Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل ريثيرا، ومشروع MIUR 2017K55HLC_006، ومنحة 5 × 1000 من أسوسيازيون إيطاليانا رايسركا سول كانكرو (AIRC). تم الحصول على التترامر التالي من خلال مرفق تترامر المعاهد القومية للصحة: APC-مترافق H-2K (د) هفوة فيروس نقص المناعة البشرية 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

أ. فولغوري وس. كابوني هما موظفان في شركة Reithera Srl. A. نيقوسيا تم تسميته مخترعا في طلب براءة الاختراع WO 2005071093 (A3) "حاملات لقاح فيروس الشمبانزي الغدي". وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.

على الرغم من أن التوسع في الخلايا التائية قد درس بشكل مكثف ، إلا أن بعض الجوانب لا تزال غير معروفة ، ويرجع ذلك في الغالب إلى أن الأدوات المتاحة للتحقيق فيها قليلة ولها عيوبها الخاصة. من هذا المنظور، وضعنا طريقة حساسة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتحليل دورة الخلية من خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في الأوقات المبكرة بعد التطعيم في نموذج الماوس. ويستند البروتوكول على مزيج من Ki67 وتلطيخ الحمض النووي، والتي كانت تستخدم سابقا لتحليل دورة الخلية من الخلايا الدموية BM في الفئران13،14. لتكييف البروتوكول مع خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد ، كان علينا النظر في عدد قليل من القضايا الحرجة ، بما في ذلك اختيار صبغة الحمض النووي ، والظروف المناسبة للحصول على تلطيخ الحمض النووي القابل للمقارنة عبر عينات مختلفة ، واستراتيجية gating لتحليل البيانات.
تتوفر العديد من الأصباغ لتلطيخ الحمض النووي، بما في ذلك البروبيديوم يوديد و 7-أميناكتينوميسين D. اخترنا Hoechst لأنه كان متوافقا مع تلطيخ الغشاء وبروتوكول التثبيت / permeabilization خفيفة المطلوبة لتلطيخ Ki67. في الوقت نفسه ، سمح لنا التلطيخ مع Hoechst بالحصول على مخطط بياني للحمض النووي بجودة ممتازة ، أي أن قمم G0/ G1 و G2/ M الحمض النووي كان لها معامل أقل بكثير من الاختلاف (CV) من قمم الحمض النووي التي يتم الحصول عليها عادة مع أصباغ الحمض النووي الأخرى ، على سبيل المثال ، DRAQ519. في الواقع، Hoechst يمكن وصمة عار الحمض النووي حتى في الخلايا الحية20.
واستخدمت بعض الاستراتيجيات لتجنب التقلبات في كثافة Hoechst في عينات مختلفة من نفس التجربة. تم إجراء تلطيخ Hoechst قبل الحصول على العينة مباشرة في مقياس التدفق الخلوي لتقليل انخفاض كثافة الصبغة خلال الوقت. بالنسبة للمهتمين بإعادة إنتاج البروتوكول في تجارب كبيرة مع العديد من العينات ، نوصي بإجراء تلطيخ Hoechst على عينات قليلة في كل مرة. عيب واحد آخر هو أن كثافة Hoechst يمكن أن تتأثر بشدة برقم الخلية أثناء الحضانة مع الصبغة. لهذا السبب، نوصي بشدة دائما باستخدام نفس العدد من الخلايا ونفس الحجم لكل عينة لتلطيخ الحمض النووي. إذا كان هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا للحصول على مقياس التدفق الخلوي، نوصي بإعداد عينتين متطابقتين أو أكثر ثم دمجها قبل خطوة تلطيخ Hoechst مباشرة.
وتتمثل إحدى النقاط الرئيسية للبروتوكول في استراتيجية تحليل البيانات. نشرنا مؤخرا استراتيجية جديدة لتحليل الخلايا التائية في الأوقات الأولى من الاستجابة المناعية ، والتي سمحت لنا بزيادة حساسية الكشف عن الخلايا التائية الخاصة بالمضاد12. وطبقنا هذه الاستراتيجية على البيانات المبينة هنا على النحو التالي. أولا، استبعدنا مجاميع الخلايا في مؤامرة الحمض النووي A/W. ثانيا، بعد إخراج الخلايا الميتة، استخدمنا بوابة كبيرة إلى حد ما للخلايا اللمفاوية في مؤامرة FSC/SSC ("بوابة مريحة"). من خلال هذه الاستراتيجية، تمكنا من تضمين خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد المنشط للغاية في S-G2/M التي عادة ما تفوتها استراتيجيات gating الحالية، حيث أن هذه الخلايا لديها FSC-A و SSC-A عالية. وباختصار، يمثل تحليل البيانات جزءا حاسما من الطريقة، وهو أمر ضروري للحصول على كشف حساس للخلايا التائية المنشطة/المتكاثرة الخاصة بالمضاد.
وتمنع هذه الطريقة إمكانية فقدان بيانات الخلايا التائية الحرجة في المراحل المبكرة من الاستجابة المناعية وتفتح آفاقا جديدة لرصد المناعة للخلايا التائية. قد يكون التحسن المستقبلي هو تضمين تلطيخ فوسفو-هيستون 3 الذي من شأنه أن يسمح بالتمايز بين G2 و M21. القيد الحالي هو أن الخلايا يجب أن تكون ثابتة و permeabilized وصمة عار للعلامة النووية، Ki67. وبالتالي، لا يمكن استخدام الخلايا لأنواع أخرى من التحليل مثل الفرز والتحليل الوظيفي اللاحق. وعلاوة على ذلك، فإن أصباغ الحمض النووي، بما في ذلك هويشست، تتداخل عادة مع تحليل الحمض النووي الجينومي ولا تصلح لهذا النوع من التقييم. تحديد علامات الغشاء التي ترتبط مع مراحل دورة الخلية المختلفة التي يمكن أن تكون ملطخة على الخلايا الحية يمكن التغلب على هذا القيد. في الختام، فإن هذه الطريقة لديها إمكانات كبيرة لتقييم الخلايا التائية المنشطة / المنتشرة في عدة سياقات مثل التطعيم والعدوى والأمراض بوساطة المناعة والعلاج المناعي.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

الخلايا التائية السذاجة تخضع للتوسع اللاستنساخي والتمايز على مستضد فتيلة. تعرض الخلايا التائية المتمايزة وظائف التأثير الضرورية لإزالة المستضد والحفاظ على ذاكرة خاصة بالمضاد ، وهو أمر أساسي للحماية طويلة الأمد. خلال الخطوات الأولى من الاستجابة الأولية ، فإن تفاعل الخلايا التائية الساذجة مع الخلايا التي تقدم المستضد (APCs) داخل منافذ متخصصة في الأعضاء اللمفاوية أمر بالغ الأهمية للحث على انتشار الخلايا التائية الضخم الذي يميز مرحلة التوسع اللاستنساخي1و2و3. T التفاعل بين الخلية APC وينظم بدقة بتركيز واستمرار مستضد, إشارات المحفزة المشتركة, والعوامل القابلة للذوبان (السيتوكينات وchemkines) التي تؤثر على كمية ونوعية ذرية الخلية التائية4,5,6,7.
على الرغم من الدراسات المكثفة للتوسع في الخلايا التائية، لا يزال من غير المعروف ما إذا كانت الخلايا التائية التي تستعد للمضاد تكمل دورة الخلية بأكملها في موقع التعرف على المستضد، أو ما إذا كانت تهاجر إلى أعضاء أخرى أثناء تطور دورة الخلية. ويرجع هذا النقص في المعرفة إلى خصائص الأدوات المتاحة لتحليل دورة الخلية. وتشمل هذه الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) المحددة للعلامة النووية، Ki67، وأصباغ الخلايا التي تحدد إما الخلايا التي خضعت للمرحلة S من دورة الخلية (على سبيل المثال، بروموديوكسيوريدين (BrdU)) أو تميز بين الخلايا الابنة وأسلافها (على سبيل المثال، إستر الكربوكسي فلووريسين succinimidyl (CFSE)).
ومع ذلك ، فإن صبغات وسم الخلايا ، مثل CFSE و BrdU ، لا تسمح بتحديد ما إذا كانت الخلايا الموجودة في جهاز معين انتشرت محليا أو بالأحرى هاجرت إلى هذا الموقع بعد القسم8،9. وعلاوة على ذلك، فإن البروتين داخل النووية، Ki67، قادر فقط على التمييز بين الخلايا في G0 (الخلايا السلبية Ki67) وتلك الموجودة في أي مرحلة أخرى من مراحل دورة الخلية (خلايا إيجابية Ki67). وبالتالي، لا يميز تحليل Ki67 الخلايا في الانتشار النشط (أي في S أو G2أو M) عن تلك الموجودة في G1، والتي قد تتقدم بسرعة إلى التقسيم أو تبقى لفترات طويلة في G1 أو تعود إلى الهدوء10،11.
هنا، ونحن نصف طريقة جديدة تدفق الخلايا لتحليل دورة الخلية من الخلايا التائية CD8 مستضدمحددة 12 من الطحال والغدد الليمفاوية (LNs) من الفئران تطعيم(الشكل 1). هذه الطريقة يستغل مزيجا من Ki67 وتلطيخ الحمض النووي التي كانت تستخدم سابقا لتحليل دورة الخلية من نخاع العظام الماوس (BM) خلايا الدم13،14. هنا، ونحن طبقت بنجاح Ki67 بالإضافة إلى تلطيخ الحمض النووي، جنبا إلى جنب مع استراتيجية مبتكرة نشرت مؤخرا gating12،لتحليل CD8 T توسيع الخلية التخفي. كنا قادرين على التمييز بوضوح بين خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في G0، في G1، وفي مراحل S-G2/ M في الطحال واستنزاف ال LNs من الفئران الملقحين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

تم فحص دورة الخلية من الخلايا التائية الخاصة بالمضاد في الجسم الحي باستخدام عدد قليل من الطرق ، وكلها تمتلك بعض القيود. برومودوكسيوريدين (BrdU) علامات الخلايا التي هي في أو الانتهاء مؤخرا S-المرحلة, وcarboxyfluorescein succinimidyl إستر (CFSE) يكشف الخلايا ابنة بعد الانقسام. ومع ذلك، لا تسمح هذه الأصباغ بتحديد مرحلة دورة الخلية في وقت التحليل. نهج بديل هو استغلال Ki67، علامة التي يتم التعبير عنها بشكل كبير من قبل الخلايا في جميع مراحل دورة الخلية باستثناء المرحلة هادئة G0. لسوء الحظ، لا يسمح Ki67 بمزيد من التمايز لأنه لا يفصل الخلايا في مرحلة S التي تلتزم بالإصابة بالميتوسيس عن تلك الموجودة في G1 التي يمكن أن تبقى في هذه المرحلة، أو المضي قدما في ركوب الدراجات ، أو الانتقال إلى G0.
هنا، ونحن نصف طريقة تدفق القياسات الخلوية لالتقاط "لقطة" من الخلايا التائية في مراحل دورة الخلية المختلفة في أجهزة الماوس اللمفاوي الثانوي. هذه الطريقة تجمع بين Ki67 وتلطيخ الحمض النووي مع مجمع التوافق الهستوباتية الرئيسية (MHC) - الببتيد متعدد الحشرات واستراتيجية مبتكرة gating ، مما يسمح لنا للتمييز بنجاح بين خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد في G0، في G1 وفي مراحل S-G2/ M من دورة الخلية في الطحال واستنزاف الغدد الليمفاوية للفئران بعد التطعيم مع ناقلات الفيروسات التي تحمل هفوة مستضد نموذجي لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV)-1.
وكانت الخطوات الحاسمة للطريقة هي اختيار صبغة الحمض النووي واستراتيجية اللغات لزيادة حساسية المقايسة وتضمين الخلايا التائية ذات المضادات الخاصة بالنضد التي كانت ستفوتها المعايير الحالية للتحليل. وقد مكنتنا صبغة الحمض النووي Hoechst 33342 منالحصولعلى تمييز عالي الجودة بين قمم الحمض النووي G 0 /G1 و G2/M ، مع الحفاظ على الغشاء والتلوين داخل الخلايا. وبهذه الطريقة إمكانات كبيرة لزيادة المعرفة حول استجابة الخلايا التائية في الجسم الحي وتحسين تحليل الرصد المناعي.

تم تحليل مراحل دورة الخلية من الخلايا من الطحال، LNs، وBM من الفئران بالب / ج باستخدام صبغ الحمض النووي الفلورسنت، Hoechst، ومكافحة Ki67 ماب، وفقا للبروتوكول ملخصة في الشكل 1. سمح هذا التلطيخ بتمايز الخلايا في المراحل التالية من دورة الخلية: G0 (Ki67neg، مع 2N من الحمض النووي المعرفة باسم DNAlow)، G1 (Ki67pos، DNAlow)، و S-G2/M (Ki67pos، مع محتوى الحمض النووي تتألف بين 2N و 4N، أو يساوي 4N من الحمض النووي المعرفة باسم DNAintermediate/high).
قمنا أولا بتحليل دورة الخلية لخلايا BM لإعادة إنتاج النتائج المنشورة سابقا13و14 ثم قمنا بتحليل الخلايا ذات الاهتمام ، أي خلايا CD8 T. ويبين الشكل 2 مثالا نموذجيا لتحليل دورة الخلية لخلايا BM (الشكل 2A). وأسفر البروتوكول عن معامل منخفض للتباين (CV) يبلغ ذروته في G0/G1 و G2/M DNA ، مما يشير إلى الجودة الممتازة لتلطيخ الحمض النووي(الشكل 2B، مما يدل على مثال مع السيرة الذاتية < 2.5 ؛ السيرة الذاتية كانت دائما < 5 في جميع التجارب).
ثم طبقنا نفس البروتوكول على خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد من الفئران الملقحة. تم تطعيم الفئران BALB / c ضد هفوة مستضد فيروس نقص المناعة البشرية-1 باستخدام تشاد3-هفوة ل فتيلة وMVA-gag لتعزيز، وكلاهما مصممة لحمل هفوة فيروس نقص المناعة البشرية-1. في اليوم (د) 3 بعد دفعة، قمنا بتحليل وتيرة الخلايا التائية CD8 الخاصة بالهفوة من الطحال واستنزاف LNs. لقد استفدنا من استراتيجية الغاينج المحددة حديثا للخلايا التائية في المرحلة المبكرة من الاستجابة المناعية ، والتي على النقيض من الاستراتيجية التقليدية ، مناسبة للكشف عن خلايا CD8 T المستجيبة للمضاد عالية التنشيط12. نفذنا الاستراتيجية الجديدة في خمس خطوات لاحقة. في الخطوة 1، استبعدنا doublets أو المجاميع بواسطة بوابة DNA-A/-W، وفي الخطوة 2، حددنا الخلايا الحية عن طريق استبعاد علامة الخلية الميتة. في الخطوة 3، حددنا السكان من مصلحة باستخدام غير التقليدية "استرخاء" FSC-A/ SSC-A بوابة(الشكل 3A) بدلا من بوابة الخلايا الليمفاوية الضيقة الكنسي12. بعد gating على CD3+CD8+ الخلايا (الخطوة 4 من الشكل 3A)،حددنا الخلايا CD8 T الكمامة محددة باستخدام اثنين من multimers MHC مختلفة، أي، بنت هفوة وتيتر هفوة (الخطوة 5 من الشكل 3A). استخدمنا اثنين من multimers بدلا من واحد لتحسين حساسية الكشف عن الخلايا CD8 T الكمامة محددة في الفئران المطعمة، دون زيادة خلفية تلطيخ في الفئران غير المعالجة(الشكل 3B و C،الخطوة 5). وهكذا، نجحنا في تمييز الفئران غير المعالجة (0.00٪ و 0.00٪ خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في LNs والطحال، على التوالي) من الفئران الملقحة (0.46٪ و 0.29٪ خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في LNs والطحال، على التوالي، الشكل 3B و C).
وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول سمح لنا بالحصول على خلفية منخفضة للغاية في بوابة خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد من LNs وطحال الفئران غير المعالجة (عادة 0.00٪ وبحد أقصى 0.02٪). وأظهرت المقارنة بين الكمامة المحددة وليس الكمامة محددة FSC-A / SSC-A المؤامرات أن الخلايا الخاصة الكمامة لديها عالية SSC-A و FSC-A (الشكل 3D)، مما يؤكد الحاجة إلى استخدام "استرخاء" FSC-A/ SSC-A بوابة لالتقاط هذه الخلايا. ثم قمنا بتقييم النسب المئوية للخلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في مراحل دورة الخلية المختلفة(الشكل 4A). وجدنا أن خلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في الطحال وأكثر من ذلك في LNs المستنزفة تحتوي على نسبة عالية من الخلايا في مراحل S-G2/ M في اليوم 3 بعد الدفعة (18.60٪ و 33.52٪، على التوالي).
وعلاوة على ذلك، وجدنا أن خلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في مراحل S-G2/M كان لها FSC-A و SSC-A عالية، عندما تم تراكبها على إجمالي خلايا CD8 T من نفس الجهاز(الشكل 4B). كان التعبير CD62L بواسطة خلايا CD8 T الخاصة بالهفوة منخفضا ، كما هو متوقع للخلايا التائية المنشطة ، باستثناء عدد قليل من الخلايا في G0 في LNs (الشكل 4C). وإجمالا، أكدت هذه النتائج أن البوابة "المريحة" (الخطوة 3 من الشكل 3A وB وC)كانت مطلوبة لتشمل جميع خلايا CD8 T الخاصة بالمستضداتالمنتشرة 12. كان البروتوكول قيما للغاية لتقييم "لقطة" لمراحل دورة الخلية من خلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في وقت التحليل والتعبير CD62L بواسطة الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> الشكل 1: مخطط البروتوكول لتحليل دورة الخلية للخلايا التائية CD8 الخاصة بالمضاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> الشكل 2: تحليل دورة الخلية من خلايا BM. تم تلوين خلايا BM من فئران Balb/c غير المعالجة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ) مثال على استراتيجية الصياغة. نحن بوابات على خلايا واحدة في مؤامرة الحمض النووي A / W (يسار) وبعد ذلك على الخلايا الحية عن طريق استبعاد صبغ الخلايا الميتة (وسط). ثم تم استخدام بوابة FSC-A/SSC-A "المريحة" لجميع خلايا BM (يمين). (ب) مثال تحليل دورة الخلية لخلايا BM (يسار). استخدمنا مزيجا من Ki67 وتلطيخ الحمض النووي لتحديد الخلايا في المراحل التالية من دورة الخلية: G0 (الربع الأيسر السفلي، خلايا Ki67neg-DNAlow)، G1 (الربع الأيسر العلوي، Ki67pos-DNAlow)، S-G2/M (الربع الأيمن العلوي، Ki67pos-DNAintermediate/high). يتم عرض سيطرة الفلوريس ناقص واحد (FMO) على Ki67 mAb (وسط) ومس الرسم البياني للحمض النووي (يمين). في مؤامرة مخطط الحمض النووي، تتوافق البوابتين اليسرى والأي اليمنى مع G0/G1 وذروة الحمض النووي G2/M، على التوالي، وتمثل الأرقام معاملات الاختلاف (CV) لكل قمة. في جميع المؤامرات الأخرى، تمثل الأرقام نسب الخلية في البوابات المشار إليها. ويبين الشكل تجربة تمثيلية واحدة من أصل 5 تجارب. في كل تجربة، قمنا بتحليل خلايا BM المجمعة من 3 فئران. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> الشكل 3:تحليل خلايا CD8 T الخاصة بمضادات الضد من LNs والطحال. تم تجهيز الفئران بالب / ج عضلي (ط.m.) مع تشاد3 هفوة وعززت ط.m. مع MVA-gag. في اليوم الثالث بعد التعزيز، تم تلوين واستنزاف خلايا LN والطحال من فئران التحكم الملقحة وغير المعالجة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ) مخطط استراتيجية التنغيق في خمس خطوات لتحديد الخلايا المفردة (الخطوة 1)؛ الخلايا الحية (الخطوة 2)؛ الخلايا اللمفاوية (الخطوة 3)؛ خلايا CD8 T (الخطوة 4)؛ وخلايا خاصة بالتكميم (الخطوة 5). (ب-ج) مثال على المؤامرات: تحليل الخلايا من (B) LNs و (C) طحال الفئران غير المعالجة (العلوية) والملقحين (السفلية). حددنا خلايا واحدة على مؤامرة الحمض النووي A / -W في الخطوة 1. ثم، في الخطوة 2، اخترنا الخلايا الحية عن طريق استبعاد صبغة الخلية الميتة. في الخطوة 3، استخدمنا بوابة "مريحة" غير قانونية للخلايا الليمفاوية. في الخطوة 4، حددنا خلايا CD8 T من خلال تعبيرها المزدوج عن CD3 و CD8. ثم حددنا خلايا محددة الكمامة وليس الكمامة محددة في الخطوة 5، على أساس قدرتها على ربط fluorochrome المسمى H-2kd-gag-Pentamer (بنتامر بنتامر) وH-2kd-gag-Tetramer (تيتر-هفوة)، أم لا، على التوالي. (د) ملفات تعريف FSC-A/SSC-A للخلايا (الزرقاء) الخاصة بالكمامة وليس الخلايا (الرمادية) الخاصة بالكمامة بعد الالتهاز كما هو موضح أعلاه. تمثل الأرقام نسب الخلية في البوابات المشار إليها. ويبين الشكل تجربة تمثيلية واحدة من أصل 5 تجارب. في كل تجربة، قمنا بتحليل الطحال المجمع وتجميع خلايا LN من 3 فئران تم تطعيمها و3 فئران غير معالجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> الشكل 4: تحليل دورة الخلية من خلايا CD8 T الخاصة مستضد. تم تطعيم الفئران كما هو الحال في الشكل 3 وتم إجراء تحليل دورة الخلية للخلايا الخاصة بالهفوة في اليوم 3 بعد التعزيز ، بعد أن تم إجراء 5 خطوات كما هو الحال في الشكل 3. (أ)مثال على تحليل دورة الخلية للخلايا CD8 T الخاصة بالهفوة من LNs (أعلى) والطحال (أسفل) الفئران الملقحة. تم تحديد مراحل دورة الخلية كما في الشكل 2B. تمثل اللوحات خلايا في G0، في G1، وفي S-G2/ M (يسار) وتحكم Fluorescence Minus One (FMO) في Ki67 mAb (يمين). تمثل الأرقام نسب الخلية في البوابات المشار إليها. (ب) FSC-A/SSC-A نقطة المؤامرات التي تظهر الخلايا التائية CD8 الكمامة محددة في مراحل S-G2/M (باللون الأحمر) مضافا إليها على مجموع CD3+CD8+ T الخلايا (باللون الرمادي) من LNs (أعلى) والطحال (أسفل) الفئران المطعمة. (ج) تعويض المدرجات التكرارية التي تظهر التعبير CD62L بواسطة خلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في G0 (الأخضر)، وفي G1 (الأزرق)، وفي S-G2/M (أحمر) من LNs (أعلى) والطحال (أسفل) الفئران المطعمة. تشير المحاور y إلى عدد الأحداث التي تم تسويتها. ويبين الشكل مثالا تمثيليا من أصل 5 تجارب مستقلة أجريت على ما مجموعه 15 فأرا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
المواد التكميلية: إعدادات مقياس التدفق الخلوي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

التوسع كلونال هو سمة رئيسية للاستجابة الخلية التائية الخاصة مستضد. ومع ذلك، فإن دورة الخلية من الخلايا التائية المستجيبة للمضاد قد تم التحقيق فيها بشكل سيئ، ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود التقنية. نحن نصف طريقة تدفق القياسات الخلوية لتحليل Clonally توسيع خلايا CD8 T مستضد محددة في الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران المطعمة.

فحص قياس الخلايا التدفقي القائم على الحمض النووي/Ki67 لتحليل دورة الخلية لخلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في الفئران الملقحة

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

يوفر بروتوكولنا نهجا عمليا يمكن من خلاله استخدام طحال الفأر والغدد الليمفاوية لتعكس ديناميكية استجابة الخلايا التائية أكبر من توفير لقطة فينوتبيك ثابتة الحالة. تقنيتنا بالكشف بحساسية مستضد محددة CD8 الخلايا التائية التي تشارك في الاستجابة الجارية. يتم قياس الخلايا التائية CD8 المنتشرة دون الآثار المحيرة المحتملة للعلاج الدوائي في الجسم الحي أو نقل الخلايا.يمكن لتقنيتنا أن توفر نافذة في ديناميكيات المناعة في عدة إعدادات. على سبيل المثال، فيما يتعلق بالاستجابة للتطعيم والعدوى، وأمراض المناعة الذاتية، والعلاج المناعي للسرطان. إعداد الطازجة 1x permeabilization غسل العازلة عن طريق تخفيف 10x permeabilization العازلة مع الماء المقطر وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر للقضاء على المجاميع.تمييع الأجسام المضادة أحادية النسيلة Ki67 FITC في 1x permeabilization غسل العازلة كما هو محدد مع تجربة المعايرة لحجم نهائي من 100 ميكرولتر لكل عينة. أضف 3 ملليلترات من حاجز غسل permeabilization 1x إلى كل أنبوب مع الخلايا والطرد المركزي في 400 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق.مرة أخرى، إضافة 1x permeabilization غسل العازلة والطرد المركزي لبيليه الخلايا. ثم، تجاهل العملاق. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المخفف Ki67 FITC إلى بيليه، ثم دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام.بعد الحضانة، اغسل الخلايا مرتين مع 4 ملليلتر من العازلة permeabilization 1x، الطرد المركزي بعد كل غسل، والتخلص من supernatant. إضافة 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى بيليه الخلية لعينات ليتم الحصول عليها مباشرة في تدفق السيتومتر و 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى بيليه الخلية لعينات ليتم احتضانها مع Hoechst لتلطيخ الحمض النووي. إعداد Hoechst و PBS الحل وإضافته إلى كل عينة بحيث يكون التركيز النهائي اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر.دوامة واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم، طرد مركزي العينات لمدة خمس دقائق وإضافة 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى بيليه الخلية. افتح البرنامج وإنشاء مجموعات مختلفة مطابقة للأجهزة المختلفة لتحليلها بالنقر فوق إنشاء مجموعة"في مقطع شريط مساحة العمل.افتح إطار المجموعة المعدلة بالنقر المزدوج على اسم المجموعة ومزامنة المجموعات التي تم إنشاؤها حديثا عن طريق إدراج علامة اختيار على الدالة المتزامنة. اسحب كل ملف FCS إلى المجموعة المقابلة، ثم قم بإنشاء استراتيجية gating بدءا من مجموعة LN. افتح إطار الرسم البياني بالنقر المزدوج فوق العينة الملطخة بالكامل لعرض الأحداث غير المحصل عليها التي تم الحصول عليها للعينة في رسم نقطة.لاحظ أن المحورين س و ص يتم تصنيفهما كما في ملفات FCS، كما هو مبين في الجدول الثاني من ملف إعدادات مقياس التدفق الخلوي لهذه المخطوطة. تحقق من عرض عدد كاف من الأحداث للتصور المناسب. إذا لزم الأمر، افتح التفضيلات بالنقر فوق رمز القلب في شريط مساحة العمل، وحدد الرسوم البيانية، ثم دوت بلوت"كنوع الرسم البياني، وتحقق من أن عدد النقاط المرسومة في المربع المقابل صحيح أو تغييره.عرض الأحداث غير المغضى بها في إطار الرسم البياني في رسم نقطة مع DNA-A على المحور س والحمض النووي W على المحور ص. استخدم مقياس خطي لكلا المحورين. إذا لزم الأمر تغيير مقياس من لوغاريتمية إلى خطية بالنقر على المربع المشار إليه مع T قريبة من كل محور في إطار الرسم البياني.حدد مجموعة خلايا مفردة بالنقر فوق مستطيل في قسم أداة gating ثم انقر نقرا مزدوجا فوق في وسط البوابة المستطيلة لعرض خلايا مفردة في مخطط نقطة مع المعلمة FSC-A على المحور س والخلية الميتة يموت على المحور ص. انقر على المضلع لتحديد السكان الخلية الحية، والتي هي سلبية للموت الخلية الميتة. انقر نقرا مزدوجا فوق في وسط بوابة المضلع لعرض الخلايا في رسم نقطة مع المعلمة FSC-A على المحور س والمعلمة SSC-A على المحور ص.انقر على المستطيل وإنشاء بوابة مريحة لتشمل جميع الخلايا الحية واحدة في هذا الرسم البياني. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة المريحة لعرض الخلايا في رسم نقطة مع CD3 على المحور س وCD8 على المحور ص. استخدم مقياس الوصول المناسب للتصور في إطار الرسم البياني.إذا لزم الأمر، قم بتعديل مقياس x و y بالنقر فوق المربع، المشار إليه ب T بالقرب من كل محور، واختر تخصيص وظيفة Access، وتعديل عقود neg الإضافية مع القواعد والعقود الإيجابية حسب الضرورة. حدد خلايا CD3+CD8+بالنقر فوق المضلع. انقر نقرا مزدوجا فوق في وسط بوابة CD3+CD8+لعرض الخلايا في رسم نقطة مع Tetr-gag على المحور س وخمامة Pent على المحور ص.حدد مستضد خلايا CD8 T محددة عن طريق النقر على المضلع. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة الخاصة بالهفوة لعرض الخلايا في مؤامرة نقطة مع DNA-A على المحور س وKi67 على المحور ص. حدد الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة عن طريق النقر على رباعية "في قسم أداة gating من إطار الرسم البياني.نسخ استراتيجية gating التي تم إنشاؤها في عينة واحدة إلى المجموعة المقابلة لتطبيق البوابات على كافة عينات المجموعة. ثم نسخ استراتيجيات gating لمجموعات ب الطحال وCBM ، كما هو موضح في المخطوطة النصية. تحقق من أن كافة البوابات مناسبة لكل عينة من المجموعات الثلاث.إذا لزم الأمر، قم بإزالة تزامن المجموعة وتعديل البوابات كما هو موضح في المخطوطة. عرض خلايا BM من البوابة استرخاء في مؤامرة نقطة مع الحمض النووي-A على المحور س وKi67 على المحور ص. تصور النتائج بالنقر على محرر تخطيط"في قسم شريط مساحة العمل.اسحب كل بوابة من استراتيجية gating في جزء العينة إلى محرر التخطيط ووضع المؤامرات وفقا لتسلسل gating. إذا لزم الأمر، قم بتغيير نوع الرسم البياني بالنقر المزدوج على الرسم المطابق في التخطيط وتحديد النوع المناسب في إطار تعريف الرسم البياني. انقر على المجموعة ويكرر حسب الوظائف على الشريط تخطيط لتصور النتائج التي تم الحصول عليها في خلايا CD8 T مستضد محددة من كل جهاز ومقارنة عينات مختلفة.تصور نتائج خلايا نخاع العظم التي تمثل تحكما إيجابيا. يظهر هنا مثال نموذجي لتحليل دورة الخلية لخلايا نخاع العظم. وأسفر البروتوكول عن معامل منخفض للتباين بين G0 و G1 و G2 إلى M قمم الحمض النووي، مما يشير إلى جودة ممتازة لتلطيخ الحمض النووي.واستخدمت استراتيجية لتكئة الخطوات الخمس لتحديد خلايا CD8 محددة مستضد. تم استخدام اثنين من multimers لتحسين حساسية الكشف عن الخلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في الفئران الملقحة دون زيادة خلفية التلطيخ في الفئران غير المعالجة. تحتوي خلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في الغدد الليمفاوية المستنزفة وفي الطحال على نسبة عالية من الخلايا في مراحل S-G2/M في اليوم الثالث بعد الدفعة.وعلاوة على ذلك، كان خلايا CD8 T الخاصة بالكمامة في مراحل S-G2/M عالية FSC-A و SSC-A عندما تم تراكبها على إجمالي خلايا CD8 T من نفس الجهاز. وأظهرت الرسوم التوضيحية تعويض أن التعبير CD62L بواسطة خلايا CD8 T الخاصة بالكمامة منخفضة، كما هو متوقع للخلايا التائية المنشطة، باستثناء عدد قليل من الخلايا في G0 في الغدد الليمفاوية. تم تصميم هذه الطريقة للخلايا التائية لتحقيق نوعية ممتازة من تلطيخ الحمض النووي جنبا إلى جنب مع الغشاء وتلطيخ Ki67.تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي هو نقطة رئيسية. تأكد من استخدام عنصر التحكم المناسب لتحديد موقع البوابة. باستخدام هذه الطريقة، اكتشفنا الخلايا التائية في مراحل S-G2/M من دورة الخلية في الماوس والدم المحيطي البشري.كانت هذه التقنية مفيدة في دراسات مراقبة المناعة في داء السكري من النوع 1 ، وداء كريات الدم البيضاء المعدي ، و COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...