокард слишком жестким для измельчения, а кардиомиоциты очень чувствительны к гипоксии и другим изменениям микросреды. Так, с помощью ретроградной перфузионной системы 1 наосновеЛангендорфа был разработан метод переваривания внеклеточного матрикса ферментами для выделения отдельных кардиомиоцитов из сердца2,3,4.
В мышиных моделях ретроградная перфузия сердца на основе Лангендорфа с ферментами также используется для выделения отдельных кардиомиоцитов5,6,7,8. Однако канюляция маленькой и тонкой мышиной аорты и ее установка на аппарат Лангендорфа для выполнения ретроградной перфузии требует высокой степени мастерства, так как диаметр аорты во взрослом сердце составляет примерно 1,2 мм. Кроме того, требуется время для выполнения нескольких экспериментов, так как аппарат Лангендорфа должен быть очищен перед перфузией следующего сердца.
В качестве альтернативы ретроградной перфузии был разработан новый метод выделения кардиомиоцитов из сердца взрослой мыши без аппарата Лангендорфа. Этот эпохальный метод был основан на антеградной перфузии коронарных артерий9. Недавно мы улучшили каждый шаг этого протокола антеграда, такой как зажим аорты, введение иглы и контроль температуры, и контролировали все процедуры перфузии с помощью микроскопа10. Здесь мы подробно сообщаем об усовершенствовании этого метода антеградной перфузии, чтобы сократить время изоляции и предоставить дополнительное видео. При этом методе перфузия сердца занимает примерно 7 мин с 10 мл ферментов, и этот короткий период пищеварения повышает жизнеспособность клеток. Это простой метод выделения одиночных клеток сердца при высоком качестве, не требуя добавления химических веществ, таких как 2,3-бутанедион моноксим(БДМ) 6,11 или таурин5,8. Мы считаем, что этот метод снизит порог мастерства методики и повысит полезность мышиных кардиомиоцитов в фундаментальных исследованиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-actinin (ACTN)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>AB5490-I</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, USA</td>
			<td>2118</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle actin (SMA)</td>
			<td>Dako, Denmark</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Amersham, GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA934</td>
			<td>Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Biological material for adhesion of the cell or tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One Super&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>02230-14</td>
			<td>Chemiluminescent reagent used for western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 2</td>
			<td>Worthington Biochemicals, USA</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche, Germany</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>A mixture of several protease inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;6&#39;diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>11034-56</td>
			<td>Used for cell-impermeant nuclear stainig&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>including 4.5 g/L gluose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>X1-50</td>
			<td>Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC-8 patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Lab., Japan</td>
			<td></td>
			<td>outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP lithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal microelectrode puller&#160;</td>
			<td>Germany)</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Natsume Seisakusho, Japan</td>
			<td>KN-475-3-40</td>
			<td>Equipment to warm the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>TE-311</td>
			<td>Infusion syringe pump for antegrade perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injeciton needle (27 gauge)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>Needle for insertion into the left ventricle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (from bovine pancrease)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I5500</td>
			<td>Dissolve in 0.1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cordless grinder</td>
			<td>Funakoshi, Japan</td>
			<td>cG-4A</td>
			<td>Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09154-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G potassium</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26239-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26807-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>27575-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic multi-well culture plate</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>353226</td>
			<td>Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (20 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td>Use for infusion of CIB-EGTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (30 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-30ES</td>
			<td>Use for infusion of Enzyme-mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P5147</td>
			<td>A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Sample buffer solution</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>198-13282</td>
			<td>Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS polyacrylamide gel&#160; (15%)</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>193-14991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>32237-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09422-81</td>
			<td>Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T8003</td>
			<td>Trypsin from bovine Type 1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular clamp</td>
			<td>Karl Hammacher GmbH, Germany</td>
			<td>HSE 004-35</td>
			<td>Small straight vascular clamp used for clamping aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other reagents</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice

В фундаментальных исследованиях с использованием сердца мыши выделение жизнеспособных отдельных кардиомиоцитов является важным техническим шагом для преодоления. Традиционно выделение кардиомиоцитов из кроликов, морских свинок или крыс проводилось с помощью ретроградной перфузии сердца ферментами с использованием аппарата Лангендорфа. Тем не менее, высокая степень мастерства требуется, когда этот метод используется с маленьким мышеным сердцем. Недавно сообщалось о методе антеградной перфузии, который не использует аппарат Лангендорфа для выделения кардиомиоцитов мыши. Здесь мы сообщаем о полном протоколе улучшенной антеградной перфузии иссеченного сердца для выделения отдельных клеток сердца от взрослых мышей (8 - 108 недель). Антеградную перфузию проводят путем введения перфусата вблизи вершины левого желудочка иссеченного сердца, аорту которого зажимали, с помощью инфузионного насоса. Все процедуры проводятся на предварительно подогретом нагревательном коврике под микроскопом, что позволяет контролировать процессы инъекций и перфузии. Результаты показывают, что желудочковые и предсердные миоциты, а также фибробласты могут быть хорошо выделены от одной взрослой мыши одновременно.

Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

Мы разработалиупрощенный метод выделения высококачественных отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной перфузии. Этот метод не содержит Лангендорфа и полезен для выделения желудочковых и предсердных миоцитов или интерстициальных клеток, таких как сердечные фибробласты или прародители.

Метод перфузии Antegrade для выделения кардиомиоцитов у мышей

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Мы разработали простой метод без Лангендорфа для выделения отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной упаковки. Этот метод позволяет изолировать клетки сердца от ювенильных до пожилых мышей. Ретроградная перфузия на основе Лангендорфа считается золотым стандартом для выделения сердечных миоцитов у различных экспериментальных животных.Тем не менее, канюляция LTA технически затруднена у мышей из-за их небольшого размера. Для сбора урожая сердца мыши, после подтверждения эвтаназии и бритья живота, быстро откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце, и используйте пластиковую переносную пипетку с наконечником, вырезанным примерно до размера сердца, чтобы засосать сердце в пипетку. Поднимите пипетку, чтобы создать достаточно места для вставки изогнутых ножниц и используйте ножницы, чтобы иссечить сердце со стороны дорсальной стороны, заботясь о том, чтобы не повредить предсердия.Немедленно поместите сердце в 30-миллилитровый стеклянный стакан, содержащий ледяной CIB-EGTA, примерно на одну минуту. Когда схватки прекратились, поместите сердце в 35-миллилитровую культурную чашку, содержащую ледяной CIB-EGTA, и удалите легкое и другие видимые ткани. Поместите грубо очищенное сердце на подставку для сердца, заполненную охлажденной вершиной CIB-EGTA, стороной вниз и поместите подставку под стереоскопический микроскоп.Удалите жировые и соединительные ткани вокруг аорты. Если длина разрезанной аорты слишком длинная, обрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией и сориентирует сердце так, чтобы передняя поверхность была обращена вперед. Используйте пинцет, чтобы поднять конец аорты и использовать небольшой сосудистый зажим, чтобы зажать аорту возле предсердия, осторожно надавливая на предсердия.Затем поместите зажатое сердце на перфузионную пластину передней стороной вверх и увлажните сердце несколькими каплями CIB-EGTA. Для антеградной перфузии загрузите 20-миллилитровый шприц, содержащий предварительно выровненный CIB-EGTA, соединенный с гибкой удлинительной трубкой и маркированной инъекционной иглой, на инфузионный насос и запустите насос со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту. Когда игла и насос будут заполнены, поместите инъекционную иглу на перфузионную пластину с более короткой стороной диагональной формы спереди и сдвиньте иглу, пока она не коснется вершины сердца.Осторожно вставьте иглу около вершины левого желудочка в желудочковую камеру, не скручивая и не отсоедив иглу от пластины, наблюдая за меткой, чтобы оценить глубину введения иглы. Когда введение иглы завершено, кровь должна начать течь из коронарной артерии. Используйте ленту, чтобы закрепить инъекционную иглу на пластине и увеличить скорость насоса до одного миллилитра в минуту.Если сердце успешно перфузировано, поток буфера в капилляре должен быть виден как раз под эпикардом. После двух-трех миллилитров перфузии CIB-EGTA замените перфузионный буфер ферментной смесью. После того, как один-два миллилитра были перфузированы, увеличьте скорость насоса до 1,5 миллилитра в минуту.Используйте пипетку для удаления накопленного кровьсодержащего перфусата, вытекающего из сердца по мере необходимости, и остановите перфузию, когда общий объем перфузированного фермента достигнет 10 миллилитров. В конце перфузии переложите 10 миллилитров ферментной смеси со шприца на 60-миллиметровую культуральную посуду на нагревательном коврике и добавьте в блюдо 20 миллиграммов BSA. Аккуратно закрутите блюдо, чтобы растворить порошок и вынуть инъекционную иглу и зажим от сердца.Удалите желудочки и предсердия из сердца и поместите ткани в смесь ферментов, дополненную BSA. Чтобы изолировать желудочковые миоциты, используйте две пары пинцетов, чтобы захватить эпикард и осторожно вытянуть желудочки на мелкие кусочки. Когда все фрагменты желудочков будут сформированы, рассейте клетки примерно 30 раз с мягким пипетированием и отфильтруйте непереваренный мусор через 100-микронный сетчатый клеточный сетчатый фильтр в 15-миллилитровую центрифужную трубку.После центрифугирования повторно суспендируют гранулу кардиомиоцитов в предварительном CIB, дополненном кальцием и BSA, и инкубируют клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации центрифугируют клетки снова и повторно суспендируют осажденные кардиомиоциты в соответствующем объеме клеточного раствора для их поддержания при 37 градусах Цельсия до последующего анализа. Чтобы изолировать предсердные миоциты, перенесите предсердия в контейнер с доварным CIB, дополненным кальцием и BSA, и разорвите предсердия на части, как показано.Используйте пипетку размером 20 микролитров, установленную на 10 микролитров, чтобы разрушить ткани путем пипетирования и собрать диссоциированные клетки путем центрифугирования. Затем повторно суспендирует предсердную клетку в соответствующем объеме клеточного раствора. На этом изображении можно наблюдать свежеизолированные желудочковые миоциты.Эта процедура изоляции приводит к выходу от 70 до 80% палочковидных желудочковых миоцитов в форме покоя от восьми до 10-недельных мышей в течение примерно пяти часов после изоляции. Соотношение свежеизолированных жизнеспособных клеток ниже у мышей старше двух лет. Потенциалы действия, зарегистрированные в желудочковых и предсердных миоцитах, аналогичны тем, которые измеряются в клетках, полученных методом Лангендорфа.Иммуноразрушающий анализ может быть использован для оценки организации саркомергической структуры желудочковых миоцитов и трансформации сердечных фибробластов в миофибробласты после субкультуры. Вестерн-блот-анализ рекомендуется для определения специфической экспрессии интересующих белков в предсердиях и желудочках после обработки. После перфузии ферментами белки из предсердий и желудочков могут быть легко гомогенизированы в буфере лизиса с легкой силой для экстракции белка.Важно контролировать направление и глубину введения иглы. При введении иглы в левый желудочек позаботьтесь о том, чтобы не проткнуть желудочковую перегородку или не проникнуть в клапан. Можно менять состав перфусата в зависимости от цели эксперимента.Например, моющее средство, дополненное EGTA, может быть использовано для создания бесклеточного каркаса сердца.

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Улучшенный метод выделения РНК из Лоблолли Пайн ( П. taeda L.) и других хвойных пород

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

Альтернантных Метод Традиционные НАСА задних конечностей Выгрузка модели у мышей

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Выделение фибробластов крысы Портала<em&gt; В месте</em&gt; Печень перфузии

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Выделение гепатоцитов человека два-ступенчатой ​​коллагеназы процедуры перфузионный

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Выделение легочной артерии гладкомышечных клеток у новорожденных мышей

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в<em&gt; Разное</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Простой протокол высокой эффективности для изоляции поджелудочной железы от мышей

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Изоляция ядер от цельного ткани с помощью метода для детей, свободных от ферментов,

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...