Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ריית'רה, על ידי פרויקט MIUR 2017K55HLC_006, ועל ידי 5 × 1000 מענק מ Associazione איטלקית רייסרקה סול Cancro (AIRC). הטטרמר הבא הושג באמצעות מתקן NIH Tetramer: H-2K מצומד APC (ד) בדיחת HIV 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

א. Folgori ו S. Capone הם עובדים של ריית'רה סרל. א ניקוסיה נקרא ממציא על בקשת פטנט WO 2005071093 (A3) "שימפנזה אדנווירוס חיסון נשאים." למחברים האחרים אין מה לחשוף.

למרות התרחבות ציפורן תא T נחקרה באופן אינטנסיבי, היבטים מסוימים עדיין לא ידוע, בעיקר משום שהכלים הזמינים לחקור אותו הם מעטים ויש להם חסרונות משלהם. מנקודת מבט זו, הקמנו שיטה ציטומטרית זרימה רגישה מאוד כדי לנתח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן בזמנים מוקדמים לאחר החיסון במודל עכבר. הפרוטוקול מבוסס על שילוב של Ki67 וכתמי DNA, אשר שימש בעבר כדי לנתח את מחזור התא של תאים hematopoietic BM בעכברים13,14. כדי להתאים את הפרוטוקול לתאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן, היינו צריכים לשקול כמה בעיות קריטיות, כולל בחירת צבע ה- DNA, התנאים המתאימים להשגת כתמי DNA דומים על פני דגימות שונות, ואסטרטגיית הגינג לניתוח נתונים.
צבעים רבים זמינים עבור כתמי DNA, כולל פרופידיום יודיד ו 7-אמינוקטינומיצין D; בחרנו בהוכסט מכיוון שהוא התאים להכתמת הממברנה ולפרוטוקול הקיבעון / permeabilization המתון הנדרש להכתמת Ki 67. יחד עם זאת, הכתמה עם Hoechst אפשר לנו להשיג היסטוגרמה DNA באיכות מעולה, כלומר, G0/ G1 ו- G2/ M DNA פסגות היה מקדם נמוך בהרבה של וריאציה (קורות רה"ב) מאשר פסגות DNA בדרך כלל מתקבל עם צבעי DNA אחרים, למשל, DRAQ519. ואכן, Hoechst יכול להכתים DNA אפילו בתאים חיים20.
כמה אסטרטגיות שימשו כדי למנוע את התנודתיות בעוצמת Hoechst בדגימות שונות של אותו ניסוי. כתמי הוצ'סט בוצעו ממש לפני רכישת מדגם בציטומטר הזרימה כדי למזער את הירידה בעוצמת הצבע בזמן. למעוניינים לשחזר את הפרוטוקול בניסויים גדולים עם דגימות רבות, אנו ממליצים לבצע הכתמת Hoechst על כמה דגימות בכל פעם. חיסרון נוסף הוא כי עוצמת Hoechst יכול להיות מושפע בכבדות על ידי מספר התא במהלך דגירה עם הצבע. מסיבה זו, אנו ממליצים בחום להשתמש תמיד באותו מספר תאים ובאותו נפח לכל דגימה להכתמת DNA. אם נדרש מספר גבוה של תאים לרכישה בציטומטר הזרימה, אנו ממליצים להכין שתי דגימות זהות או יותר ולאחר מכן למזג אותן ממש לפני שלב הכתמת הוכשט.
נקודת מפתח בפרוטוקול היא אסטרטגיית הג'יטינג לניתוח נתונים. לאחרונה פרסמנו אסטרטגיה חדשנית לניתוח תאי T בזמנים מוקדמים של התגובה החיסונית, אשר אפשרה לנו להגביר את הרגישות של זיהוי של תאי T ספציפיים אנטיגן12. יישמנו אסטרטגיה זו על הנתונים המוצגים כאן כדלקמן. ראשית, שללנו אגרגטים של תאים במזימת ה-DNA-A/W. שנית, לאחר שקבענו תאים מתים, השתמשנו בשער לימפוציטים גדול למדי בחלקת FSC / SSC ("שער רגוע"). על ידי אסטרטגיה זו, הצלחנו לכלול תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן מופעלים מאוד ב- S-G2/ M כי הם בדרך כלל החמיצו על ידי אסטרטגיות gating הנוכחי, כמו תאים אלה יש FSC-A גבוה SSC-A ו- SSC-A. לסיכום, ניתוח הנתונים מייצג חלק קריטי של השיטה, אשר חיוני כדי לקבל זיהוי רגיש של תאי T מופעלים / מתרבים.
השיטה מונעת את האפשרות של חסר נתוני תאי T קריטיים בשלבים מוקדמים של התגובה החיסונית ופותחת פרספקטיבות חדשות לניטור חיסוני של תאי T. שיפור עתידי עשוי להיות לכלול כתמים עבור phospho-histone 3 שיאפשר הבחנה בין G2 ו- M21. המגבלה הנוכחית היא כי תאים צריכים להיות קבועים permeabilized כדי להכתים עבור הסמן הגרעיני, Ki67. לפיכך, תאים לא יכולים לשמש עבור סוגים אחרים של ניתוח כגון מיון וניתוח פונקציונלי עוקב. יתר על כן, צבעי DNA, כולל Hoechst, בדרך כלל להפריע ניתוח DNA גנומי ואינם מתאימים לסוג זה של הערכה. זיהוי של סמני ממברנה התואמים עם שלבי מחזור תאים שונים וזה יכול להיות מוכתם על תאים חיים יכול להתגבר על מגבלה זו. לסיכום, לשיטה פוטנציאל רב להערכת תאי T פעילים/מתרבים במספר הקשרים כגון חיסון, זיהום, מחלות בתיווך אימונו וטיפול אימונו.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

תאי T נאיביים עוברים התרחבות כלנית ובידול על אנטיגן-priming. תאי T מובחנים מציגים פונקציות אפקט החיוניות לסילוק אנטיגן ולשימור זיכרון ספציפי לאנטיגן, שהוא המפתח להגנה לאורך זמן. במהלך השלבים הראשונים של התגובה הראשונית, אינטראקציה תאי T נאיבית עם תאים אנטיגן מציג (APCs) בתוך נישות מיוחדות באיברי הלימפה הוא קריטי כדי לגרום להתפשטות תאי T ענק המאפיין את שלב הרחבת הציפורן1,2,3. אינטראקציה תא-APC T מוסדר דק על ידי ריכוז והתמדה של אנטיגן, אותות מגרה משותף, וגורמים מסיסים (ציטוקינים וכימותרפיה) המשפיעים על הכמות והאיכות של צאצאי ציפורן תא T4,5,6,7.
למרות מחקרים אינטנסיביים של התפשטות כלנית תאי T, עדיין לא ידוע אם תאי T אנטיגן-ראש להשלים את כל מחזור התא שלהם באתר של זיהוי אנטיגן, או אם הם נודדים לאיברים אחרים במהלך התקדמות מחזור התא. חוסר ידע זה נובע המאפיינים של כלים זמינים לניתוח מחזור התא. אלה כוללים נוגדנים חד שבטיים (mAbs) הספציפיים לסמן הגרעיני, Ki67, וצבעי תאים המזהים תאים שעברו את שלב ה- S של מחזור התא (למשל, ברומודוקסיורידין (BrdU)) או מפלים בין תאי הבת ואבותיהם (למשל, קרוקסיפלואורסצ'ין סוצ'ינימידיל אסתר (CFSE)).
עם זאת, צבעים של תיוג תאים, כגון CFSE ו- BrdU, אינם מאפשרים לקבוע אם תאים שנמצאו באיבר מסוים התרבו באופן מקומי או ליתר דיוק הועברו לאתר זה לאחר חלוקה8,9. יתר על כן, החלבון התוך-גרעיני, Ki67, מסוגל להבחין רק בתאים ב- G0 (תאים שליליים Ki67) מאלה בכל שלב מחזור תאים אחר (תאים חיוביים Ki67). לכן, ניתוח Ki67 אינו מבחין בין תאים בשגשוג פעיל (כלומר, ב- S, G2, או M) מאלה שב- G1, אשר עשויים להתקדם במהירות לחלוקה או להישאר לתקופות ארוכות ב- G1 או לחזור ל- quiescence10,11.
כאן, אנו מתארים שיטה ציטומטרית זרימה חדשה לניתוח מחזור התאים של תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן12 מן הטחול ובלוטות הלימפה (LNs) של עכברים מחוסנים(איור 1). השיטה מנצלת שילוב של Ki67 וכתמי DNA ששימשו בעבר לניתוח מחזור התא של תאי המטופויאטיים של מח העצם של העכבר (BM)13,14. כאן, יישמת בהצלחה Ki67 בתוספת כתמי DNA, יחד עם אסטרטגיית הגינג החדשנית שפורסמה לאחרונה12, לניתוח הרחבת כלת תא CD8 T. הצלחנו להפלות בבירור בין תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ב- G0,ב- G1,ובפעמי S-G2/ M בטחול ו- LNs ניקוז של עכברים מחוסנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

מחזור התא של תאי T ספציפיים אנטיגן ב vivo נבדק באמצעות כמה שיטות, שלכולן יש כמה מגבלות. ברומודיאוקסיורידין (BrdU) מסמן תאים הנמצאים בשלב S או שהושלמו לאחרונה, ו- carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) מזהה תאי בת לאחר החלוקה. עם זאת, צבעים אלה אינם מאפשרים זיהוי של שלב מחזור התא בזמן הניתוח. גישה חלופית היא לנצל Ki67, סמן המתבטא מאוד על ידי תאים בכל שלבי מחזור התא למעט שלב ה- Quiescent G0. למרבה הצער, Ki67 אינו מאפשר הבחנה נוספת כפי שהוא אינו מפריד תאים ב S-פאזה המחויבים מיטוזה מאלה ב G1 שיכולים להישאר בשלב זה, להמשיך לתוך רכיבה על אופניים, או לעבור לתוך G0.
כאן, אנו מתארים שיטה ציטומטרית זרימה ללכידת "תמונת מצב" של תאי T בשלבי מחזור תאים שונים באיברי לימפה משניים של העכבר. השיטה משלבת Ki67 והכתמת DNA עם קומפלקס היסטו-תאימות מרכזי (MHC)-פפטיד-רב-משתתפים ואסטרטגיית גיטינג חדשנית, המאפשרת לנו להבדיל בהצלחה בין תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ב- G0, ב- G1 ושלבי S-G2/ M של מחזור התאים בטחול וניקוז בלוטות הלימפה של עכברים לאחר חיסון עם וקטורים ויראליים הנושאים את מחסום האנטיגן של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1.
צעדים קריטיים של השיטה היו הבחירה של צבע ה- DNA ואסטרטגיית הגינג כדי להגביר את רגישות הבדיקה ולכלול תאי T פעילים / מתרבים מאוד ספציפיים לאנטיגן שהיו חסרים על ידי הקריטריונים הנוכחיים של ניתוח. צבע הדנ"א, Hoechst 33342, איפשר לנו להשיג אפליה באיכות גבוהה של פסגות ה- DNA G0/ G1 ו- G2/ M, תוך שמירה על ממברנה וכתמים תאיים. לשיטה פוטנציאל גדול להגדיל את הידע על תגובת תאי T ב- vivo ולשפר את ניתוח ניטור האימונו.

שלבי מחזור התאים של תאים מטחול, LNs ו- BM של עכברי Balb/c נותחו באמצעות צבע ה- DNA הפלואורסצנטי, Hoechst, ו- Anti-Ki67 mAb, על פי הפרוטוקול המסוכם באיור 1. כתמים אלה אפשרו את הבידול של תאים בשלבים הבאים של מחזור התא: G0 (Ki67neg, עם 2N של DNA המוגדרים כ- DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) ו- S-G2/M (Ki67pos, עם תוכן DNA המורכב בין 2N ל- 4N, או שווה ל- 4N של DNA המוגדר כ- DNAintermediate / גבוה).
ביצענו תחילה ניתוח מחזור תאים של תאי BM כדי לשחזר תוצאות שפורסמו בעבר13,14 ולאחר מכן ניתחנו את התאים מעניינים, כלומר, תאי CD8 T. איור 2 מציג דוגמה טיפוסית לניתוח מחזור תאים של תאי BM(איור 2A). הפרוטוקול הניב מקדם נמוך של וריאציה (CV) של פסגות DNA G0/ G1 ו- G2/ M, המציין את האיכות המצוינת של כתמי ה- DNA (איור 2B, המציג דוגמה עם קורות < 2.5; קורות העיר תמיד היו < 5 בכל הניסויים).
לאחר מכן יישמנו את אותו פרוטוקול על תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן מעכברים מחוסנים. עכברי BALB/c חוסנו נגד איסור הפרסום האנטיגן של HIV-1 באמצעות Chad3-gag עבור priming ו- MVA-gag לחיזוק, שניהם מהונדסים לשאת HIV-1 איסור פרסום. ביום (ד) 3 לאחר דחיפה, ניתחנו את התדירות של תאי CD8 T ספציפיים למחסום מהטחול ו- LNs מתנקז. ניצלנו את אסטרטגיית הגטינג החדשה שהוגדרה עבור תאי T בשלב המוקדם של התגובה החיסונית, אשר בניגוד לאסטרטגיה הקונבנציונלית, מתאימה לאיתור תאי CD8 T מגיבים אנטיגן מופעלים מאוד12. ביצענו את האסטרטגיה החדשה בחמישה שלבים הבאים. בשלב 1, לא כללנו מכפילים או אגרגטים על ידי שער DNA-A / -W, ובצעד 2, זיהינו תאים חיים על ידי אי הכללת סמן תא מת. בשלב 3, זיהינו את אוכלוסיית העניין באמצעות שער FSC-A / SSC-A לא קונבנציונאלי(איור 3A)במקום שער הלימפוציטים הצר הקנוני12. לאחר ההסתמכות על CD3+CD8+ תאים (שלב 4 באיור 3A), זיהינו תאי CD8 T ספציפיים למחסום באמצעות שני מולטימרים שונים של MHC, כלומר, Pent-gag ו- Tetr-gag (שלב 5 באיור 3A). השתמשנו בשני ריבוי מולטימרים במקום באחד כדי לשפר את הרגישות של זיהוי תאי CD8 T ספציפיים למחסום בעכברים מחוסנים, מבלי להגדיל את הרקע הכתים בעכברים לא מטופלים(איור 3B ו- C,שלב 5). לכן, הבחנו בהצלחה בעכברים לא מטופלים (0.00% ו-0.00% תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ב- LNs וטחול, בהתאמה) מעכברים מחוסנים (0.46% ו-0.29% תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ב- LNs וטחול, בהתאמה, איור 3B ו- C).
ראוי לציין, הפרוטוקול אפשר לנו רקע נמוך מאוד בשער תא CD8 T ספציפי אנטיגן של LNs וטחול של עכברים לא מטופלים (בדרך כלל 0.00% ובמקסימום 0.02%). ההשוואה של עלילות FSC-A / SSC-A ספציפיות למחסום הראתה כי לתאים הספציפיים למחסום היו SSC-A ו- FSC-A גבוהים (איור 3D),המאשרים את הצורך להשתמש בשער FSC-A / SSC-A "רגוע" כדי ללכוד תאים אלה. לאחר מכן הערכנו את האחוזים של תאי CD8 T ספציפיים למחסום בשלבי מחזור תאים שונים (איור 4A). מצאנו כי תאי CD8 T ספציפיים לטחול ואפילו יותר ב- LNs הניקוז הכילו שיעור גבוה של תאים בשלבי S-G2/ M ביום 3 לאחר דחיפה (18.60% ו 33.52%, בהתאמה).
יתר על כן, מצאנו כי תאי CD8 T ספציפיים למחסום בשלבי S-G2/ M היו FSC-A ו- SSC-A גבוהים, כאשר הם מכוסים על סך תאי CD8 T מאותו איבר (איור 4B). ביטוי CD62L על-ידי תאי CD8 T ספציפיים למחסום היה נמוך, כצפוי עבור תאי T מופעלים, למעט כמה תאים ב- G0 ב- LNs (איור 4C). בסך הכל, תוצאות אלה אישרו כי השער "הרגוע" (שלב 3 של איור 3A, B ו- C) נדרש לכלול את כל תאי ה- CD8 T הספציפיים לאנטיגן12. הפרוטוקול היה בעל ערך רב להערכת "תמונת מצב" של שלבי מחזור התא של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בזמן הניתוח ושל ביטוי CD62L לפי תאים בשלבי מחזור תאים שונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> איור 1: ערכת הפרוטוקול לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> איור 2: ניתוח מחזור תאים של תאי BM. תאי BM מעכברי Balb/c לא מטופלים הוכתמו ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. (א) דוגמה לאסטרטגיית גטינג. גודרנו על תאים בודדים בחלקת ה- DNA-A / W (משמאל) ולאחר מכן על תאים חיים על ידי אי הכללת צבע תא מת (באמצע). לאחר מכן, שער FSC-A/SSC-A "רגוע" שימש עבור כל תאי ה- BM (מימין). (ב) דוגמה לניתוח מחזור תאים של תאי BM (משמאל). השתמשנו בשילוב של Ki67 וכתמי DNA כדי לזהות תאים בשלבים הבאים של מחזור התא: G0 (רבע שמאלי תחתון, תאי Ki67neg-DNAlow), G1 (רבע שמאלי עליון, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (רבע ימני עליון, Ki67pos-DNAintermediate/high). פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) של Ki67 mAb (אמצע) והיסטוגרמה DNA (מימין) מוצגים. בעלילת היסטוגרמה של ה- DNA, השערים השמאליים והימנים תואמים ל- G0/ G1 ולשיא ה- DNA G2/ M, בהתאמה, והמספרים מייצגים את מקדמי השונות (קורות העיר) של כל פסגה. בכל התוויות האחרות, המספרים מייצגים אחוזי תאים בשערים שצוינו. האיור מראה 1 ניסוי מייצג מתוך 5. בכל ניסוי, ניתחנו תאי BM מ-3 עכברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> איור 3: ניתוח תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן מ-LNs וטחול. עכברי Balb/c היו מוכנים תוך שרירית (i.m.) עם צ'אד3-gag ועודד i.m. עם MVA-gag. ביום 3 לאחר דחיפה, ניקוז LN ותאי טחול מעכברי בקרה מחוסנים ולא מטופלים הוכתמו ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. (א) ערכה של אסטרטגיית הג'יטינג בחמישה שלבים לזיהוי תאים בודדים (שלב 1); תאים חיים (שלב 2); לימפוציטים (שלב 3); תאי CD8 T (שלב 4); ותאים ספציפיים למחסום (שלב 5). (B-C) דוגמה לחלקות: ניתוח תאים מ- (B) LNs ו- (C) טחול של עכברים לא מטופלים (עליונים) ומבוגרים (למטה). זיהינו תאים בודדים על עלילת DNA-A / -W בשלב 1. ואז, בשלב 2, בחרנו תאים חיים על ידי אי-הכללה של תאים מתים. בשלב 3, השתמשנו בשער "רגוע" לא קנוני ללימפוציטים. בשלב 4, זיהינו תאי CD8 T לפי הביטוי הכפול שלהם של CD3 ו- CD8. לאחר מכן זיהינו תאים ספציפיים למחסום ולא ספציפיים למחסום בשלב 5, בהתבסס על יכולתם לקשור את H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) ו- H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), או לא, בהתאמה. (D) פרופילי FSC-A/SSC-A של תאים ספציפיים לבדיחה (כחול) ולא ספציפיים לחסימה (אפורה) לאחר ההסתה כמתואר לעיל. מספרים מייצגים אחוזי תאים בשערים שצוינו. האיור מראה 1 ניסוי מייצג מתוך 5. בכל ניסוי, ניתחנו טחול משותף ואיחדנו תאי LN מ-3 עכברים מחוסנים ו-3 עכברים לא מטופלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> איור 4: ניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן. עכברים חוסנו כמו באיור 3 וניתוח מחזור התאים של תאים ספציפיים למחסום ערך ביום השלישי לאחר הדחיפה, לאחר שצעדו ב-5 שלבים כמו באיור 3. (A)דוגמה לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים ל- LNs (למעלה) וטחול (למטה) של עכברים מחוסנים. שלבי מחזור התא זוהו באיור 2B. הלוחות מייצגים תאים ב- G0, ב- G1, וב- S-G2/M (משמאל) ובפלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) של Ki67 mAb (מימין). מספרים מייצגים אחוזי תאים בשערים שצוינו. (B) התוויות נקודות FSC-A/SSC-A המציגות תאי CD8 T ספציפיים למחסום בשלבי S-G2/M (באדום) עם כיפה על סך כל תאי CD3+CD8+ T (באפור) מ- LNs (למעלה) וטחול (למטה) של עכברים מחוסנים. (ג) היסט היסטוגרמה המציגה ביטוי CD62L על-ידי תאי CD8 T ספציפיים למחסום ב- G0 (ירוק), ב- G1 (כחול) וב- S-G2/M (אדום) מ- LNs (למעלה) וטחול (למטה) של עכברים מחוסנים. צירי ה- y מציינים מספר אירועים מנורמל. האיור מציג דוגמה מייצגת אחד מתוך 5 ניסויים עצמאיים עם סך של 15 עכברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
חומר משלים: הגדרות ציטומטר זרימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

הרחבת ציפורן היא תכונה מרכזית של תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן. עם זאת, מחזור התא של תאי T מגיב אנטיגן נחקר בצורה גרועה, בין היתר בגלל מגבלות טכניות. אנו מתארים שיטה ציטומטרית זרימה לנתח באופן קלוני הרחבה תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן בטחול ובלוטות הלימפה של עכברים מחוסנים.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת DNA/Ki67 לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בעכברים מחוסנים

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

הפרוטוקול שלנו מספק גישה מעשית שבאמצעותה טחול עכבר ובלוטות לימפה ניתן להשתמש כדי לשקף את הדינמיקה של תגובת תא T גדול יותר מאשר מתן תמונה פנוטיפית במצב יציב. הטכניקה שלנו מזהה ברגישות תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן העוסקים בתגובה מתמשכת. תאי CD8 T מתרבים נמדדים ללא ההשפעות המבלבלות של טיפול תרופתי ב- vivo או העברת תאים.הטכניקה שלנו יכולה לספק חלון בדינמיקה החיסונית במספר הגדרות. לדוגמה, ביחס לתגובה לחיסון וזיהומים, מחלות אוטואימוניות ואימונותרפיה לסרטן. הכן מאגר שטיפה טרי של 1x permeabilization על ידי דילול מאגר פרמזיזציה של פי 10 עם מים מזוקקים וסינן אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר כדי למנוע אגרגטים.לדלל נוגדן חד שבטי Ki67 FITC ב 1x permeabilization לשטוף חוצץ כפי שנקבע עם ניסוי titration עבור נפח סופי של 100 microliters לכל מדגם. הוסף 3 מיליליטר של 1x permeabilization לשטוף חוצץ לכל צינור עם תאים צנטריפוגה ב 400 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את סופר-טבעי.שוב, מוסיפים את 1x permeabilization לשטוף חוצץ צנטריפוגה כדי גלולה את התאים. לאחר מכן, זרוק את סופרנטנט. הוסף 100 מיקרוליטרים של נוגדן חד שבטי מדולל Ki67 FITC לכדור, ואז מערבולת ודגרה במשך 30 דקות בחושך.לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של 1x permeabilization חוצץ, centrifuging לאחר כל לשטוף, ולהשליך את supernatant. הוסף 350 מיקרוליטרים של PBS לכדור התא כדי שדגימות יירכשו ישירות בציטומטר הזרימה ו -250 מיקרוליטרים של PBS לכדור התא כדי שדגימות יתדגרו עם Hoechst להכתמת DNA. הכן את תמיסת Hoechst ו- PBS והוסף אותו לכל דגימה כך שהריכוז הסופי הוא שני מיקרוגרם למיליליטר.מערבולת ודגרה הדגימות במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגות הדגימות במשך חמש דקות ולהוסיף 350 microliters של PBS לכדור התא. פתח את התוכנה וצור קבוצות שונות המתאימות לאיברים השונים שיש לנתח על-ידי לחיצה על צור קבוצה"במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה.פתח את חלון הקבוצה שהשתנה על-ידי לחיצה כפולה על שם הקבוצה וסנכרן את הקבוצות החדשות שנוצרו על-ידי הוספת סימן ביקורת על הפונקציה המסונכרנת. גרור כל קובץ FCS לקבוצה המתאימה לו ולאחר מכן צור אסטרטגיית gating החל מקבוצת a-LN. פתח את חלון הגרף על-ידי לחיצה כפולה על המדגם המוכתם במלואו כדי להציג את האירועים המנוכרים שנרכשו עבור המדגם בפתיחת נקודה.שים לב שציר ה- x ו- y מסומנים כמו בקבצי FCS, כפי שצוין בטבלה שתיים של קובץ הגדרות ציטומטר הזרימה של כתב יד זה. ודא כי מוצג מספר מספיק של אירועים עבור פריט חזותי מתאים. במידת הצורך, פתח העדפות על-ידי לחיצה על סמל הלב ברצועת הכלים של סביבת העבודה, בחר תרשימים ולאחר מכן נקודה התוויית "כסוג גרף, ובדוק שמספר הנקודות שצוירו בתיבה המתאימה הוא נכון או לשנות אותו.הצג את האירועים המנוכרים בחלון הגרף בפתילת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- DNA-W בציר ה- y. השתמש בקנה מידה ליניארי עבור שני הצירים. במידת הצורך שנה קנה מידה לוגריתמי ליניארי על-ידי לחיצה על התיבה המצוינת עם T קרוב לכל ציר בחלון התרשים.בחר אוכלוסיית תא בודד על-ידי לחיצה על מלבן במקטע כלי הגינג ולאחר מכן לחץ פעמיים במרכז השער המלבני כדי להציג תאים בודדים בפתילת נקודה עם פרמטר FSC-A בציר x ותא מת מת על ציר ה- y. לחץ על המצולע כדי לבחור את אוכלוסיית התאים החיים, אשר שליליים למות תאים מתים. לחץ פעמיים במרכז שער המצולע כדי להציג את התאים בפתילציית נקודה עם הפרמטר FSC-A בציר x והפרמטר SSC-A בציר ה- y.לחץ על מלבן וליצור שער רגוע לכלול את כל התאים החיים יחיד בגרף זה. לחץ פעמיים במרכז השער הרגוע כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם CD3 בציר ה- x ו- CD8 בציר ה- y. השתמש בסולם הגישה המתאים לפריט חזותי בחלון התרשים.במידת הצורך, שנה את סולם x ו- y על-ידי לחיצה על התיבה, המצוינת עם T קרוב לכל ציר, בחר התאמה אישית של פונקציית Access ושנה עשורים נוספים של שלילה עם בסיסים ועשורים חיוביים לפי הצורך. בחר את התקליטורים +CD8+על-ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז שער CD3+CD8+כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם Tetr-gag על ציר ה- x ו- Pent-gag על ציר ה- y.בחר את תאי ה- CD8 T הספציפיים לאנטיגן על-ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז השער הספציפי למחסום כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 על ציר ה- y. בחר את התאים בשלבי מחזור התא השונים על ידי לחיצה על Quad"במקטע כלי הגינג של חלון התרשים.העתק את אסטרטגיית הגטינג שנוצרה במדגם אחד לקבוצה המתאימה כדי להחיל את השערים על כל הדגימות של הקבוצה. לאחר מכן העתק אסטרטגיות גטינג עבור קבוצות הטחול b ו- CBM, כמתואר בכתב היד של הטקסט. ודא שכל השערים מתאימים לכל מדגם של שלוש הקבוצות.במידת הצורך, בטלו את סנכרון הקבוצה ושנו שערים כמתואר בכתב היד. הצג את תאי ה- BM של השער הרגוע בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 על ציר ה- y. הצג את התוצאות באופן חזותי על-ידי לחיצה על עורך הפריסה", במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה.גרור כל שער של אסטרטגיית הג'יטינג בחלונית לדוגמה לעורך הפריסה והצב את התוויות בהתאם לרצף הג'יטינג. במידת הצורך, שנה את סוג התרשים על-ידי לחיצה כפולה על התוויית התוויה המתאימה בפריסה ובחירת הסוג המתאים בחלון הגדרת התרשים. לחץ על הקבוצה וחזר על ידי פונקציות ברצועת הכלים לפריסה כדי לדמיין את התוצאות שהושגו בתאי CD8 T ספציפיים אנטיגן מכל איבר ולהשוות דגימות שונות.דמיינו תוצאות של תאי מח עצם המייצגים שליטה חיובית. דוגמה אופיינית לניתוח מחזור התא של תאי מח העצם מוצגת כאן. הפרוטוקול הניב מקדם נמוך של וריאציה של G0 ל- G1 ו- G2 לפסגות DNA M, המציין איכות מעולה של כתמי ה- DNA.אסטרטגיית גטינג בת חמישה שלבים הופעלה כדי לזהות תאי CD8 ספציפיים לאנטיגן. שני multimers שימשו כדי לשפר את הרגישות של זיהוי תאי CD8 T ספציפיים למחסום בעכברים מחוסנים מבלי להגדיל את הרקע הכתים בעכברים לא מטופלים. תאי CD8 T ספציפיים למחסום הניקוז ובטחול מכילים שיעור גבוה של תאים בשלבי S-G2/M ביום השלישי לאחר הדחיפה.יתר על כן, תאי CD8 T ספציפיים למחסום בשלבי S-G2/M היו בעלי FSC-A ו- SSC-A גבוהים כאשר הם היו על גבי תאי ה- CD8 T הכוללים מאותו איבר. היסטוגרמות היסטות הראו כי ביטוי CD62L על ידי תאי CD8 T ספציפיים למחסום היה נמוך, כצפוי עבור תאי T מופעלים, למעט כמה תאים ב- G0 בבלוטות הלימפה. שיטה זו מיועדת לתאי T כדי להשיג איכות מצוינת של כתמי DNA יחד עם הממברנה והכתמת Ki67.ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה הוא נקודת מפתח. הקפד להשתמש בבקרה מתאימה למיקום השער. בשיטה זו גילינו תאי T בשלבי S-G2/M של מחזור התאים בעכבר ובדם ההיקפי האנושי.טכניקה זו הייתה שימושית במחקרים ניטור אימונו בסוכרת מסוג 1, מונונוקלאוזיס זיהומיות, ו- COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...