Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Reithera, vom MIUR-Projekt 2017K55HLC_006 und von 5 × 1000 Zuschuss der Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) unterstützt. Das folgende Tetramer wurde durch die NIH Tetramer Facility erhalten: APC-konjugiertes H-2K (d) HIV-Gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. 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A. Folgori und S. Capone sind Mitarbeiter von Reithera Srl. A. Nicosia wird auf der Patentanmeldung WO 2005071093 (A3) "Schimpansen-Adenovirus-Impfstoffträger" zum Erfinder ernannt. Die anderen Autoren haben nichts zu verraten.

Obwohl die klonale Expansion von T-Zellen intensiv untersucht wurde, bleiben einige Aspekte unbekannt, vor allem, weil die verfügbaren Werkzeuge, um sie zu untersuchen, wenige sind und ihre eigenen Nachteile haben. Aus dieser Perspektive haben wir eine hochempfindliche durchflusszytometrische Methode aufgebaut, um den Zellzyklus von antigenspezifischen CD8-T-Zellen zu frühen Zeitpunkten nach der Impfung in einem Mausmodell zu analysieren. Das Protokoll basiert auf einer Kombination aus Ki67 und DNA-Färbung, die zuvor zur Analyse des Zellzyklus von BM-hämatopoetischen Zellen in Mäusen verwendet wurde13,14. Um das Protokoll an antigenspezifische CD8-T-Zellen anzupassen, mussten wir einige kritische Punkte berücksichtigen, darunter die Wahl des DNA-Farbstoffs, die geeigneten Bedingungen, um eine vergleichbare DNA-Färbung über verschiedene Proben hinweg zu erhalten, und die Gating-Strategie für die Datenanalyse.
Viele Farbstoffe sind für die DNA-Färbung verfügbar, einschließlich Propidiumiodid und 7-Aminoactinomycin D; Wir haben uns für Hoechst entschieden, weil es mit der Membranfärbung und dem für die Ki67-Färbung erforderlichen milden Fixations- / Permeabilisierungsprotokoll kompatibel war. Gleichzeitig ermöglichte uns die Färbung mit Hoechst ein DNA-Histogramm von ausgezeichneter Qualität, d.h. die DNA-Peaks G0/G1 und G2/M hatten einen viel niedrigeren Variationskoeffizienten (CV) als DNA-Peaks, die normalerweise mit anderen DNA-Farbstoffen, z.B. DRAQ519,erhalten werden. Tatsächlich kann Hoechst DNA sogar in lebenden Zellenfärben 20.
Einige Strategien wurden verwendet, um die Fluktuation der Hoechst-Intensität in verschiedenen Proben desselben Experiments zu vermeiden. Die Hoechst-Färbung wurde kurz vor der Probenentnahme am Durchflusszytometer durchgeführt, um den Rückgang der Farbstoffintensität im Laufe der Zeit zu minimieren. Für diejenigen, die daran interessiert sind, das Protokoll in großen Experimenten mit zahlreichen Proben zu reproduzieren, empfehlen wir, eine Hoechst-Färbung an einigen Proben gleichzeitig durchzuführen. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Hoechst-Intensität während der Inkubation mit dem Farbstoff stark von der Zellzahl beeinflusst werden kann. Aus diesem Grund empfehlen wir dringend, für die DNA-Färbung immer die gleiche Anzahl von Zellen und das gleiche Volumen pro Probe zu verwenden. Wird für die Erfassung am Durchflusszytometer eine hohe Anzahl von Zellen benötigt, empfehlen wir, zwei oder mehr identische Proben vorzubereiten und diese dann kurz vor dem Hoechst-Färbeschritt zusammenzuführen.
Ein wichtiger Punkt des Protokolls ist die Gating-Strategie für die Datenanalyse. Wir haben kürzlich eine neuartige Strategie für die T-Zell-Analyse zu frühen Zeitpunkten der Immunantwort veröffentlicht, die es uns ermöglichte, die Empfindlichkeit des Nachweises von antigenspezifischen T-Zellen zu erhöhen12. Wir haben diese Strategie wie folgt auf die hier gezeigten Daten angewendet. Zuerst haben wir Zellaggregate im DNA-A/W-Diagramm ausgeschlossen. Zweitens, nachdem wir abgestorbene Zellen ausgesondert hatten, verwendeten wir ein ziemlich großes Lymphozyten-Gate im FSC / SSC-Diagramm ("entspanntes Gate"). Durch diese Strategie konnten wir hochaktivierte antigenspezifische CD8-T-Zellen in S-G2/M einschließen, die normalerweise von aktuellen Gating-Strategien übersehen werden, da diese Zellen einen hohen FSC-A und SSC-A aufweisen. Zusammenfassend stellt die Datenanalyse einen kritischen Teil der Methode dar, der essentiell ist, um einen sensitiven Nachweis von aktivierten/proliferierenden antigenspezifischen T-Zellen zu erhalten.
Die Methode verhindert die Möglichkeit, kritische T-Zell-Daten in frühen Phasen der Immunantwort zu verpassen und eröffnet neue Perspektiven für das T-Zell-Immun-Monitoring. Eine zukünftige Verbesserung könnte darin bestehen, eine Färbung für Phospho-Histon 3 aufzunehmen, die eine Unterscheidung zwischenG2 undM21ermöglichen würde. Eine aktuelle Einschränkung besteht darin, dass Zellen fixiert und permeabilisiert werden müssen, um für den Kernmarker Ki67 zu färben. Daher können Zellen nicht für andere Arten von Analysen wie Sortierung und anschließende Funktionsanalyse verwendet werden. Darüber hinaus stören DNA-Farbstoffe, einschließlich Hoechst, in der Regel die genomische DNA-Analyse und sind für diese Art der Bewertung nicht geeignet. Die Identifizierung von Membranmarkern, die mit verschiedenen Zellzyklusphasen korrelieren und auf lebenden Zellen gefärbt werden können, könnte diese Einschränkung überwinden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Methode ein großes Potenzial für die Bewertung von aktivierten /proliferierenden T-Zellen in verschiedenen Kontexten wie Impfung, Infektion, immunvermittelten Erkrankungen und Immuntherapie hat.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naive T-Zellen durchlaufen eine klonale Expansion und Differenzierung beim Antigen-Priming. Differenzierte T-Zellen zeigen Effektorfunktionen, die für die Antigen-Clearance und für die Aufrechterhaltung des Antigen-spezifischen Gedächtnisses unerlässlich sind, was für einen lang anhaltenden Schutz entscheidend ist. Während der ersten Schritte der primären Antwort ist die naive T-Zell-Interaktion mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) in spezialisierten Nischen in lymphatischen Organen entscheidend, um die riesige T-Zell-Proliferation zu induzieren, die die klonale Expansionsphasecharakterisiert 1,2,3. Die T-Zell-APC-Interaktion wird durch die Konzentration und Persistenz von Antigen, kostimulatorischen Signalen und löslichen Faktoren (Zytokine und Chemokine), die die Quantität und Qualität der klonalen T-Zell-Nachkommen4,5 ,6,7beeinflussen,fein reguliert.
Trotz intensiver Studien zur klonalen T-Zellexpansion ist noch nicht bekannt, ob Antigen-präparierte T-Zellen ihren gesamten Zellzyklus am Ort der Antigenerkennung abschließen oder ob sie während des Zellzyklusverlaufs in andere Organe wandern. Dieser Mangel an Wissen ist auf die Eigenschaften der verfügbaren Werkzeuge für die Zellzyklusanalyse zurückzuführen. Dazu gehören monoklonale Antikörper (mAbs), die spezifisch für den Kernmarker Ki67 sind, und Zellfarbstoffe, die entweder Zellen identifizieren, die die S-Phase des Zellzyklus durchlaufen haben (z. B. Bromodeoxyuridin (BrdU)) oder zwischen Tochterzellen und ihren Vorfahren diskriminieren (z. B. Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)).
Zellmarkierungsfarbstoffe wie CFSE und BrdU erlauben jedoch keine Bestimmung darüber, ob sich zellen in einem bestimmten Organ gefundene Zellen lokal vermehrt haben oder eher nach derTeilung 8,9an diesen Ort gewandert sind. Darüber hinaus ist das intranukleäre Protein Ki67 nur in der Lage, Zellen in G0 (Ki67-negative Zellen) von denen in jeder anderen Zellzyklusphase (Ki67-positive Zellen) zu unterscheiden. Daher unterscheidet die Ki67-Analyse Zellen in aktiver Proliferation (d.h. in S,G2oder M) nicht von denen in G 1 , die entweder schnell zurTeilungfortschreiten oder für längere Zeit in G1 bleiben oder zur Ruhe zurückkehrenkönnen 10,11.
Hier beschreiben wir eine neue durchflusszytometrische Methode zur Zellzyklusanalyse von antigenspezifischen CD8-T-Zellen12 aus milz und lymphknoten (LNs) geimpfter Mäuse (Abbildung 1). Die Methode nutzt eine Kombination aus Ki67 und DNA-Färbung, die zuvor zur Analyse des Zellzyklus von hämatopoetischen Zellen des Mausknochenmarks (BM) verwendet wurde13,14. Hier haben wir Ki67 plus DNA-Färbung zusammen mit der kürzlich veröffentlichten innovativen Gating-Strategie12erfolgreich auf die Analyse der klonalen Expansion von CD8-T-Zellen angewendet. Wir konnten eindeutig zwischen antigenspezifischen CD8-T-Zellen in G0, in G1und in S-G2/ M-Phasen in der Milz und drainierenden LNs von geimpften Mäusen unterscheiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

Der Zellzyklus von Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo wurde mit einigen Methoden untersucht, die alle einige Einschränkungen aufweisen. Bromodeoxyuridin (BrdU) markiert Zellen, die sich in oder kürzlich abgeschlossener S-Phase befinden, und Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) erkennt Tochterzellen nach der Teilung. Diese Farbstoffe erlauben jedoch keine Identifizierung der Zellzyklusphase zum Zeitpunkt der Analyse. Ein alternativer Ansatz ist die Nutzung von Ki67, einem Marker, der von Zellen in allen Phasen des Zellzyklus mit Ausnahme der Ruhephase G0stark exprimiert wird. Leider erlaubt Ki67 keine weitere Differenzierung, da es Zellen in der S-Phase, die der Mitose verschrieben sind, nicht von denen in G1 trennt, die in dieser Phasebleiben, in den Zyklus übergehen oder sich in G0bewegen können.
Hier beschreiben wir eine durchflusszytometrische Methode zur Erfassung eines "Schnappschusses" von T-Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen in sekundären lymphatischen Organen der Maus. Die Methode kombiniert Ki67- und DNA-Färbung mit Major Histocompatibility Complex (MHC)-Peptid-Multimer-Färbung und einer innovativen Gating-Strategie, die es uns ermöglicht, erfolgreich zwischen antigenspezifischen CD8-T-Zellen in G0, in G1 und in S-G2/ M-Phasen des Zellzyklus in der Milz und drainierenden Lymphknoten von Mäusen nach der Impfung mit viralen Vektoren zu unterscheiden, die den Modell-Antigen-Gag des humanen Immunschwächevirus (HIV)-1 tragen.
Kritische Schritte der Methode waren die Wahl des DNA-Farbstoffs und die Gating-Strategie, um die Assay-Sensitivität zu erhöhen und hochaktivierte/proliferierende antigenspezifische T-Zellen einzubeziehen, die nach aktuellen Analysekriterien übersehen worden wären. Der DNA-Farbstoff Hoechst 33342 ermöglichte es uns, eine qualitativ hochwertige Unterscheidung der DNA-Peaks G0/G1 und G2/Mzu erhalten und gleichzeitig die Membran- und intrazelluläre Färbung zu erhalten. Die Methode hat ein großes Potenzial, das Wissen über die T-Zell-Antwort in vivo zu erweitern und die Immunmonitoring-Analyse zu verbessern.

Die Zellzyklusphasen von Zellen aus Milz, LNs und BM von Balb /c-Mäusen wurden mit dem fluoreszierenden DNA-Farbstoff Hoechst und einem Anti-Ki67 mAb gemäß dem in Abbildung 1zusammengefassten Protokoll analysiert. Diese Färbung ermöglichte die Differenzierung von Zellen in den folgenden Phasen des Zellzyklus: G0 (Ki67neg, wobei 2N DNA als DNAlow definiert ist), G1 (Ki67pos, DNAlow) und S-G2/ M (Ki67pos, mit einem DNA-Gehalt zwischen 2N und 4N oder gleich 4N DNA, definiert als DNAintermedite / high).
Wir führten zunächst eine Zellzyklusanalyse von BM-Zellen durch, um zuvor veröffentlichte Ergebnisse13,14 zu reproduzieren, und analysierten dann die interessierenden Zellen, d.h. CD8-T-Zellen. Abbildung 2 zeigt ein typisches Beispiel für die Zellzyklusanalyse von BM-Zellen (Abbildung 2A). Das Protokoll ergab einen niedrigen Variationskoeffizienten (CV) von G0/G1 und G2/MDNA-Peaks, was auf die hervorragende Qualität der DNA-Färbung hinweist (Abbildung 2B, zeigt ein Beispiel mit CV < 2,5; CV war in allen Experimenten immer < 5).
Wir haben dann das gleiche Protokoll auf antigenspezifische CD8-T-Zellen von geimpften Mäusen angewendet. BALB / c-Mäuse wurden gegen den Antigen-Gag von HIV-1 geimpft, indem chad3-gag für Priming und MVA-Gag für Boosting verwendet wurden, beide entwickelt, um HIV-1-Gag zu tragen. Am Tag (d) 3 nach dem Boost analysierten wir die Häufigkeit von Gag-spezifischen CD8-T-Zellen aus der Milz und den drainierenden LNs. Wir nutzten die neu definierte Gating-Strategie für T-Zellen in der Frühphase der Immunantwort, die im Gegensatz zur konventionellen Strategie geeignet ist, hochaktivierte Antigen-reagierende CD8-T-Zellennachzuweisen 12. Wir haben die neuartige Strategie in fünf aufeinander folgenden Schritten umgesetzt. In Schritt 1 schlossen wir Dubletten oder Aggregate durch DNA-A/ -W-Gatter aus, und in Schritt 2 identifizierten wir lebende Zellen durch Ausschluss toter Zellmarker. In Schritt 3 identifizierten wir die interessierende Population unter Verwendung eines unkonventionellen "entspannten" FSC-A / SSC-A-Gates (Abbildung 3A) anstelle des kanonischen schmalen Lymphozyten-Gates12. Nach dem Gating auf CD3+CD8+ Zellen (Schritt 4 von Abbildung 3A) identifizierten wir Gag-spezifische CD8 T-Zellen unter Verwendung von zwei verschiedenen MHC-Multimeren, d.h. Pent-Gag und Tetr-Gag (Schritt 5 von Abbildung 3A). Wir verwendeten zwei Multimere anstelle von einem, um die Empfindlichkeit des Gag-spezifischen CD8-T-Zellnachweises bei geimpften Mäusen zu verbessern, ohne den Färbehintergrund bei unbehandelten Mäusen zu erhöhen(Abbildung 3B und C,Schritt 5). So haben wir erfolgreich unbehandelte Mäuse (0,00% bzw. 0,00% Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in LNs bzw. Milz) von geimpften Mäusen (0,46% bzw. 0,29% Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in LNs bzw. Milz) unterschieden, Abbildung 3B und C).
Bemerkenswerterweise erlaubte uns das Protokoll, einen extrem niedrigen Hintergrund im antigenspezifischen CD8-T-Zell-Gate von LNs und Milz von unbehandelten Mäusen zu haben (normalerweise 0,00% und maximal 0,02%). Der Vergleich von Gag-spezifischen und nicht Gag-spezifischen FSC-A / SSC-A-Plots zeigte, dass die Gag-spezifischen Zellen hohe SSC-A und FSC-A aufwiesen(Abbildung 3D),was die Notwendigkeit bestätigt, ein "entspanntes" FSC-A / SSC-A-Gate zu verwenden, um diese Zellen zu erfassen. Wir haben dann die Prozentsätze von Gag-spezifischen CD8-T-Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen ausgewertet (Abbildung 4A). Wir fanden heraus, dass Gag-spezifische CD8-T-Zellen in der Milz und noch mehr in den drainierenden LNs einen hohen Anteil an Zellen in S-G2/ M-Phasen am Tag 3 nach dem Boost enthielten (18,60% bzw. 33,52%).
Darüber hinaus fanden wir heraus, dass Gag-spezifische CD8-T-Zellen in S-G2/M-Phasen hohe FSC-A- und SSC-A-Zellen aufwiesen, wenn sie auf die gesamten CD8-T-Zellen desselben Organs überlagert wurden (Abbildung 4B). Die CD62L-Expression durch Gag-spezifische CD8-T-Zellen war niedrig, wie für aktivierte T-Zellen erwartet, mit Ausnahme einiger Zellen in G0 in den LNs (Abbildung 4C). Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse, dass das "entspannte" Gate (Schritt 3 von Abbildung 3A, B und C)erforderlich war, um alle sich ausbreitenden antigenspezifischen CD8-T-Zelleneinzuschließen 12. Das Protokoll war äußerst wertvoll für eine "Momentaufnahme" der Zellzyklusphasen von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen zum Zeitpunkt der Analyse und der CD62L-Expression durch Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Abbildung 1: Schema des Protokolls für die Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Zellzyklusanalyse von BM-Zellen. BM-Zellen von unbehandelten Balb/c-Mäusen wurden gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Beispiel für eine Gating-Strategie. Wir haben einzelne Zellen im DNA-A/-W-Diagramm (links) und anschließend lebende Zellen durch Totzellfarbstoffausschluss (Mitte) abgegrenzt. Dann wurde ein "entspanntes" FSC-A/SSC-A-Gate für alle BM-Zellen verwendet (rechts). (B) Beispiel für die Zellzyklusanalyse von BM-Zellen (links). Wir verwendeten eine Kombination aus Ki67 und DNA-Färbung, um Zellen in den folgenden Phasen des Zellzyklus zu identifizieren: G0 (unterer linker Quadrant, Ki67neg-DNAlow-Zellen), G1 (oberer linker Quadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/ M (oberer rechter Quadrant, Ki67pos-DNAintermedite / high). Fluoreszenz Minus Eins (FMO) Kontrolle von Ki67 mAb (Mitte) und DNA-Histogramm (rechts) werden gezeigt. Im DNA-Histogrammdiagramm entsprechen das linke und das rechte Gatter dem DNA-Peak G0/G1 bzw. dem DNA-PeakG2/M,und die Zahlen stellen die Variationskoeffizienten (CV) jedes Peaks dar. In allen anderen Diagrammen stellen die Zahlen Zellprozentsätze in den angegebenen Toren dar. Die Abbildung zeigt 1 repräsentatives Experiment von 5. In jedem Experiment analysierten wir gepoolte BM-Zellen von 3 Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Analyse von antigenspezifischen CD8-T-Zellen aus LNs und Milz. Balb/c-Mäuse wurden intramuskulär (i.m.) mit Chad3-Gag und i.m. mit MVA-Gag präpariert. An Tag 3 nach dem Boost wurden abfließende LN- und Milzzellen von geimpften und unbehandelten Kontrollmäusen gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Schema der Gating-Strategie in fünf Schritten zur Identifizierung einzelner Zellen (Schritt 1); lebende Zellen (Schritt 2); Lymphozyten (Schritt 3); CD8 T-Zellen (Schritt 4); und Gag-spezifische Zellen (Schritt 5). (B-C) Beispiel für Plots: Analyse von Zellen aus (B) LNs und (C) Milz von unbehandelten (oben) und geimpften (unten) Mäusen. Wir haben einzelne Zellen auf dem DNA-A/ -W-Diagramm in Schritt 1 identifiziert. In Schritt 2 haben wir dann lebende Zellen durch Ausschluss von Totzellfarbstoffen ausgewählt. In Schritt 3 haben wir ein nicht-kanonisches "entspanntes" Tor für Lymphozyten verwendet. In Schritt 4 identifizierten wir CD8-T-Zellen durch ihre doppelte Expression von CD3 und CD8. Wir identifizierten dann gag-spezifische Zellen und nicht gag-spezifische Zellen in Schritt 5, basierend auf ihrer Fähigkeit, fluorochrom-markiertes H-2kd-Gag-Pentamer (Pent-Gag) bzw. H-2kd-Gag-Tetramer (Tetr-Gag) zu binden oder nicht. (D) FSC-A/SSC-A-Profile von knebelspezifischen (blau) und nicht knebelspezifischen (grauen) Zellen nach dem Gating wie oben beschrieben. Zahlen stellen Zellprozentsätze in den angegebenen Gates dar. Die Abbildung zeigt 1 repräsentatives Experiment von 5. In jedem Experiment analysierten wir gepoolte Milz und gepoolte LN-Zellen von 3 geimpften Mäusen und 3 unbehandelten Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen. Die Mäuse wurden wie in Abbildung 3 geimpft und die Zellzyklusanalyse von Gag-spezifischen Zellen wurde an Tag 3 nach dem Boost durchgeführt, nach dem Gating in 5 Schritten wie in Abbildung 3. (A)Beispiel für eine Zellzyklusanalyse von Gag-spezifischen CD8-T-Zellen aus LNs (oben) und Milz (unten) geimpfter Mäuse. Zellzyklusphasen wurden wie in Abbildung 2Bidentifiziert. Die Panels repräsentieren Zellen in G0, in G1und in S-G2/M (links) und Fluoreszenz Minus Eins (FMO) Steuerung von Ki67 mAb (rechts). Zahlen stellen Zellprozentsätze in den angegebenen Gates dar. (B) FSC-A/SSC-A-Punktdiagramme, die Gag-spezifische CD8-T-Zellen in S-G2/M-Phasen (in rot) zeigen, überlagert auf insgesamt CD3+CD8+ T-Zellen (in grau) aus LNs (oben) und Milz (unten) geimpfter Mäuse. (C) Offset-Histogramme, die die CD62L-Expression durch Gag-spezifische CD8-T-Zellen in G0 (grün), in G1 (blau) und in S-G2/M(rot) aus LNs (oben) und Milz (unten) geimpfter Mäuse zeigen. Die y-Achsen zeigen die normalisierte Anzahl von Ereignissen an. Die Abbildung zeigt 1 repräsentatives Beispiel aus 5 unabhängigen Experimenten mit insgesamt 15 Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzendes Material: Durchflusszytometer-Einstellungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Die klonale Expansion ist ein Schlüsselmerkmal der antigenspezifischen T-Zell-Antwort. Der Zellzyklus von Antigen-reagierenden T-Zellen wurde jedoch schlecht untersucht, teilweise aufgrund technischer Einschränkungen. Wir beschreiben eine durchflusszytometrische Methode zur Analyse klonal expandierender Antigen-spezifischer CD8-T-Zellen in Milz und Lymphknoten geimpfter Mäuse.

Ein DNA/Ki67-basierter Durchflusszytometrie-Assay zur Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen bei geimpften Mäusen

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Unser Protokoll bietet einen praktischen Ansatz, mit dem Milz und Lymphknoten der Maus verwendet werden können, um die Dynamik der T-Zell-Antwort stärker widerzuspiegeln als eine phänotypische Momentaufnahme im stationären Zustand. Unsere Technik detektiert empfindlich antigenspezifische CD8-T-Zellen, die an einer laufenden Reaktion beteiligt sind. Proliferierende CD8-T-Zellen werden ohne die möglicherweise verwirrenden Wirkungen einer In-vivo-Medikamentbehandlung oder eines Zelltransfers gemessen.Unsere Technik kann in verschiedenen Situationen ein Fenster in der Immundynamik bieten. Zum Beispiel in Bezug auf das Ansprechen auf Impfungen und Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebsimmuntherapie. Bereiten Sie frischen 1x Permeabilisierungswaschpuffer vor, indem Sie 10x Permeabilisierungspuffer mit destilliertem Wasser verdünnen und durch einen 0,45 Mikrometer Filter filtern, um Aggregate zu entfernen.Verdünnter monoklonaler Antikörper Ki67 FITC in 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer, bestimmt mit einem Titrationsexperiment für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe. 3 Milliliter des 1x Permeabilisierungs-Waschpuffers in jedes Röhrchen mit Zellen geben und bei 400 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.Fügen Sie erneut den 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie dann den Überstand. 100 Mikroliter des verdünnten monoklonalen Antikörpers Ki67 FITC in das Pellet geben, dann wirbeln und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 4 Millilitern 1x Permeabilisierungspuffer, zentrifugieren Sie nach jeder Wäsche und verwerfen Sie den Überstand. Geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die direkt am Durchflusszytometer entnommen werden sollen, und 250 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die mit Hoechst für die DNA-Färbung inkubiert werden sollen. Hoechst- und PBS-Lösung vorbereiten und zu jeder Probe geben, so dass die Endkonzentration zwei Mikrogramm pro Milliliter beträgt.Wirbeln und inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten im Dunkeln. Dann zentrifugieren Sie die Proben für fünf Minuten und geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie verschiedene Gruppen, die den verschiedenen zu analysierenden Organen entsprechen, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf "Gruppe erstellen" klicken.Öffnen Sie das geänderte Gruppenfenster durch Doppelklick auf den Gruppennamen und synchronisieren Sie die neu erstellten Gruppen, indem Sie ein Häkchen an der Funktion synchronisiert setzen. Ziehen Sie jede FCS-Datei in die entsprechende Gruppe und erstellen Sie dann eine Gating-Strategie, beginnend mit der a-LN-Gruppe. Öffnen Sie das Diagrammfenster, indem Sie auf die vollständig gebeizte Probe doppelklicken, um die für die Stichprobe erfassten ungefüllten Ereignisse in einem Punktdiagramm anzuzeigen.Beachten Sie, dass die x- und y-Achse wie in den FCS-Dateien beschriftet sind, wie in Tabelle zwei der Durchflusszytometer-Einstellungsdatei dieses Manuskripts angegeben. Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Anzahl von Ereignissen angezeigt wird, um eine geeignete Visualisierung zu ermöglichen. Öffnen Sie ggf. die Voreinstellungen, indem Sie auf das Herzsymbol im Arbeitsbereichsmenüband klicken, "Diagramme" und dann "Punktdiagramm" als Diagrammtyp auswählen und überprüfen Sie, ob die Anzahl der im entsprechenden Feld gezeichneten Punkte korrekt ist, oder ändern Sie sie.Zeigen Sie die uneinheitlichen Ereignisse im Diagrammfenster in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und DNA-W auf der y-Achse an. Verwenden Sie lineare Skalierung für beide Achsen. Ändern Sie bei Bedarf die Skalierung von logarithmisch zu linear, indem Sie auf das mit einem T gekennzeichnete Kästchen in der Nähe jeder Achse im Diagrammfenster klicken.Wählen Sie eine einzelne Zellpopulation aus, indem Sie im Gating-Werkzeugabschnitt auf rechteck klicken und dann in die Mitte des rechteckigen Tors doppelklicken, um einzelne Zellen in einem Punktdiagramm mit FSC-A-Parameter auf der x-Achse und totem Zellchip auf der y-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf das Polygon, um die lebende Zellpopulation auszuwählen, die negativ für den Totzellabster ist. Doppelklicken Sie in die Mitte des Polygongaters, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit dem Parameter FSC-A auf der x-Achse und dem Parameter SSC-A auf der y-Achse anzuzeigen.Klicken Sie auf das Rechteck und erstellen Sie ein entspanntes Tor, um alle einzelnen lebenden Zellen in diesem Diagramm einzuschließen. Doppelklicken Sie in die Mitte des entspannten Tores, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit CD3 auf der x-Achse und CD8 auf der y-Achse anzuzeigen. Verwenden Sie die entsprechende Zugriffsskala für die Visualisierung im Diagrammfenster.Ändern Sie bei Bedarf die x- und y-Skala, indem Sie auf das Kästchen klicken, das mit einem T in der Nähe jeder Achse gekennzeichnet ist, wählen Sie Zugriffsfunktion anpassen und ändern Sie bei Bedarf zusätzliche Neg-Jahrzehnte mit Basen und positiven Jahrzehnten. Markieren Sie die Zellen CD3+CD8+, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des CD3+CD8+-Gatters, um die Zellen in einem Punktplot mit Tetr-Gag auf der x-Achse und Pent-Gag auf der y-Achse anzuzeigen.Wählen Sie die antigenspezifischen CD8 T-Zellen aus, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des Gag-spezifischen Tors, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse anzuzeigen. Markieren Sie die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen, indem Sie im Abschnitt "Gating-Werkzeug" des Diagrammfensters auf "Quad" klicken.Kopieren Sie die in einem Beispiel erstellte Gating-Strategie in die entsprechende Gruppe, um die Gatter auf alle Stichproben der Gruppe anzuwenden. Kopieren Sie dann Gating-Strategien für die b-Milz- und CBM-Gruppen, wie im Textmanuskript beschrieben. Stellen Sie sicher, dass alle Gates für jede Stichprobe der drei Gruppen geeignet sind.Bei Bedarf desynchronisieren Sie die Gruppe und ändern Sie die Gatter wie im Manuskript beschrieben. Zeigen Sie die BM-Zellen des entspannten Tores in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse an. Visualisieren Sie die Ergebnisse, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf "Layout-Editor" klicken.Ziehen Sie jedes Gate der Gating-Strategie im Beispielbereich in den Layout-Editor, und platzieren Sie die Plots entsprechend der Reihenfolge des Gatings. Ändern Sie bei Bedarf den Diagrammtyp, indem Sie auf das entsprechende Diagramm im Layout doppelklicken und den entsprechenden Typ im Diagrammdefinitionsfenster auswählen. Klicken Sie auf die Gruppe und iterieren Sie nach Funktionen auf dem Layoutband, um die Ergebnisse zu visualisieren, die in antigenspezifischen CD8-T-Zellen aus jedem Organ erhalten wurden, und verschiedene Proben zu vergleichen.Visualisieren Sie die Ergebnisse von Knochenmarkzellen, die eine Positivkontrolle darstellen. Ein typisches Beispiel für die Zellzyklusanalyse von Knochenmarkzellen wird hier gezeigt. Das Protokoll ergab einen niedrigen Variationskoeffizienten von G0 bis G1 und G2 bis M DNA-Peaks, was auf eine ausgezeichnete Qualität der DNA-Färbung hinweist.Eine fünfstufige Gating-Strategie wurde angewendet, um antigenspezifische CD8-Zellen zu identifizieren. Zwei Multimere wurden verwendet, um die Empfindlichkeit des Gag-spezifischen CD8-T-Zellnachweises bei geimpften Mäusen zu verbessern, ohne den Färbehintergrund bei unbehandelten Mäusen zu erhöhen. Gag-spezifische CD8-T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten und in der Milz enthalten einen hohen Anteil an Zellen in den S-G2/M-Phasen am dritten Tag nach dem Boost.Darüber hinaus wiesen Gag-spezifische CD8-T-Zellen in den S-G2/M-Phasen einen hohen FSC-A und SSC-A auf, wenn sie auf die gesamten CD8-T-Zellen desselben Organs überlagert wurden. Offset-Histogramme zeigten, dass die CD62L-Expression durch Gag-spezifische CD8-T-Zellen niedrig war, wie für aktivierte T-Zellen erwartet, mit Ausnahme einiger Zellen in G0 in den Lymphknoten. Diese Methode wurde für T-Zellen entwickelt, um eine hervorragende Qualität der DNA-Färbung zusammen mit der Membran und der Ki67-Färbung zu erreichen.Die Analyse der Durchflusszytometrie ist ein Schlüsselpunkt. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechende Steuerung für die Gate-Positionierung verwenden. Mit dieser Methode entdeckten wir T-Zellen in S-G2/M-Phasen des Zellzyklus im peripheren Blut der Maus und des Menschen.Diese Technik war nützlich bei Immunüberwachungsstudien bei Typ-1-Diabetes, infektiöser Mononukleose und COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...