Name: an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice
Uploaded: 2021-05-19T13:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

Författarna tackar T. Yamamoto och Y. Mori för deras hjälp i de morfologiska experimenten. Detta arbete stöddes av ett anslag för vetenskaplig forskning (C) från Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 till M.O.K. och 17K08536 till H.M.).

Alla djurförsök överensstämde med guiden för vård och användning av laboratoriedjur som publicerats av US National Institutes of Health (NIH Publication Nr. 85-23, reviderad 1996) och godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid Shiga University of Medical Science Animal Care and Use Committee (godkänd nr 2019-3-7). Metoderna utfördes i enlighet med godkända riktlinjer.
1. Instrument och lösning
OBS: En översikt över försöksförfarandet illustreras i ett flödesdiagram(kompletterande figur 1). En infusionspump (eller sprutpump) ska användas för hjärtats antegradperfusion med ett enkelvägsflöde. En peristaltisk pump som skapar ett pulserande flöde rekommenderas inte.
<ol><li>Före den experimentella<ol>
<li>Märk injektionsnålen på en plats ca 3 mm från spetsen med nagellack. Efter att ha tillåtit det lufttorka, håll den i behållaren vid rumstemperatur. En röd eller ljus färg är önskvärd för att bekräfta djupet av införing i myokardiet under perfusion.</li>
		<li>Få hjärtat att stå genom att skära av locken på 1,5-, 0,5- och 0,2 ml provrör och fästa locken på botten av en 60 mm kulturrätt med dubbelhäftande tejp eller lim. Fixering av tre olika storlekslock i en maträtt gör det möjligt att välja lämplig enligt mushjärtas storlek. Detta hjärtstativ kan återanvändas efter tvätt.</li>
		<li>Gör lagerlösning enligt tabell 1. Förvara lagerlösningarna vid 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På experimentdagen OBS: Cellisoleringsbuffert (CIB) innehåller (i mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2,0,33 NaH2PO4,22 glukos, 40 enheter/ml insulin och 25 HEPES (pH justerat till 7,4 med NaOH); och Tyrodlösning innehåller (i mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2,0,5 MgCl2,0,33 NaH2PO4, 5,5 glukos och 5,0 HEPES (pH justerat till 7,4 med NaOH).<ol>
<li>Förbered CIB. Värm 160 ml destillerat vatten (DW) med en mikrovågsugn till cirka 32 °C och tillsätt sedan 20 ml 10X CIB. Efter tillsats av 0,79 g glukos och 10 μL insulinlösning justerar du pH med 1 M NaOH och ger 200 ml med DW.</li>
		<li>Förbered enzymblandningslösningen (enzymblandning). Tillsätt 30 mg kollagenas, 1,8 mg trypsin, 1, 8 mg proteas och 90 μL 100 mM CaCl2 stamlösning till 30 ml CIB (slutlig Ca2+ koncentration är 0, 3 mM), blanda och håll den på is. Hos möss <4 veckor gamla, minska trypsin och proteas till 0,9 mg10. Värm vid 37 °C i ett vattenbad före användning.</li>
		<li>Förbered CIB-Ca2+-BSA-lösningen. Tillsätt 30 mg BSA och 90 μL 100 mM CaCl2 stamlösning till 15 ml CIB (slutlig Ca2+ koncentration är 1,2 mM), blanda, filtrera genom ett 20-μm filter och håll det på is.</li>
		<li>Förbered CIB-EGTA-lösningen. Efter att ha gjort de lösningar som beskrivs i steg 1.2.2 och 1.2.3, tillsätt 400 mM EGTA-lagerlösning till den återstående CIB vid en utspädning på 1:1000 (slutlig EGTA-koncentration är 0,4 mM) och blanda. Fyll 35 mm kulturrätt och hjärtstativ med CIB-EGTA och håll dem på is.<ol>
<li>Häll cirka 20 ml CIB-EGTA i en 30 ml glasbägare och ställ en plastöverföringspipett i bägaren och håll den på is.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Förbered Tyrodlösningen. Tillsätt 100 ml 10X tyrod till 800 ml DW och värm den med en mikrovågsugn till cirka 32 °C. Efter att ha tillstärt 0,99 g glukos och 1,8 ml 1 M CaCl2, justera pH med 1 M NaOH och ta till 1000 mL med DW.</li>
		<li>Förbered cellens återsuspensionslösning. Tillsätt 30 mg BSA och 300 μL 50X antibiotika till 15 ml tyrodlösning.</li>
		<li>Förbered sprutor. Fyll sprutan på 20 ml som är ansluten till det flexibla förlängningsröret och den markerade injektionsnålen med CIB-EGTA. Fyll 30 ml sprutan med den uppvärmda enzymblandningen. Håll dem båda vid 37 °C tills strax före användning.</li>
		<li>Förbered perfusionsplattan. Förvärm värmarmattan under ett stereoskopiskt mikroskop. Placera perfusionsplattan (locket på en kulturplatta med flera brunnar) på den förvärmde värmemattan. Förvärm kärlklämman genom att placera den i perfusionsplattan tills den används. Placera 60 mm odlingsformen för pipetting och cellsilen på den förvärmde värmemattan också.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Antegrad perfusion av mushjärtat
OBS: Plastöverföringspipetten som används för att suga hjärtat ska vara mjuk och inte vara kraftigt avsmalnande mot spetsen. Välj en liten kärlklämma med serration. De rekommenderade instrumenten anges i materialförteckningen.
<ol><li>Excision av mushjärtat och klämning av aortan OBS: De vuxna mössen (>8 veckor gamla) ska avlivas genom en överdos av natriumpentobarbital (>300 mg/kg, intraperitoneal [i.p.] injektion) med heparin (8000 enhet/kg).<ol>
<li>Punktskatt mushjärtat snabbt genom att suga.<ol>
<li>Öppna brösthålan snabbt för att exponera hjärtat. Skär plastöverföringspipetten, vars spets är ungefär lika stor som, eller något mindre än, det exponerade hjärtat (vanligtvis på en plats cirka 1 cm från 0,5-mL-märket mot spetsen, men det beror på hjärtstorleken).</li>
			<li>Sug hjärtat i pipetten, lyft pipetten för att skapa tillräckligt med utrymme för att sätta in sax och punktskatt hjärtat med böjd sax från dorsalsidan, undvik att skada atria.</li>
			<li>Överför omedelbart det strukna hjärtat till den 30 ml glasbägare som innehåller iskyld CIB-EGTA för att stoppa sammandragningen. Denna procedur tar vanligtvis <1 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rengöring runt aortan<ol>
<li>Överför hjärtat till en 35 mm odlingsfat fylld med iskyld CIB-EGTA och ta bort lungan och andra synliga vävnader och överför sedan det grovt rengjorda hjärtat till hjärtstativet fyllt med kyld CIB-EGTA och placera den med toppen nere.</li>
			<li>Under det stereoskopiska mikroskopet, ta bort fettet och bindväven för att rengöra runt aortan. Om längden på den skurna aortan är för lång inklusive brachiocephalic gatan, den vänstra gemensamma halsartären eller den vänstra subclavian gatan, skära av aortan strax under brachiocephalic gatan för att förkorta den för att gå vidare till nästa steg. Denna procedur tar vanligtvis cirka 4 minuter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spänna fast aortan och placera det fastklämda hjärtat på perfusionsplattan<ol>
<li>Placera hjärtat i hjärtstativen under mikroskopet. Operatören bör möta hjärtats främre yta, plocka upp änden av aortan med pincett och klämma in aortan nära atria med en liten vaskulär klämma samtidigt som du försiktigt trycker ner aortan lite.</li>
			<li>Placera det fastklämda hjärtat på perfusionsplattan med den främre sidan uppåt och täck det sedan med några droppar CIB-EGTA för att hindra det från att torka ut. Denna procedur tar vanligtvis <20-talet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Antegrad perfusion av hjärtat OBS: Läs först in hjärtat med CIB-EGTA för att ladda ut blod och förhindra koagulering.<ol>
<li>Sätt in injektionsnålen och starta perfusion för att skriva ut blod<ol>
<li>Ställ in sprutan på 20 ml fylld med förvärmd CIB-EGTA ansluten till det flexibla förlängningsröret och en markerad injektionsnål på infusionspumpen. Starta pumpen med en långsam hastighet av 0,5 ml/min för att försiktigt fylla nålen och röret med CIB-EGTA och se till att förhindra att luft kommer in i röret.</li>
			<li>Placera injektionsnålen på perfusionsplattan med den kortare sidan av den diagonala formen framför. Skjut nålen mot hjärtats spets tills den vidrör den och sätt sedan försiktigt in nålen nära toppen av vänster ventrikel i ventrikulära kammaren utan att vrida. Lossa inte nålen från plattan när du sätter in den.</li>
			<li>Titta på det röda märket för att uppskatta djupet på nålinsättningen. När nålinsättningen är klar ska blod som strömmar från kranskärlen börja släppas ut.</li>
			<li>Fäst injektionsnålen på plattan med tejp och öka pumphastigheten till 1 ml/min. Denna procedur tar vanligtvis cirka 30 s. Om hjärtat perfused framgångsrikt, kan flödet av CIB-EGTA i kapillären strax under epicardium ses under mikroskopet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Perfusion hjärtat med enzymblandning OBS: Vid enzymatisk perfusion kan djupet på den insatta nålen övervakas genom att kontrollera det röda märket på nålen.<ol>
<li>Efter att ha perfuserat 2-3 ml CIB-EGTA för att helt släppa ut blod från kranskärlen, ändra perfusate till enzymblandning. Undvik att låta luftbubblor komma in i röret. Kontrollera flödet av enzymblandningen och se till att injektionsnålen inte har kommit ut genom att kontrollera det röda märkets position.</li>
			<li>När 1-2 ml har perfused, öka pumphastigheten till 1,5 ml/min. Ta bort det ackumulerade perfusatet som innehåller blod som har flödat ut ur hjärtat med en pipett då och då. OBS: Med tiden kommer myokardväggen att bli genomskinlig på vissa ställen och visas fläckig, vilket är ett tecken på matsmältning av den extracellulära matrisen efter framgångsrik perfusion. Ett annat tecken är omstarten av förmaksflimmer som orsakas av närvaron av Ca2 + i enzymblandningen.</li>
			<li>Stoppa perfusion när den totala volymen av enzymblandningen perfused är 10 ml.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolering av enskilda hjärtceller
<ol><li>Dissociera hjärtceller<ol>
<li>Efter perfusion med enzymblandningen, överför 10 ml av enzymblandningen kvar i sprutan till en 60 mm odlingsform placerad på värmarmattan och tillsätt 20 mg BSA (0, 2% BSA i enzymblandning). Det tappade BSA-pulvret ska lösas upp omedelbart genom att försiktigt virvla med en hand. Ta bort injektionsnålen och kärlklämman från hjärtat.</li>
		<li>Separera ventriklarna och atria och överför var och en till enzymblandningen kompletterad med 0,2% BSA på värmemattan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolering av ventrikulära myocyter<ol>
<li>Ta epicardiumet med två pincett och riv försiktigt ventriklarna från sida till sida i enzymblandningen kompletterad med 0,2% BSA i små bitar. Sprid cellerna med skonsam pipetting (cirka 30 gånger).</li>
		<li>Filtrera det osmälta skräpet genom en 100-μm nätcellssil och överför filtratet till ett 15 mL centrifugeringsrör för centrifugering vid 50 × g i 3 min. Återanvänd de pelleterade kardiomyocyterna i förvärmd CIB-Ca2+-BSA-lösning, inkubera den i 5 minuter vid 37 °C och centrifugera den sedan vid 14 × g i 3 min.</li>
		<li>Återanvänd de slutliga utfällda kardiomyocyterna i cellresuspensionslösning (kompositionen anges i tabell 2)och håll den vid 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolering av förmaksflimmer myocyter<ol>
<li>Under den slutliga centrifugering för ventrikulär myocytfraktion i steg 3.2, börja isolera de förmaksflimmer myocyterna. Överför atria, lagrad enligt steg 3.1, till den förvärmda CIB-Ca2+-BSA-lösningen, riv den i bitar och dissociera cellerna genom att pipettera med pipettspets vid 10 μL på värmemattan.</li>
		<li>Centrifugera cellblandningen vid 14 × g i 3 min och återanvänd de pelleterade förmakscellerna med cellresuspensionslösning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolering och odling av hjärtfibroblaster<ol>
<li>Överför supernatanten från den första centrifugering i steg 3,2 till ett annat 15 mL centrifugeringsrör och centrifugera vid 190 × g i 5 min. Tvätta de fällda cellerna två gånger med centrifugation i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) och suspendera sedan cellerna med DMEM kompletterat med 10% fetala nötkreatur albumin (FBS) och antibiotika.</li>
		<li>Plätera den sista cellfraktionen i en odlingskolv(25cm 2 ) och låt cellerna fästa på kolvens botten i en fuktad atmosfär av 95 % luft och 5 % CO2. Efter 90 min inkubation, kassera de obundna cellerna och tillsätt färskt odlingsmedium. Celler bör nära confluency efter cirka 4 dagar, då de bör förstärkas genom trypsinization och sås till nya kulturrätter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Skörda proteiner från atria och ventriklar
<ol><li>Efter perfusion, separera atria och ventriklarna och homogenisera dem i lysbuffert med ett förhållande av 10 mg vävnadsvikt till 100 μL buffert med en liten kvarn i ett 1,5 mL provrör.</li>
	<li>Håll homogenatet i is i 40 minuter med virvelblandning var 10:e minut för att extrahera proteiner och centrifugera sedan röret vid 15000 × g i 20 min vid 4 °C. Förvara den övernaturliga fraktionen vid -80 °C som ett proteinprov.</li>
</ol>5. Immunostaining av isolerade hjärtceller
OBS: Immobilisering av icke-vidhäftande kardiomyocyter till botten av celltomografin med biologiskt lim är nödvändig.
<ol><li>Vidhäftning av isolerade kardiomyocyter till en kulturrätt med glasbotten<ol>
<li>Innan cellisolering påbörjas, täck kulturrätten med glasbotten med biologiskt lim (t.ex. Cell-Tak) enligt tillverkarens anvisning, skölj med DW och lufttorka vid rumstemperatur.</li>
		<li>Efter återupplivning av isolerade kardiomyocyter i CIB-Ca2 +-BSA-lösning, släpp cellupphängningen på botten av de limbelagda diskarna och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur utan agitation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunostaining<ol>
<li>Plätera de isolerade kardiomyocyterna på en skål med glasbotten förbelagd med biologiskt lim och håll den vid rumstemperatur i 40 minuter så att cellerna kan fästa på skålen. Kultur hjärtfibroblaster i bottenglas kulturrätter.</li>
		<li>Skölj celler med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fixera dem med 4% paraformaldehyd (PFA) i 5 minuter med skakningar. Tvätta de fasta cellerna med PBS i 10 min tre gånger och inkubera dem i blockerande permeabiliseringslösning i 60 minuter vid rumstemperatur med skakningar.</li>
		<li>Sondceller med primär antikropp utspädd i blockeringspermeabiliseringslösning i 60 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Tvätta cellerna med PBS i 10 min tre gånger och inkubera sedan med fluorescensmärkt sekundär antikropp i 60 min vid rumstemperatur.</li>
		<li>Efter att ha tvättat dem tre gånger med PBS i 10 min, färga kärnan med DAPI (1:10000 utspädning i PBS). Analysera fluorescerande signaler med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Inspelningar av plåsterklämma i hela cellen
<ol><li>Tillverka patchelektroderna från en glaskeillär med hjälp av en horisontell mikroelektroddragare. Elektrodens motstånd varierade från 2 till 4 MΩ när den fylldes med en K+-rik pipettlösning (tabell 2). Överför en alikvot isolerade kardiomyocyter till en inspelningskammare monterad på scenen i ett inverterat mikroskop som är superfuserat med tyrod med en hastighet av 1 ml/min vid 36–37 °C.</li>
	<li>Registrera verkningspotentialer med den perforerade patchklämman med K+-rik pipettlösning som innehåller 30 mg/mL amphotericin B genom att applicera strömpulser på 5-10 ms i varaktighet med en hastighet av 1 Hz via patchelektroden.</li>
</ol>7. Västerländska fläckar
<ol><li>I denna studie, utför en västerländsk fläck analys av små-molekylvikt proteiner, såsom förmaksflimmer markör förmaksflimmer natriuretic peptid (ANP).</li>
	<li>Lös upp proteinprovet i den slutliga koncentrationen av 1X provbuffert, 2 % 2' merkaptoethanol, och denaturera proteinerna i 60 minuter vid 37 °C. Ladda 20 μg protein i varje brunn och utför elektrofores i löpbuffert med 20 mA per gel i 120 min.</li>
	<li>Överför proteinet till ett PVDF-membran i överföringsbuffert vid 10 V i 40 min. Tvätta det överförda membranet två gånger med TBST i 5 min, blockera sedan med 5 % skummjölk i TBST i 60 minuter vid rumstemperatur och sond med den primära antikroppen upplöst i TBST över natten vid 4 °C.</li>
	<li>Tvätta membranet 5 gånger med TBST i 7 min och inkubera det med den sekundära antikroppen utspädd i TBST i 120 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Efter att ha tvättat membranet 5 gånger med TBST i 7 min, visualisera signalerna med en chemi-luminescence-analys och analysera dem med en lumino-bildanalysator.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+&#252;berlebenden+S&#228;ugethierherzen.">Untersuchungen am &#252;berlebenden S&#228;ugethierherzen.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Joshi-Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+plasticity+in+long-term+cultures+of+adult+ventricular+myocytes.">Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).</li><li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells.">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li><li>Zhou, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes:+methods+for+cellular+genetic+physiology.">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+sustained+K++current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle.">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> Journal of Physiology. 504, 557-563 (1997).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Sambrano, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+signalling+network+in+mouse+cardiac+myocytes.">Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.</a> Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cardiac+fibroblasts+in+post-myocardial+heart+tissue+repair.">The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair.</a> Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+self-beating+cardiomyocytes+in+adult+mouse+ventricles.">A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).</li><li>Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+TRPC3+increases+apoptosis+but+not+necrosis+in+response+to+ischemia-reperfusion+in+adult+mouse+cardiomyocytes.">Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+and+functional+role+of+the+rapidly+activating+delayed+rectifier+K(+)+current+in+left+and+right+atria+of+adult+mice.">Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice.</a> European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).</li><li>Milgroom, A., Ralston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+skeletal+muscle+with+CLARITY+for+light+microscopy+imaging.">Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging.</a> Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Eftersom hjärtat är mycket mottagligt för ischemi bör den tid det tar att ta bort hjärtat och fördjupa det i iskallt CIB-EGTA för att stoppa sammandragningen hållas kort som möjligt (<1 min). Detta är det första kritiska steget i den här metoden. Det andra kritiska steget gäller hjärtats riktning. Det strukna hjärtats särskilda orientering i steg 2.1.2 gör det lättare att se och ta bort fettet och bindväven runt aortan. Efter rengöring runt aortan, placera det klämda hjärtat med främre ytan sida upp på perfusionsplattan. Det sista kritiska steget innebär införandet av injektionsnålen. När nålen förs framåt mot hjärtat ska injektionsnålen inte lossna från perfusionsplattan för att hålla ett konstant avstånd från plattan. Insättningspositionen är nära toppen av den vänstra ventrikeln. Sätt försiktigt in nålen utan vridning, eftersom sådan vridning kan förstora hålet. Djupet av infogningen av nålen kan uppskattas genom att titta på det röda märket. Om nålen sätts in för djupt kan spetsen genomborra ventrikulär septum och komma in i den högra ventrikeln eller genom mitralventilen och gå in i vänster atrium. Efter att ha bekräftat blodets försvinnande från kranskärlen ska nålen fixeras med tejp till perfusionsplattan.
En längre aortalängd gör det svårt att klämma in aortan i rätt läge. Om klämman är för avlägsen från atria kan hjärtat rotera efter perfusatinfusion. För att förhindra detta, skär av aortan strax under den brachiocephalic artären för att förkorta aortan före fastspänning.
Om blodet inte börjar släppas ut efter perfusion vid en initial hastighet av 0,5 ml/min, öka hastigheten till 1 ml/min. Om det inte hjälper kan injektionsnålen placeras felaktigt, till exempel i höger ventrikel, ventrikulär septum eller vänster myokardvägg. I ett sådant fall, ta bort nålen omedelbart och försök att sätta in den igen nära toppen av den vänstra ventrikeln. När nålen sätts in flera gånger kan smälta celler strömma ut från de öppnade hålen. Observera att detta vanligtvis inte allvarligt påverkar cellisoleringen.
Operatörerna kan övervaka hela processen med antegrad perfusion av hjärtat med hjälp av ett stereoskopiskt mikroskop för att observera förändringarna i färg och transparens och starta om atrias slag tillsammans med matsmältningen. Totalt 10 ml enzymblandning bör vara det maximala som krävs, även för ett gammalt hjärta. I yngre hjärtan (5-7 veckor gamla) minskar vi volymen till 9 ml, vilket liknar tillvägagångssättet via retrograd perfusion med samma enzymblandning.
Supernatanten vid den slutliga centrifugationen innehåller skräp, blodkroppar och icke-myocyter medan pelleten huvudsakligen innehåller kardiomyocyter och förorenar icke-myocyter, såsom fibroblaster och endotelceller. För att rena kardiomyocyterna behövs fler steg. I allmänhet bör pelleten återanvändas i lämpligt cellkulturmedium och förberedas i 2 timmar vid 37 °C på en vävnadscellkulturrätt och sedan försiktigt avlägsna kardiomyocyterna genom pipettering och förberedelse för kultur.
Enzymblandningen innehåller en låg koncentration på Ca2+ (0,3 mM). Vi inkuberar därför smälta celler i CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2 +) innan den slutliga återsuspensionen med cellen återsuspension lösning (1,8 mM Ca2 +), och den gradvisa ökningen av Ca2 + undviker att orsaka cellskador7. Så länge de isolerade kardiomyocyterna är intakta (quiescenta celler utan sammandragning) påverkar detta Ca2 +-anpassningsförfarande inte cellens livskraft hos möss. Eftersom de skadade cellerna dör under denna inkubation får vi följaktligen en hälsosam cellgrupp. På samma sätt kan isolerade intakta förmaksflimmer myocyter (quiescent celler utan oregelbunden sammandragning) lagras i samma cell resuspension lösning. Förmaksflimmer myocyter tenderar dock att vara mer känsliga att lagras jämför med ventrikulära myocyter.
I laboratoriet är denna isoleringsmetod nästan alltid framgångsrik om inte nålinsättningen i vänster ventrikel misslyckas. Vi har också lyckats isolera celler från det hypertrofierade hjärtat som framställs av kirurgiska tvärgående aorta förträngning. Men hos åldrade möss, som ofta har små hjärtinfarkter, upphör perfusion på vissa ställen, vilket resulterar i ofullständig matsmältning och därmed ett lågt utbyte (Figur 1C), liknande den Langendorff-baserade bakåtsträvande metoden. I sådana fall kan hjärtats förvrängda form observeras även i början av perfusionen.
Denna antegrad perfusionsmetod är användbar för att isolera hjärtceller från möss i olika åldrar men inte större djur, såsom kaniner och marsvin. Det kan vara möjligt att tillämpa denna metod på neonatala eller juvenila råttor före avrutning.
En av fördelarna med denna antegrade perfusionsmetod är att den minskar de tekniska hindren i samband med att använda Den Langendorff-baserade retrograda perfusionsmetoden för små mushjärtan. Den tid som krävs för perfusion är cirka 7 min med 10 ml enzymer, denna korta matsmältningsperiod ökar cellernas livskraft. Dessutom gör det det möjligt att utföra perfusion genom hjärtats kranskärlscirkulation, även efter att aortaventilerna har smälts. Isolering av förmaksflimmer myocyter kräver vanligtvis Langendorff-baserade retrograd perfusion och ytterligare inkubation med enzymer17. Denna antegrade perfusion strategi, dock, kan djupt granska vävnaden med enzymet att isolera förmaksflimmer myocyter.
I experiment med flera möss bör Langendorff-apparaten rengöras innan nästa hjärta perfuseras. I den nuvarande antegrademetoden bereds dock perfusion kontinuerligt så länge som önskat antal instrumentuppsättningar (t.ex. sprutor och perfusionsplattor) framställs i förväg.
Vi häri rapportera den grundläggande metoden för antegrad perfusion av mushjärtat med samma lösningar som Langendorff-baserade retrograd perfusion metod utan ytterligare kemikalier. Sammansättningen av perfusatet kan ändras för att passa syftet med experimentet, till exempel att använda ett tvättmedel som innehåller EGTA istället för enzymerna för att göra ett decellulärt hjärta18.

I allmänhet innebär det första steget i isoleringen av dissekerad vävnad att vävnaden mals i små bitar, följt av matsmältningen av bindväven och extracellulär matris med enzymer. Kardiomyocyter kan dock inte isoleras med en sådan hackningsmetod, eftersom berikning med extracellulära matriskomponenter, inklusive kollagen och elastinfibrer, gör hjärtmuskeln för svår att hacka, och kardiomyocyterna är mycket känsliga för hypoxi och andra förändringar i mikromiljön. Således, med hjälp av Langendorff-baserade retrograd perfusionssystem1, har en metod för att smälta den extracellulära matrisen med enzymer utvecklats för att isolera enskilda kardiomyocyter från hjärtat2,3,4.
I musmodeller används Langendorff-baserad retrograd perfusion av hjärtat med enzymer också för isolering av enskilda kardiomyocyter5,6,7,8. Cannulation av den lilla och tunna musaortan och dess montering på Langendorff-apparaten för att utföra bakåtsträvande perfusion kräver dock en hög grad av skicklighet, eftersom aortans diameter i det vuxna hjärtat är cirka 1,2 mm. Dessutom tar det tid att utföra flera experiment eftersom Langendorff-apparaten bör rengöras innan nästa hjärta perfuseras.
Som ett alternativ till bakåtsträvande perfusion utvecklades en ny metod för att isolera kardiomyocyter från ett vuxenmushjärta utan en Langendorff-apparat. Denna epokgörande metod baserades på antegrad perfusion av kranskärlen9. Vi förbättrade nyligen varje steg i detta antegrade protokoll, såsom fastspänning av stora kroppskort, nål insättningspunkten och temperaturkontroll, och övervakade alla perfusion förfaranden med ett mikroskop10. Vi häri rapportera i detalj förfining av denna antegrade perfusion metod för att förkorta tiden för isolering och ge en kompletterande video. I denna metod tar perfusionen av hjärtat cirka 7 min med 10 ml enzymer, och denna korta matsmältningsperiod ökar cellernas livskraft. Detta är en enkel metod för att isolera enstaka hjärtceller med hög kvalitet utan att kräva tillsats av kemikalier, såsom 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 eller taurin5,8. Vi tror att denna metod kommer att sänka teknikens färdighetströskel och förbättra nyttan av muskardiomyocyter i grundforskningen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-actinin (ACTN)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>AB5490-I</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, USA</td>
			<td>2118</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle actin (SMA)</td>
			<td>Dako, Denmark</td>
			<td>M0851</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Amersham, GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA934</td>
			<td>Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Biological material for adhesion of the cell or tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One Super&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>02230-14</td>
			<td>Chemiluminescent reagent used for western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 2</td>
			<td>Worthington Biochemicals, USA</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche, Germany</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>A mixture of several protease inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;6&#39;diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>11034-56</td>
			<td>Used for cell-impermeant nuclear stainig&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>including 4.5 g/L gluose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>X1-50</td>
			<td>Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC-8 patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Lab., Japan</td>
			<td></td>
			<td>outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP lithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal microelectrode puller&#160;</td>
			<td>Germany)</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Natsume Seisakusho, Japan</td>
			<td>KN-475-3-40</td>
			<td>Equipment to warm the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>TE-311</td>
			<td>Infusion syringe pump for antegrade perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injeciton needle (27 gauge)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>Needle for insertion into the left ventricle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (from bovine pancrease)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I5500</td>
			<td>Dissolve in 0.1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cordless grinder</td>
			<td>Funakoshi, Japan</td>
			<td>cG-4A</td>
			<td>Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09154-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G potassium</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26239-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>26807-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>27575-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic multi-well culture plate</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>353226</td>
			<td>Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (20 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td>Use for infusion of CIB-EGTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe (30 mL)</td>
			<td>TERUMO, Japan</td>
			<td>SS-30ES</td>
			<td>Use for infusion of Enzyme-mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck-Millipore, USA</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P5147</td>
			<td>A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Sample buffer solution</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>198-13282</td>
			<td>Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS polyacrylamide gel&#160; (15%)</td>
			<td>Fuji Film, Japan</td>
			<td>193-14991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>32237-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td>09422-81</td>
			<td>Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T8003</td>
			<td>Trypsin from bovine Type 1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular clamp</td>
			<td>Karl Hammacher GmbH, Germany</td>
			<td>HSE 004-35</td>
			<td>Small straight vascular clamp used for clamping aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other reagents</td>
			<td>Nacalai Tesque, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice

I grundforskning med hjälp av mushjärta är isolerande livskraftiga individuella kardiomyocyter ett avgörande tekniskt steg att övervinna. Traditionellt har isolerande kardiomyocyter från kaniner, marsvin eller råttor utförts via retrograd perfusion av hjärtat med enzymer med hjälp av en Langendorff-apparat. En hög grad av skicklighet krävs dock när denna metod används med ett litet mushjärta. En antegrad perfusion metod som inte använder en Langendorff apparat rapporterades nyligen för isolering av mus kardiomyocyter. Vi häri rapportera ett komplett protokoll för förbättrad antegrad perfusion av det strukna hjärtat att isolera enskilda hjärtceller från vuxna möss (8-108 veckor gammal). Antegrad perfusion utförs genom att injicera perfusat nära toppen av den vänstra ventrikeln i det strukna hjärtat, vars aorta klämdes fast med hjälp av en infusionspump. Alla procedurer utförs på en förvärmd värmematta under ett mikroskop, vilket gör det möjligt att övervaka injektions- och perfusionsprocesserna. Resultaten tyder på att Ventrikulärt och förmaksflimmer myocyter och fibroblaster kan vara väl isolerade från en enda vuxen mus samtidigt.

Principen för denna metod är enkel: perfusatet strömmar från den vänstra kammaren, aortaventilen öppnas och perfusatet rinner in i kranskärlen i samma riktning som blodkörningen, eftersom aortan stängs av fastspänning, vilket möjliggör den djupa perfusionen av myokardiet för att smälta den extracellulära matrisen.
Ventrikulära myocyter som nyligen isolerats med denna metod visas i figur 1A. Figur 1B visar förstorade bilder av ventrikulära och förmaksflimmer myocyter. Denna isolering förfarande resulterade i en hög avkastning (70%-80%) av stavformade quiescenta ventrikulära myocyter från vuxna möss (8-10 veckor), som fanns tillgängliga inom ungefär 5 timmar efter isolering (figur 1C), ett liknande intervall som vid användning av det traditionella Langendorff-baserade förfarandet7. Förhållandet mellan nyligen isolerade livskraftiga celler var dock lägre hos åldrade möss med >2 år (figur 1C). Det totala antalet ventrikulära myocyter som erhållits per vuxenhjärta med detta protokoll var cirka 3 x 106 celler, vilket liknade det värde som tidigarerapporterats 7,12. De åtgärdspotentialer som registrerats i ventrikulära och förmaksflimmer myocyter (figur 1D) liknade dem i celler som erhållits med den Langendorff-baserade metoden10. En immunostaining analys bekräftade att den sarkomiska strukturen i ventrikulära myocyter var välorganiserad med ett tydligt synligt cellmembran (Figur 2A). De enskilda kardiomyocyter som isoleras med denna metod kan användas direkt i experiment, såsom en elektrofysiologiskanalys 10 eller immunostaining experiment.
Hjärtfibroblaster finns i interstitiella utrymmen. Tillräcklig matsmältning av den extracellulära matrisen resulterar i isolering av dessa celler. De isolerade hjärtfibroblasterna förökar sig under odlingsförhållanden och kan passages flera gånger eller lagras i flytande kväve i en lämplig cellreservoarlösning. Figur 2B visar att de flesta av de odlade hjärtfibroblasterna hade omvandlats till myofibroblaster under subkulturen, vilket bekräftas av det ökade uttrycket av α-smooth muskelaktin13,14. Hjärtprogenitorerna kan också isoleras med den nuvarande metoden och odlas i lämpligt odlingsmedium, som börjar slåautomatiskt 10,15.
Homogenisering av det robusta hjärtmuskeln är inte lätt, särskilt för hjärtvävnad från åldrade möss, som har en stor mängd extracellulära fibrer. Efter antegrad perfusion kan protein från atria och ventriklar lätt homogeniseras i lysbufferten med ljuskraft för att extrahera proteiner. En västerländsk fläckanalys visade det specifika uttrycket av ANP i atria men inte i ventriklar från vuxna (20 veckor gamla) och åldrade (108 veckor gamla) möss (Figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig1.jpg"> Figur 1. Isolerade kardiomyocyter från möss. A. Ventrikulära myocyter nyligen isolerade med antegrade perfusion, med bilder förvärvade med låg förstoring. Efter den slutliga tvättningen återanvändes kardiomyocyterna med 2 ml cell resuspension lösning, varav 100 μL släpptes på glasbotten kultur skålen och cell bosättning väntade. Bar, 100 μm.B. Förstorade bilder av isolerade ventrikulära myocyter (övre) och förmaksflimmer myocyter (lägre). Bar, 100 μm.C. Isolerade celler suspenderades i cellen återsuspension lösning och lagras vid 37°C under önskad period, och antalet levande Ventrikulärt myocyter räknades i 10-15 fält under ett mikroskop. Rundade celler ansågs ha varit irreversibelt skadade eller döda16. Gröna, blå och röda symboler erhölls från 3 möss vid 8-10 veckors ålder, och svarta symboler var från 106 veckor gammal mus. Gul symbol anger medelvärdet för varje grupp. D. Representativa åtgärdspotentialer registrerade från ventrikulära (svarta) och förmaksflimmer (röda) myocyter på 8-10 möss. Data erhölls från cellerna cirka 3 h efter isolering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig2.jpg"> Figur 2. Immunostaining för α-aktinin i isolerade mus ventrikulära myocyter och α-smooth muskel aktin i odlade mus hjärt fibroblaster. A. Konfokal laser scanning mikroskopi av immunostaining för α-aktinin (grön), DAPI färgning för atomkärnor (blå) och en DIC bild av Ventrikulärt myocyter isolerade från mus hjärtat med antegrade perfusion. Bar, 50 μm.B. Immunostaining för α-smooth muskel aktin (grön), DAPI färgning för atomkärnor (blå) och en DIC bild av hjärt fibroblaster isolerade från mus hjärta med antegrade perfusion. Hjärt fibroblaster odlades i fyra dagar. Bar, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig3.jpg"> Figur 3. Västerländska fläckar analyser av ANP i atria och ventriklarna. Västerländska fläckar för förmaksmarkören för förmaksflimmer natriuretisk peptid (ANP) i atria (A) och ventriklarna (V) beredda från vuxna (20 veckor) och äldre (108 veckor) hjärtan. ANP är närvarande i atria men saknas i ventriklarna. Använd glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) som kontrollhushållningsprotein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Stamlösningar för isolering av hjärtceller</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10X CIB (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>37,99 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kci</td>
			<td>2,01 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0,23 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (HEPES)</td>
			<td>29,79 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dw</td>
			<td>Fyll upp till 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mM CaCl2 lager soution</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 </td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">400 mM EGTA-lagerlösning</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA (egta)</td>
			<td>400 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Insulinlösning</td>
		</tr>
<tr>
<td>insulin</td>
			<td>1 enhet/ml i 0,1 M HCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">50X Antibiotika stamlösning (20 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>penicillin</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Streptomycin</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenol röd</td>
			<td>1,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dw</td>
			<td>20 ml och sterilisera med filtrering</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10X tyrodlösning (1000 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>81,82 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (kcl)</td>
			<td>4,03 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0,47 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (HEPES)</td>
			<td>11,92 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaOH (naoh)</td>
			<td>0,8 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dw</td>
			<td>Fyll upp till 1000 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Lagersolutin för immunostaining</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">DAPI-aktier</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI (dapi)</td>
			<td>2 mg/ml i metanol</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aktielösningar för västerländska blots</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEPES-buffert (100 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>0,88 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Egta på 400 mM</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (HEPES)</td>
			<td>0,24 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M NaOH</td>
			<td>justera pH till 7,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dw</td>
			<td>Fyll upp till 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Proteashämmare cocktail</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komplett mini</td>
			<td>1 tablett</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dw</td>
			<td>0,4 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Beskrivning av lagerlösningarna. Håll lagerlösningarna på 4 °C. Aliquot protease inhibitorer cocktail för lagring vid -20 °C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Lösningar för isolering av hjärtceller</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB (200 ml)</td>
		</tr><tr><td>10X CIB</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>Insulinlösning</td>
			<td>0,01 ml</td>
		</tr><tr><td>glukos</td>
			<td>0,79 g</td>
		</tr><tr><td>1M NaOH</td>
			<td>pH-justering till 7,4</td>
		</tr><tr><td>Dw</td>
			<td>Fyll upp till 200 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Enzymblandningslösning (30 ml)</td>
		</tr><tr><td>Kollagenas typ2</td>
			<td>30 mg</td>
		</tr><tr><td>trypsin</td>
			<td>1,8 mg</td>
		</tr><tr><td>proteas</td>
			<td>1,8 mg</td>
		</tr><tr><td>100 mM CaCl2 lagerlösning</td>
			<td>0,09 ml</td>
		</tr><tr><td>Cib</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-Ca2+-BSA (15 ml)</td>
		</tr><tr><td>Bsa</td>
			<td>30 mg</td>
		</tr><tr><td>100 mM CaCl2 lagerlösning</td>
			<td>0,18 ml</td>
		</tr><tr><td>Cib</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-EGTA (150 ml)</td>
		</tr><tr><td>400 mM EGTA-lagerlösning</td>
			<td>0.150 ml</td>
		</tr><tr><td>Cib</td>
			<td>150 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tyrodlösning (1000 ml)</td>
		</tr><tr><td>10X Tyrod lagerlösning</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>glukos</td>
			<td>0,99 g</td>
		</tr><tr><td>1M CaCl2
</td>
			<td>1,8 ml</td>
		</tr><tr><td>1M NaOH</td>
			<td>pH-justering till 7,4</td>
		</tr><tr><td>Dw</td>
			<td>Fyll upp till 1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cell resuspension lösning (15 mL)</td>
		</tr><tr><td>Bsa</td>
			<td>30 mg</td>
		</tr><tr><td>50X Antibiotika lagerlösning</td>
			<td>0,3 ml</td>
		</tr><tr><td>Tyrod lösning</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Lösningar för immunstaining</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cell vidhäftande lösning (0,3 ml)</td>
		</tr><tr><td>Cell-Tak</td>
			<td>0,01 ml</td>
		</tr><tr><td>0,1 M NaHCO3 (pH8,0)</td>
			<td>0,285 ml</td>
		</tr><tr><td>0,1 M NaOH</td>
			<td>0,005 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Blockeringspermeabinzatinlösning (10 ml)</td>
		</tr><tr><td>Fetala nötkreatur serum</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>10X PBS</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Dw</td>
			<td>7 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">K+ rik pipettlösning</td>
		</tr><tr><td>Kalium aspartat</td>
			<td>70 mM</td>
		</tr><tr><td>KCl (kcl)</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4
</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>MgSO4 (olika)
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>ATP disodiumsalt</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>GTP litiumsalt</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA (egta)</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES (HEPES)</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>Koh</td>
			<td>pH-justering till 7,2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Lösningar för västerländska blots</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Lysis buffert (1 ml)</td>
		</tr><tr><td>HEPES buffert</td>
			<td>0,86 ml</td>
		</tr><tr><td>Nonidet-P40</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr><tr><td>Proteashämmare cocktail</td>
			<td>0,04 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Runnning buffert (1000 mL)</td>
		</tr><tr><td>10X TG (0,25 M Tris och 1,92 M glycin)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>Sds</td>
			<td>1 g</td>
		</tr><tr><td>Dw</td>
			<td>900 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Överföringsbuffert (1000 ml)</td>
		</tr><tr><td>10X TG</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>metanol</td>
			<td>200 ml</td>
		</tr><tr><td>Dw</td>
			<td>700 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Blotting buffert (TBST) (1000 mL)</td>
		</tr><tr><td>5M NaCl</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>2M Tris-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>10% Interpolering 20</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Dw</td>
			<td>965 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2. Beskrivning av arbetslösningarna för isolering av hjärtceller, immunostaining och western blotting. Förbered alla arbetslösningar precis innan experimenten.
Kompletterande figur 1. Disposition av cellisoleringen. Flöde diagram över isolering av Ventrikulärt och förmaksflimmer myocyter och hjärt fibroblaster från ett enda hjärta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/SupplementaryFig1R.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här siffran.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice at JoVE.com

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

Vi utvecklade enförenklad e-metod för att isolera högkvalitativa enskilda mushjärtaceller med antegrad perfusionstekniken. Denna metod är Langendorff-fri och användbar för att isolera ventrikulära och förmaksflimmer myocyter eller interstitiella celler, såsom hjärtfibroblaster eller stamceller.

En antegrad perfusionsmetod för kardiomyocytisolering från möss

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Vi utvecklade en enkel Langendorff-fri metod för att isolera enskilda mushjärtaceller med en antegrad förpackningsteknik. Denna metod möjliggör isolering av hjärtceller från juvenila till äldre möss. Langendorff-baserad retrograd perfusion har betraktats som en guldstandard för att isolera hjärtmyocyter hos olika försöksdjur.Cannulation av LTA är dock tekniskt svårt hos möss på grund av deras lilla storlek. För mushjärtaskörd, efter att ha bekräftat dödshjälp och rakat buken, öppna brösthålan snabbt för att exponera hjärtat och använd en plastöverföringspipett med spetsen skuren till ungefär hjärtats storlek för att suga hjärtat i pipetten. Lyft pipetten för att skapa tillräckligt med utrymme för att sätta in böjd sax och använd saxen för att ta bort hjärtat från den dorsala sidan och var noga med att undvika att skada atria.Placera omedelbart hjärtat i en 30 milliliter glasbägare som innehåller iskallt CIB-EGTA i ungefär en minut. När sammandragningarna har upphört, placera hjärtat i en 35 milliliter kulturrätt som innehåller iskallt CIB-EGTA och ta bort lungan och annan synlig vävnad. Placera det grovt rengjorda hjärtat på ett hjärtstativ fyllt med kyld CIB-EGTA-spetssida nedåt och placera stativet under ett stereoskopiskt mikroskop.Ta bort fettet och bindväven runt aortan. Om längden på den skurna aortan är för lång, trimma aortan strax under den brachiocephalic artären och orientera hjärtat så att den främre ytan är vänd framåt. Använd pincett för att lyfta änden av aortan och använd en liten kärlklämma för att klämma in aortan nära atria samtidigt som du försiktigt trycker ner atria.Placera sedan det klämda hjärtat på en perfusionsplatta med den främre sidan vänd uppåt och hydratisera hjärtat med några droppar CIB-EGTA. För antegrad perfusion, ladda en 20 milliliter spruta som innehåller förvärmd CIB-EGTA ansluten till ett flexibelt förlängningsrör och en markerad injektionsnål på infusionspumpen och starta pumpen med ett flöde på 0,5 milliliter per minut. När nålen och pumpen har fyllts, placera injektionsnålen på perfusionsplattan med den kortare sidan av den diagonala formen framför och skjut nålen tills den bara vidrör hjärtats topp.Sätt försiktigt in nålen nära toppen av den vänstra ventrikeln i ventrikulära kammaren utan att vrida eller lossa nålen från plattan och titta på märket för att uppskatta nålinsättningens djup. När nålinsättningen är klar ska blodet börja flöda från kranskärlen. Använd tejp för att fixera injektionsnålen på plattan och öka pumphastigheten till en milliliter per minut.Om hjärtat perfused framgångsrikt, bör flödet av bufferten i kapillären vara synligt strax under epicardium. Efter två till tre milliliter CIB-EGTA perfusion, ersätt perfusionsbufferten med enzymblandning. Efter att en till två milliliter har perfused, öka pumphastigheten till 1,5 milliliter per minut.Använd en pipett för att avlägsna det ackumulerade blodinnehållande perfusatet som strömmar från hjärtat vid behov och stoppa perfusionen när den totala volymen perfuserat enzym når 10 milliliter. I slutet av perfusionen, överför 10 milliliter enzymblandning från sprutan till en 60 millimeters odlingsform på en värmematta och tillsätt 20 milligram BSA till skålen. Snurra försiktigt skålen för att lösa upp pulvret och ta bort injektionsnålen och klämman från hjärtat.Ta bort ventriklarna och atria från hjärtat och placera vävnaderna i den BSA-kompletterade enzymblandningen. För att isolera ventrikulära myocyter, använd två par pincett för att greppa epicardiumet och försiktigt dra ventriklarna i små bitar. När alla ventrikelfragment har genererats, sprid cellerna cirka 30 gånger med skonsam pipetting och filtrera det osmälta skräpet genom en 100 mikron mesh cell sil i ett 15 milliliter centrifuge rör.Efter centrifugation, återanvänd kardiomyocyt pellet i förvärmda CIB kompletteras med kalcium och BSA och inkubera cellerna i fem minuter vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, centrifugera cellerna igen och återanvänd de fällda kardiomyocyterna i en lämplig volym cell återupplivningslösning för deras underhåll vid 37 grader Celsius fram till nedströms analys. För att isolera de förmaksflimmer myocyterna, överför atria till en behållare med förvärmda CIB kompletteras med kalcium och BSA och riva atria i bitar som visats.Använd en 20 mikroliterpipett inställd på 10 mikroliter för att störa vävnaderna genom att pipettera och samla de dissocierade cellerna genom centrifugering. Återanvänd sedan förmakscellen i en lämplig volym cell återupplivning lösning. I denna bild kan nyligen isolerade Ventrikulärt myocyter observeras.Denna isolering förfarande resulterar i en 70 till 80%utbyte av stav-formade quiescent Ventrikulärt myocyter från åtta till 10 veckor gamla möss inom ungefär fem timmar efter isolering. Förhållandet mellan nyisolerade livskraftiga celler är lägre hos möss som är äldre än två år. De åtgärdspotentialer som registreras i ventrikulära och förmaksflimmer myocyter liknar dem som mäts i celler som erhållits med den Langendorff-baserade metoden.Immunostaining analys kan användas för att bedöma organisationen av den sarkomiska strukturen i ventrikulära myocyter och omvandlingen av hjärt fibroblaster till myofibroblaster efter subkultur. Western blot analys rekommenderas för att bestämma det specifika uttrycket av proteiner av intresse i atria och ventriklarna efter bearbetning. Efter perfusion med enzymer kan proteiner från atria och ventriklar enkelt homogeniseras i lysbuffert med ljuskraft för proteinextraktion.Det är viktigt att kontrollera nålinsättningens riktning och djup. När du sätter in nålen i den vänstra ventrikeln, var försiktig så att du inte genomtränger ventrikulär septum eller tränger in i ventilen. Du kan ändra sammansättningen av perfusatet beroende på syftet med experimentet.Till exempel kan ett EGTA-kompletterat tvättmedel användas för att göra en cellfri byggnadsställning av hjärtat.

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

En förbättrad metod av RNA Isolering från Loblolly Pine ( P. taeda L.) och andra arter av barrträd

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolering och odling av pulmonell endotelceller från neonatala möss

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

En Alternant metod till den traditionella NASA bakdelen Lossning modell hos möss

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering av råttfibroblaster portalen<em&gt; In situ</em&gt; Leverperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering av humana hepatocyter med två steg kollagenas perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Metoder för isolering, kultur, och funktionell karakterisering av sinusknutan Myocyter från vuxna möss

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion som en metod för vaskulär visualisering i<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

En enkel hög verkningsgrad protokoll för bukspottskörteln ö isolering från möss

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Kärnorolering från helvävnad med hjälp av ett rengöringsmedel och enzymfri metod

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...