Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Reithera, af MIUR-projektet 2017K55HLC_006 og med 5 × 1000 tilskud fra Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Følgende tetramer blev opnået gennem NIH Tetramer-anlægget: APC-konjugeret H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

A. Folgori og S. Capone er ansatte i Reithera Srl. A. Nicosia er opkaldt opfinder på patentansøgning WO 2005071093 (A3) "Chimpanse adenovirus vaccine luftfartsselskaber." De andre forfattere har intet at afsløre.

Selvom T-celle klonisk ekspansion er blevet intensivt undersøgt, nogle aspekter forbliver ukendt, mest fordi de værktøjer til rådighed til at undersøge det er få og har deres egne ulemper. Fra dette perspektiv, vi oprette en meget følsom flow cytometrisk metode til at analysere cellecyklus af antigen-specifikke CD8 T-celler på tidlige tidspunkter efter vaccination i en musemodel. Protokollen er baseret på en kombination af Ki67 og DNA farvning, som tidligere blev brugt til at analysere cellecyklus af BM hæmatoopoietic celler i mus13,14. For at tilpasse protokollen til antigenspecifikke CD8 T-celler måtte vi overveje et par kritiske spørgsmål, herunder valget af DNA-farvestof, de passende betingelser for at opnå sammenlignelig DNA-farvning på tværs af forskellige prøver og gatingstrategien for dataanalyse.
Mange farvestoffer er tilgængelige for DNA farvning, herunder propidium jod og 7-aminoactinomycin D; vi valgte Hoechst, fordi det var kompatibelt med membranfarvning og den milde fiksering / permeabiliseringsprotokol, der kræves til Ki67 farvning. Samtidig gav farvning med Hoechst os mulighed for at opnå et DNA-histogram af fremragende kvalitet, dvs. at G0/G1 og G2/M DNA-toppe havde en meget lavere variationskoefficient (CV) end DNA-toppe, der normalt opnås med andre DNA-farvestoffer, f.eks. DRAQ519. Faktisk kan Hoechst plette DNA selv i levende celler20.
Nogle strategier blev brugt til at undgå udsving i Hoechst intensitet i forskellige prøver af det samme eksperiment. Hoechst farvning blev udført lige før prøve erhvervelse på flow cytometer for at minimere nedgangen i farvestof intensitet i tide. For dem, der er interesseret i at reproducere protokollen i store eksperimenter med mange prøver, anbefaler vi at udføre Hoechst farvning på et par prøver ad gangen. En anden ulempe er, at Hoechst intensitet kan være stærkt påvirket af cellenummer under inkubation med farvestoffet. Af denne grund anbefaler vi på det kraftigste altid at bruge det samme antal celler og det samme volumen pr. prøve til DNA-farvning. Hvis et stort antal celler er nødvendige for erhvervelse på flowcytometeret, anbefaler vi, at du forbereder to eller flere identiske prøver og derefter fletter dem lige før Hoechst-farvningstrinnet.
Et centralt punkt i protokollen er gating-strategien for dataanalyse. Vi har for nylig offentliggjort en ny strategi for T-celleanalyse på tidlige tidspunkter af immunresponset, som gjorde det muligt for os at øge følsomheden af påvisning af antigenspecifikke T-celler12. Vi anvendte denne strategi på de data, der er vist her som følger. For det første udelukkede vi celleaggregater i DNA-A/W-plottet. For det andet, efter gating ud døde celler, vi brugte en temmelig stor lymfocyt gate i FSC / SSC plot ("afslappet gate"). Med denne strategi var vi i stand til at inkludere stærkt aktiverede antigenspecifikke CD8 T-celler i S-G2/M, der normalt savnes af aktuelle gatingstrategier, da disse celler har høje FSC-A og SSC-A. Sammenfattende repræsenterer dataanalysen en kritisk del af metoden, som er afgørende for at opnå en følsom påvisning af aktiverede / spredte antigenspecifikke T-celler.
Metoden forhindrer muligheden for at gå glip af kritiske T-celledata i tidlige faser af immunrespons og åbner nye perspektiver for T-celle immunovervågning. En fremtidig forbedring kan være at omfatte farvning for fosfo-histone 3, der ville tillade differentiering mellem G2 og M21. En aktuel begrænsning er, at celler skal fastsættes og permeabilized at plette for den nukleare markør, Ki67. Celler kan således ikke bruges til andre typer analyser såsom sortering og efterfølgende funktionel analyse. Desuden forstyrrer DNA-farvestoffer, herunder Hoechst, normalt den genomiske DNA-analyse og er ikke egnede til denne type evaluering. Identifikation af membranmarkører, der korrelerer med forskellige cellecyklusfaser, og som kan farves på levende celler, kan overvinde denne begrænsning. Afslutningsvis har metoden et stort potentiale for evaluering af aktiverede/spredte T-celler i flere sammenhænge såsom vaccination, infektion, immunmedierede sygdomme og immunterapi.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naive T-celler gennemgår kloniske ekspansion og differentiering ved antigen-priming. Differentierede T-celler viser effektorfunktioner, der er afgørende for antigenfrigang og til vedligeholdelse af antigenspecifik hukommelse, som er nøglen til langvarig beskyttelse. Under de første trin i den primære respons, naiv T celle interaktion med antigen-præsentere celler (APC'er) inden for specialiserede nicher i lymfoide organer er afgørende for at fremkalde den enorme T-celle spredning, der karakteriserer kloniske ekspansion fase1,2,3. T-celle-APC interaktion er fint reguleret af koncentration og vedholdenhed af antigen, co-stimulerende signaler, og opløselige faktorer (cytokiner og chemokiner), der påvirker mængden og kvaliteten af T-celle klon afkom4,5,6,7.
På trods af intensive undersøgelser af T-celle kloniske ekspansion, Det vides stadig ikke, om antigen-primet T-celler fuldføre hele deres celle cyklus på stedet for antigen anerkendelse, eller om de migrerer til andre organer under celle cyklus progression. Denne mangel på viden skyldes egenskaberne ved tilgængelige værktøjer til cellecyklusanalyse. Disse omfatter monoklonale antistoffer (mAbs), der er specifikke for atommarkøren, Ki67, og cellefarvestoffer, der enten identificerer celler, der har gennemgået S-fasen af cellecyklussen (f.eks. Bromodeoxyuridin (BrdU)) eller diskriminerer mellem datterceller og deres forfædre (f.eks. carboxyfluorescein kortnimidyl ester (CFSE)).
Cellemærkningsfarvestoffer, såsom CFSE og BrdU, tillader dog ikke at afgøre, om celler, der findes i et bestemt organ, spredes lokalt eller snarere migreret til dette sted efter8. Desuden er det intranukleare protein, Ki67, kun i stand til at skelne celler i G0 (Ki67-negative celler) fra dem i enhver anden cellecyklusfase (Ki67-positive celler). Ki67-analysen skelner således ikke celler i aktiv spredning (dvs. i S, G2eller M) fra cellerne i G1, som enten hurtigt kan udvikle sig til opdeling eller blive i lange perioder i G1 eller vende tilbage til quiescence10,11.
Her beskriver vi en ny flowcytometrisk metode til cellecyklusanalyse af antigenspecifikke CD8 T-celler12 fra milten og lymfeknuderne (LN'er) hos vaccinerede mus (Figur 1). Metoden udnytter en kombination af Ki67 og DNA farvning, der tidligere blev brugt til at analysere cellecyklus af musen knoglemarv (BM) hæmatoopoietic celler13,14. Her har vi med succes anvendt Ki67 plus DNA farvning, sammen med den nyligt offentliggjorte innovative gating strategi12, til analyse af CD8 T celle kloniske ekspansion. Vi var i stand til klart at skelne mellem antigenspecifikke CD8 T-celler i G0, i G1og i S-G2/M-faser i milten og drænende LN'er for vaccinerede mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

Cellecyklussen af antigenspecifikke T-celler in vivo er blevet undersøgt ved hjælp af nogle få metoder, som alle har nogle begrænsninger. Bromodeoxyuridin (BrdU) markerer celler, der er i eller for nylig afsluttet S-fase, og carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) registrerer datterceller efter division. Disse farvestoffer tillader dog ikke identifikation af cellecyklusfasen på analysetidspunktet. En alternativ tilgang er at udnytte Ki67, en markør, der er stærkt udtrykt af celler i alle faser af cellecyklussen undtagen den hvilende fase G0. Desværre tillader Ki67 ikke yderligere differentiering, da det ikke adskiller celler i S-fase, der er forpligtet til mitose fra dem i G1, der kan forblive i denne fase, fortsætte ind i cykling eller flytte ind i G0.
Her beskriver vi en flowcytometrisk metode til at fange et "øjebliksbillede" af T-celler i forskellige cellecyklusfaser i mus sekundære lymfoidorganer. Metoden kombinerer Ki67 og DNA farvning med store histokompatibilitet kompleks (MHC)-peptid-multimer farvning og en innovativ gating strategi, så vi med succes kan skelne mellem antigen-specifikke CD8 T-celler i G0, i G1 og i S-G2/ M faser af cellecyklus i milten og dræne lymfeknuder af mus efter vaccination med virale vektorer transporterer modellen antigen gag af human immundefekt virus (HIV)-1.
Kritiske trin i metoden var valget af DNA-farvestof og gating strategi for at øge analysen følsomhed og til at omfatte stærkt aktiveret / udbrede antigen-specifikke T-celler, der ville have været savnet af de nuværende kriterier for analyse. DNA-farvestoffet, Hoechst 33342, gjorde det muligt for os at opnå en forskelsbehandling af G0/G1 og G2/M DNA-toppe af høj kvalitet, samtidig med at vi bevarede membran og intracellulære farvninger. Metoden har et stort potentiale til at øge kendskabet til T-cellerespons in vivo og til at forbedre immunovervågningsanalysen.

Cellecyklusfaserne af celler fra milt,LN'er og BM af mus i Balb/c blev analyseret ved hjælp af det fluorescerende DNA-farvestof, Hoechst, og en anti-Ki67 mAb, ifølge protokollen opsummeret i figur 1. Dennefarvning gjorde det muligt at skelne celler i følgende faser af cellecyklussen: G 0 (Ki67neg, med 2N DNA defineret som DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) og S-G2/M (Ki67pos, med et DNA-indhold bestående mellem 2N og 4N, eller lig med 4N DNA defineret som DNAintermediate/høj).
Vi udførte først cellecyklusanalyse af BM-celler for at reproducere tidligere offentliggjorte resultater13,14 og analyserede derefter cellerne af interesse, dvs. CD8 T-celler. Figur 2 viser et typisk eksempel på cellecyklusanalyse af BM-celler (Figur 2A). Protokollen gav en lav variationskoefficient (CV) på G0/G1 og G2/M DNA-toppe, hvilket indikerer den fremragende kvalitet af DNA-farvningen (Figur 2B, der viser et eksempel med CV < 2,5; CV var altid < 5 i alle eksperimenter).
Vi anvendte derefter den samme protokol på antigenspecifikke CD8 T-celler fra vaccinerede mus. BALB/c mus blev vaccineret mod antigen gag af HIV-1 ved hjælp af Chad3-gag til priming og MVA-gag for at øge, begge manipuleret til at bære HIV-1 gag. På dag (d) 3 post-boost analyserede vi hyppigheden af gag-specifikke CD8 T-celler fra milten og dræning af LP'er. Vi benyttede os af den nyligt definerede gating strategi for T-celler i den tidlige fase af immunrespons, som i modsætning til den konventionelle strategi, er egnet til at opdage stærkt aktiveret antigen-reagere CD8 T-celler12. Vi udførte den nye strategi i fem efterfølgende trin. I trin 1 udelukkede vi doubler eller aggregater med DNA-A/ -W gate, og i trin 2 identificerede vi levende celler ved udelukkelse af døde celler. I trin 3 identificerede vi befolkningen af interesse ved hjælp af en ikke-konventionel "afslappet" FSC-A / SSC-A gate (Figur 3A) i stedet for den kanoniske smalle lymfocytport12. Efter gating på CD3+CD8+ celler (trin 4 i figur 3A),identificerede vi gag-specifikke CD8 T-celler ved hjælp af to forskellige MHC multimers, dvs Pent-gag og Tetr-gag (trin 5 i figur 3A). Vi brugte to multimers i stedet for en til at forbedre følsomheden af gag-specifikke CD8 T celle afsløring i vaccinerede mus, uden at øge farvning baggrund i ubehandlede mus(Figur 3B og C, trin 5). Således skelnede vi med succes ubehandlede mus (henholdsvis 0,00% og 0,00% antigenspecifikke CD8 T-celler i LN'er og milt) fra vaccinerede mus (henholdsvis 0,46% og 0,29% antigenspecifikke CD8 T-celler i LN'er og miltceller, henholdsvis figur 3B og C).
Især gav protokollen os mulighed for at have en ekstremt lav baggrund i den antigenspecifikke CD8 T-celleport af LN'er og milt af ubehandlede mus (normalt 0,00% og højst 0,02%). Sammenligningen af gag-specifikke og ikke gag-specifikke FSC-A / SSC-A parceller viste, at gag-specifikke celler havde høj SSC-A og FSC-A (Figur 3D), bekræfter behovet for at bruge en "afslappet" FSC-A / SSC-A gate til at fange disse celler. Vi evaluerede derefter procentdelene af gag-specifikke CD8 T-celler i forskellige cellecyklusfaser (Figur 4A). Vi fandt ud af, at gag-specifikke CD8 T-celler i milten og endnu mere i de drænende LN'er indeholdt en høj andel af celler i S-G2/ M faser på dag 3 post-boost (henholdsvis 18,60% og 33,52%).
Desuden fandt vi, at gag-specifikke CD8 T-celler i S-G2/ M faser havde høje FSC-A og SSC-A, når overlejret på den samlede CD8 T-celler fra samme organ (Figur 4B). CD62L-udtrykket med gag-specifikke CD8 T-celler var lavt, som forventet for aktiverede T-celler, bortset fra nogle få celler i G0 i LN'erne (Figur 4C). Alt i alt bekræftede disse resultater, at den "afslappede" port (trin 3 i figur 3A, B og C) var forpligtet til at omfatte alle de voksende antigenspecifikke CD8 T-celler12. Protokollen var yderst værdifuld for en "snapshot" evaluering af celle cyklus faser af antigen-specifikke CD8 T-celler på tidspunktet for analysen og CD62L udtryk af celler i forskellige celle cyklus faser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Figur 1: Ordningen for protokollen til cellecyklusanalyse af antigenspecifikke CD8 T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Figur 2: Cellecyklusanalyse af BM-celler. BM-celler fra ubehandlede Balb/c mus blev farves og analyseret af flowcytometri. (A) Eksempel på gating strategi. Vi gated på enkelte celler i DNA-A /-W plot (venstre) og efterfølgende på levende celler ved døde celle farvestof udelukkelse (midten). Derefter blev en "afslappet" FSC-A / SSC-A-port brugt til alle BM-celler (højre). (B) Eksempel på cellecyklusanalyse af BM-celler (venstre). Vi brugte en kombination af Ki67 og DNA farvning til at identificere celler i følgende faser af cellecyklus: G0 (nederst til venstre kvadrant, Ki67neg-DNAlow celler), G1 (øverst til venstre kvadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/ M (øverst til højre kvadrant, Ki67pos-DNAintermediate / høj). Fluorescens Minus One (FMO) kontrol af Ki67 mAb (midten) og DNA histogram (højre) er vist. I DNA-histogrammeplottet svarer venstre og højre porte til henholdsvis G0/G1 og G2/M DNA-toppen, og tallene repræsenterer variationskoefficienterne (CV) for hver top. I alle de andre plots repræsenterer tallene celleprocenter i de angivne porte. Figuren viser 1 repræsentativt eksperiment ud af 5. I hvert eksperiment analyserede vi poolede BM-celler fra 3 mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Figur 3: Analyse af antigenspecifikke CD8 T-celler fra LN'er og milt. Balb/c mus blev primet intramuskulært (i.m.) med Chad3-gag og boostet i.m. med MVA-gag. På dag 3 efter boost blev dræning af LN- og miltceller fra vaccinerede og ubehandlede kontrolmus farves og analyseret af flowcytometri. A) Ordningen for gatingstrategien i fem trin til identifikation af enkeltceller (trin 1) levende celler (trin 2); lymfocytter (trin 3); CD8 T-celler (trin 4); og gag-specifikke celler (trin 5). (B-C) Eksempel på observationsområder: analyse af celler fra (B) LN'er og (C) milt af ubehandlede (top) og vaccinerede (nederste) mus. Vi identificerede enkelte celler på DNA-A/ -W plottet i trin 1. I trin 2 valgte vi så levende celler ved at eksklude døde celler. I trin 3 brugte vi en ikke-kanonisk "afslappet" port til lymfocytter. I trin 4 identificerede vi CD8 T-celler ved deres dobbelte udtryk for CD3 og CD8. Vi identificerede derefter gag-specifikke celler og ikke gag-specifikke i trin 5, baseret på deres evne til at binde fluorokrom-mærket H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) og H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), eller ej, henholdsvis. (D) FSC-A/SSC-A-profiler af gag-specifikke (blå) og ikke gag-specifikke (grå) celler efter gating som beskrevet ovenfor. Tal repræsenterer celleprocenter i de angivne porte. Figuren viser 1 repræsentativt eksperiment ud af 5. I hvert eksperiment analyserede vi poolede milt og samlede LN-celler fra 3 vaccinerede mus og 3 ubehandlede mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Figur 4: Cellecyklusanalyse af antigenspecifikke CD8 T-celler. Mus blev vaccineret som i figur 3, og cellecyklusanalyse af gag-specifikke celler blev udført på dag 3 efter boost efter gating i 5 trin som i figur 3. (A) Eksempel på cellecyklusanalyse af gag-specifikke CD8 T-celler fra LN'er (øverst) og milt (nederst) af vaccinerede mus. Cellecyklusfaser blev identificeret som i figur 2B. Panelerne repræsenterer celler i G0, i G1og i S-G2/M (venstre) og Fluorescens Minus One (FMO) kontrol af Ki67 mAb (højre). Tal repræsenterer celleprocenter i de angivne porte. (B) FSC-A/SSC-A prikplotter, der viser gag-specifikke CD8 T-celler i S-G2/M-faser(med rødt) overlejret på totale CD3+CD8+ T-celler (i grå) fra LN'er (øverst) og milt (nederst) af vaccinerede mus. (C) Forskydning af histogrammer, der viser CD62L-udtryk med gagspecifikke CD8 T-celler i G0 (grøn), i G1 (blå) og i S-G2/M (rød) fra LN'er (øverst) og milt (nederst) af vaccinerede mus. Y-akserne angiver det normaliserede antal hændelser. Figuren viser 1 repræsentativt eksempel ud af 5 uafhængige eksperimenter med i alt 15 mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende materiale: Flowcytometerindstillinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Kloningsudvidelse er et centralt element i antigenspecifik T-cellerespons. Imidlertid er cellecyklussen af antigenoptalende T-celler blevet dårligt undersøgt, dels på grund af tekniske begrænsninger. Vi beskriver en flow cytometrisk metode til at analysere clonally ekspanderende antigen-specifikke CD8 T-celler i milt og lymfeknuder af vaccinerede mus.

En DNA/Ki67-baseret flowcytometrianalyse til cellecyklusanalyse af antigenspecifikke CD8 T-celler i vaccinerede mus

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Vores protokol giver en praktisk tilgang, hvormed musen milt og lymfeknuder kan bruges til at afspejle dynamikken i T-celle respons større end at give en steady-state fænotyp snapshot. Vores teknik registrerer følsomt antigenspecifikke CD8 T-celler, der er involveret i en igangværende reaktion. Spredte CD8 T-celler måles uden de muligvis forvirrende virkninger af in vivo-lægemiddelbehandling eller celleoverførsel.Vores teknik kan give et vindue i immundynamik i flere indstillinger. For eksempel i forhold til reaktion på vaccination og infektioner, autoimmune sygdomme, og kræft immunterapi. Forbered frisk 1x permeabilisering vask buffer ved at fortynde 10x permeabilisering buffer med destilleret vand og filtrere det gennem en 0,45 mikrometer filter for at fjerne aggregater.Fortynd monoklonalt antistof Ki67 FITC i 1x permeabiliseringsvaskbuffer som bestemt med et titreringseksperiment for et endeligt volumen på 100 mikroliter pr. prøve. Tilsæt 3 milliliter af 1x permeabilisering vask buffer til hvert rør med celler og centrifuge ved 400 G i fem minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.Igen, tilsæt 1x permeabilization vask buffer og centrifuge at pellet cellerne. Kassér derefter supernatanten. Tilsæt 100 mikroliter fortyndet monoklonalt antistof Ki67 FITC til pelleten, og hvirvle og inkuber i 30 minutter i mørke.Efter inkubationen vaskes cellerne to gange med 4 milliliter 1x permeabiliseringsbuffer, centrifugering efter hver vask og kassér supernatanten. Der tilsættes 350 mikroliter PBS til cellepillen til prøver, der skal erhverves direkte ved flowcytometeret og 250 mikroliter pbs til cellepillen for prøver, der skal inkuberes med Hoechst til DNA-farvning. Forbered Hoechst og PBS opløsning og tilsæt den til hver prøve, så den endelige koncentration er to mikrogram pr. milliliter.Vortex og inkubere prøverne i 15 minutter i mørke. Derefter centrifugere prøverne i fem minutter og tilsæt 350 mikroliter af PBS til cellepillen. Åbn softwaren, og opret forskellige grupper, der svarer til de forskellige organer, der skal analyseres, ved at klikke på Opret gruppe", i afsnittet arbejdsområdebånd.Åbn det ændrede gruppevindue ved at dobbeltklikke på gruppenavnet, og synkroniser de nyoprettede grupper ved at markere den synkroniserede funktion. Træk hver FCS-fil til den tilsvarende gruppe, og opret derefter en gating-strategi, der starter med en LN-gruppe. Åbn grafvinduet ved at dobbeltklikke på den fuldt farvede prøve for at vise de ikke-udremerede hændelser, der er erhvervet for prøven i et prikplot.Bemærk, at x-og y-aksen er mærket som i FCS-filerne, som angivet i tabel to i flowcytometerindstillingsfilen for dette manuskript. Kontroller, at der vises et tilstrækkeligt antal hændelser til passende visualisering. Hvis det er nødvendigt, skal du åbne indstillinger ved at klikke på hjerteikonet på arbejdsområdebåndet, vælge Grafer og derefter Punktopre graf som graftype og kontrollere, at antallet af prikker, der tegnes i den tilsvarende boks, er korrekt eller ændre det.Vis de uafrmittede hændelser i grafvinduet i et prikplot med DNA-A på x-aksen og DNA-W på y-aksen. Brug lineær skala til begge akser. Hvis det er nødvendigt ændre skala fra logaritmisk til lineær ved at klikke på den boks, der er angivet med et T tæt på hver akse i grafvinduet.Vælg en enkelt cellepopulation ved at klikke på rektangel i gatingværktøjssektionen og derefter dobbeltklikke i midten af den rektangulære port for at få vist enkelte celler i et prikplot med FSC-A-parameter på x-aksen og døde celledøden på y-aksen. Klik på polygonen for at vælge den levende cellepopulation, som er negativ for døde celledød. Dobbeltklik i midten af polygonporten for at få vist cellerne i et prikplot med PARAMETEREN FSC-A på x-aksen og SSC-A-parameteren på y-aksen.Klik på rektangel og oprette en afslappet port til at omfatte alle enkelt levende celler i denne graf. Dobbeltklik i midten af den afslappede port for at få vist cellerne i et prikplot med CD3 på x-aksen og CD8 på y-aksen. Brug den relevante adgangsskala til visualisering i diagramvinduet.Hvis det er nødvendigt, skal du ændre x- og y-skalaen ved at klikke på boksen, angivet med et T tæt på hver akse, vælge Tilpas adgangsfunktion og ændre ekstra neg årtier med baser og positive årtier efter behov. Marker CD3+CD8+-cellerne ved at klikke på polygon. Dobbeltklik i midten af CD3+CD8+porten for at få vist cellerne i et prikplot med Tetr-gag på x-aksen og Pent-gag på y-aksen.Vælg de antigenspecifikke CD8 T-celler ved at klikke på polygon. Dobbeltklik i midten af den gag-specifikke port for at vise cellerne i et prikplot med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Marker cellerne i de forskellige cellecyklusfaser ved at klikke på Quad", i gatingværktøjssektionen i grafvinduet.Kopier den gating strategi, der er oprettet i et eksempel til den tilsvarende gruppe for at anvende portene på alle gruppens prøver. Kopier derefter gating strategier for b-milt og CBM grupper, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Kontroller, at alle porte er passende for hver prøve af de tre grupper.Hvis det er nødvendigt, desynkronisere gruppen og ændre porte som beskrevet i manuskriptet. Vis BM-cellerne i den afslappede port i et prikplot med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Visualiser resultaterne ved at klikke på Layouteditor"i afsnittet på båndet i arbejdsområdet.Træk hver port i gatingstrategien i eksempelruden til layouteditoren, og placer plottet i overensstemmelse med gatingsekvensen. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre graftypen ved at dobbeltklikke på det tilsvarende afbildning i layoutet og vælge den relevante type i grafdefinitionsvinduet. Klik på gruppen og iterate ved funktioner på layoutbåndet for at visualisere de resultater, der opnås i antigenspecifikke CD8 T-celler fra hvert organ og sammenligne forskellige prøver.Visualiser resultater af knoglemarvsceller, der repræsenterer en positiv kontrol. Et typisk eksempel på cellecyklus analyse af knoglemarvsceller er vist her. Protokollen gav en lav variationskoefficient for G0 til G1 og G2 til M DNA toppe, hvilket indikerer fremragende kvalitet af DNA farvning.En fem trin gating strategi blev anvendt til at identificere antigen specifikke CD8 celler. To multimers blev brugt til at forbedre følsomheden af gag-specifikke CD8 T celle afsløring i vaccinerede mus uden at øge farvning baggrund i ubehandlede mus. Gag-specifikke CD8 T-celler i drænende lymfeknuder og i milten indeholder en høj andel af celler i S-G2/M faser på dag tre post boost.Desuden havde gag-specifikke CD8 T-celler i S-G2/M-faserne høje FSC-A og SSC-A, når de blev overlejret på de samlede CD8 T-celler fra samme organ. Offset histogrammer viste, at CD62L udtryk ved gag-specifikke CD8 T-celler var lav, som forventet for aktiverede T-celler, bortset fra et par celler i G0 i lymfeknuder. Denne metode er designet til T-celler for at opnå en fremragende kvalitet af DNA-farvning sammen med membranen og Ki67 farvning.Flowcytometridataanalyse er et centralt punkt. Sørg for at bruge den rette kontrol til gatepositionering. Ved hjælp af denne metode opdagede vi T-celler i S-G2/M faser af cellecyklus i mus og human perifert blod.Denne teknik var nyttig i immunovervågningsundersøgelser med type 1-diabetes, infektiøs mononukleose og COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-dyr Imaging og Flowcytometrisk Teknikker til analyse af antigen-specifikke CD8 + T-celle responser efter Nanopartikel Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion og berigelse af Rare Antigen-specifikke B-Celler til analyse af fænotype og funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer farvning og kvantitativ analyse til at bestemme placering, overflod og fænotype af Antigen-specifikke CD8 T celler i væv

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering af musenyrnyre resident CD8+ T-celler til flowcytometrianalyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...