Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

इस काम को रीटहेरा द्वारा समर्थित किया गया था, एमआईयूआर परियोजना 2017K55HLC_006 द्वारा, और 5 × 1000 अनुदान से एसोसियाज़िओन इटालियना राइसर्का सुल कैन्रो (एआईआरसी)। निम्नलिखित टेट्रामर को एनआईएच टेट्रामर सुविधा के माध्यम से प्राप्त किया गया था: एपीसी-संयुग्मित एच-2के (डी) एचआईवी गैग 197-205 AMQMLKETI।

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	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. 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ए फोल्गोरी और एस कपोन Reithera Srl के कर्मचारी हैं । ए निकोसिया पेटेंट आवेदन WO 2005071093 (A3) "चिंपांजी adenovirus वैक्सीन वाहक पर आविष्कारक नामित किया गया है." अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हालांकि टी सेल क्लोनल विस्तार का गहनता से अध्ययन किया गया है, कुछ पहलू अज्ञात रहते हैं, ज्यादातर क्योंकि इसकी जांच करने के लिए उपलब्ध उपकरण कुछ हैं और उनकी अपनी कमियां हैं। इस नजरिए से, हम एक माउस मॉडल में टीकाकरण के बाद शुरुआती समय में एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं के कोशिका चक्र का विश्लेषण करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि स्थापित करते हैं। प्रोटोकॉल Ki67 और डीएनए धुंधला के संयोजन पर आधारित है, जिसका उपयोग पहले चूहों13, 14में बीएम हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के कोशिका चक्र का विश्लेषण करने के लिए कियागयाथा। एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए, हमें डीएनए डाई का चुनाव, विभिन्न नमूनों में तुलनीय डीएनए धुंधला प्राप्त करने के लिए उपयुक्त शर्तों और डेटा विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति सहित कुछ महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार करना पड़ा।
डीएनए स्टेनिंग के लिए कई रंग उपलब्ध हैं, जिनमें प्रोपिडियम आयोडाइड और 7-अमीनोएक्टिनोमाइसिन डी शामिल हैं; हमने Hoechst को चुना क्योंकि यह झिल्ली धुंधला और Ki67 धुंधला के लिए आवश्यक हल्के निर्धारण/ इसके साथ ही, Hoechst के साथ धुंधला हमें उत्कृष्ट गुणवत्ता का एक डीएनए हिस्टोग्राम प्राप्त करने की अनुमति दी, यानी, जी0/जी1 और जी2/एमडीएनए चोटियों में आमतौर पर अन्य डीएनए रंगों के साथ प्राप्त डीएनए चोटियों की तुलना में भिन्नता (सीवी) का बहुत कम गुणांक था, उदाहरण के लिए, DRAQ519। दरअसल, Hoechst20जीवित कोशिकाओं में भी डीएनए दाग कर सकते हैं ।
एक ही प्रयोग के विभिन्न नमूनों में Hoechst तीव्रता में उतार-चढ़ाव से बचने के लिए कुछ रणनीतियों का उपयोग किया गया था। समय के दौरान डाई तीव्रता की गिरावट को कम करने के लिए प्रवाह साइटोमीटर पर नमूना अधिग्रहण से ठीक पहले Hoechst धुंधला प्रदर्शन किया गया था। कई नमूनों के साथ बड़े प्रयोगों में प्रोटोकॉल को पुन: उत्पन्न करने में रुचि रखने वालों के लिए, हम एक समय में कुछ नमूनों पर Hoechst धुंधला प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। एक अन्य दोष यह है कि डाई के साथ इनक्यूबेशन के दौरान होचस्ट तीव्रता को सेल नंबर से भारी प्रभावित किया जा सकता है। इस कारण से, हम दृढ़ता से हमेशा कोशिकाओं की एक ही संख्या और डीएनए धुंधला के लिए प्रति नमूना एक ही मात्रा का उपयोग करने की सलाह देते हैं । यदि प्रवाह साइटोमीटर पर अधिग्रहण के लिए कोशिकाओं की एक उच्च संख्या की आवश्यकता होती है, तो हम दो या अधिक समान नमूने तैयार करने की सलाह देते हैं और फिर होचस्ट स्टेनिंग चरण से ठीक पहले उन्हें विलय करते हैं।
प्रोटोकॉल का एक प्रमुख बिंदु डेटा विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति है। हमने हाल ही में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शुरुआती समय में टी सेल विश्लेषण के लिए एक उपन्यास रणनीति प्रकाशित की है, जिसने हमें एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं12का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने की अनुमति दी। हमने इस रणनीति को इस प्रकार दिखाए गए डेटा पर लागू किया है। सबसे पहले, हम डीएनए-ए/डब्ल्यू साजिश में सेल समुच्चय को बाहर रखा । दूसरा, मृत कोशिकाओं को बाहर निकालने के बाद, हमने एफएससी/एसएससी प्लॉट ("आराम से गेट") में काफी बड़े लिम्फोसाइट गेट का इस्तेमाल किया। इस रणनीति के द्वारा, हम एस-जी 2 /एम में अत्यधिक सक्रिय एंटीजन-विशिष्टसीडी8टी कोशिकाओं को शामिल करने में सक्षम थे जो आमतौर पर वर्तमान गेटिंग रणनीतियों से चूक जाते हैं, क्योंकि इन कोशिकाओं में उच्च एफएससी-ए और एसएससी-ए होते हैं। संक्षेप में, डेटा विश्लेषण विधि के एक महत्वपूर्ण भाग का प्रतिनिधित्व करता है, जो सक्रिय/एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का एक संवेदनशील पता लगाने को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
विधि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रारंभिक चरणों में महत्वपूर्ण टी सेल डेटा लापता होने की संभावना को रोकता है और टी सेल इम्यूनो-मॉनिटरिंग के लिए नए दृष्टिकोण खोलता है। भविष्य में सुधार के लिए फॉस्फो-हिस्टोन 3 के लिए धुंधला शामिल हो सकता है जो जी2 और एम21के बीच भेदभाव की अनुमति देगा। एक वर्तमान सीमा यह है कि कोशिकाओं को तय किया जाना है और परमाणु मार्कर, Ki67 के लिए दाग के लिए व्याप्त है । इस प्रकार, कोशिकाओं का उपयोग अन्य प्रकार के विश्लेषण जैसे छंटाई और बाद के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, Hoechst सहित डीएनए रंग, आमतौर पर जीनोमिक डीएनए विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप और मूल्यांकन के इस प्रकार के लिए उपयुक्त नहीं हैं । झिल्ली मार्कर की पहचान जो विभिन्न कोशिका चक्र चरणों से सहसंबंधित होती है और जो जीवित कोशिकाओं पर दाग लगाया जा सकता है, इस सीमा को दूर कर सकता है। अंत में, इस विधि में टीकाकरण, संक्रमण, इम्यूनो-मध्यस्थता रोगों और इम्यूनो-थेरेपी जैसे कई संदर्भों में सक्रिय/प्रसार ति कोशिकाओं के मूल्यांकन की अपार संभावनाएं हैं ।

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

भोले टी कोशिकाओं क्लोनल विस्तार और एंटीजन-प्राइमिंग पर भेदभाव से गुजरना । विभेदित टी कोशिकाएं प्रभावकार कार्यों को प्रदर्शित करती हैं जो एंटीजन क्लीयरेंस के लिए आवश्यक हैं और एंटीजन-विशिष्ट स्मृति के रखरखाव के लिए, जो लंबे समय तक चलने वाली सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है। प्राथमिक प्रतिक्रिया के पहले चरणों के दौरान, लिम्फोइड अंगों में विशेष निकस के भीतर एंटीजन-पेश करने वाली कोशिकाओं (एपीसीएस) के साथ भोली टी सेल बातचीत विशाल टी सेल प्रसार को प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण है जो क्लोनल विस्तार चरण1,2,3की विशेषता है। टी सेल-एपीसी इंटरैक्शन को एंटीजन, सह-उत्तेजक संकेतों, और घुलनशील कारकों (साइटोकिन्स और केमोकिन्स) की एकाग्रता और दृढ़ता से बारीकी से विनियमित किया जाता है जोटी सेल क्लोनल संतान4,5,6,7की मात्रा और गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं।
टी सेल क्लोनल विस्तार के गहन अध्ययन के बावजूद, यह अभी भी ज्ञात नहीं है कि एंटीजन-प्राइमेड टी कोशिकाएं एंटीजन मान्यता की साइट पर अपने पूरे सेल चक्र को पूरा करती हैं, या क्या वे कोशिका चक्र प्रगति के दौरान अन्य अंगों में स्थानांतरित होते हैं। ज्ञान की यह कमी सेल चक्र विश्लेषण के लिए उपलब्ध उपकरणों के गुणों के कारण है। इनमें परमाणु मार्कर, Ki67 और सेल रंगों के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) शामिल हैं जो या तो कोशिका चक्र (जैसे ब्रोमोडेऑक्सीयूरिडीन (BrdU)) के एस-चरण से गुजरने वाली कोशिकाओं की पहचान करते हैं या बेटी कोशिकाओं और उनके पूर्वजों (जैसे, कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सुसिनिमिडिल एस्टर (CFSE)) के बीच भेदभाव करते हैं।
हालांकि, सीएफएसई और ब्रेडू जैसे सेल-लेबलिंग रंग इस दृढ़ संकल्प की अनुमति नहीं देते हैं कि क्या किसी विशेष अंग में पाई जाने वाली कोशिकाएं स्थानीय रूप से बढ़ी हैं या बल्कि डिवीजन8,9के बाद इस साइट पर चले गए थे। इसके अलावा, इंट्रान्यूक्लियर प्रोटीन, Ki67, केवल किसी भी अन्य कोशिका चक्र चरण (Ki67-सकारात्मक कोशिकाओं) में उन लोगों से जी0 (Ki67-नकारात्मक कोशिकाओं) में कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम है । इस प्रकार, Ki67 विश्लेषण सक्रिय प्रसार में कोशिकाओं को अलग नहीं करता है (यानी, एस, जी2,या एम में) जी1में उन लोगों से, जो या तो जल्दी से विभाजन के लिए प्रगति या जी1 में लंबी अवधि के लिए रह सकते है या quiescence10, 11को वापस ।
यहां, हम टीका लगाए गए चूहों (चित्रा1) की तिल्ली और लिम्फ नोड्स (एलएनएस) से एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं 12 के सेल चक्र विश्लेषण के लिए एक नई प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि का वर्णनकरते हैं। यह विधि Ki67 और डीएनए धुंधला के संयोजन का शोषण करती है जिसका उपयोग पहले माउस बोन मैरो (बीएम) हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं13,14के कोशिका चक्र का विश्लेषण करने के लिए किया जाता था । यहां, हमने सीडी 8 टी सेल क्लोनल विस्तार के विश्लेषण के लिए हाल ही में प्रकाशित अभिनव गेटिंग रणनीति12के साथ-साथ Ki67 प्लस डीएनए धुंधला को सफलतापूर्वक लागू किया। हम जी 0 में एंटीजन-विशिष्ट सीडी8टी कोशिकाओं के बीच स्पष्ट रूप से भेदभाव करने में सक्षम थे, जी1में, और एस-जी2/एमचरणों में तिल्ली में और टीका लगाया चूहों के एलएन draining ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

वीवो में एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के कोशिका चक्र की जांच कुछ तरीकों का उपयोग करके की गई है, जिनमें से सभी के पास कुछ सीमाएं हैं। ब्रोमोडेऑक्सीयूरिडीन (BrdU) उन कोशिकाओं को चिह्नित करता है जो हाल ही में पूरे किए गए एस-चरण में हैं, और कार्बोक्सीफ्लोरेसेइन एससीआईनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) विभाजन के बाद बेटी कोशिकाओं का पता लगाता है। हालांकि, ये रंग विश्लेषण के समय सेल चक्र चरण की पहचान की अनुमति नहीं देते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण Ki67 का फायदा उठाने के लिए है, एक मार्कर जो शांत चरण जी 0 को छोड़कर कोशिका चक्र के सभी चरणों में कोशिकाओं द्वारा अत्यधिक व्यक्त कियाजाताहै। दुर्भाग्य से, Ki67 आगे भेदभाव की अनुमति नहीं देता है क्योंकि यह एस-चरण में कोशिकाओं को अलग नहीं करता है जोजी-1 में उन लोगों से माइटोसिस के लिए प्रतिबद्ध हैं जो इस चरण में रह सकतेहैं, साइकिल िंग में आगे बढ़ें, या जी0में चले जाएं।
यहां, हम माउस माध्यमिक लिम्फाइड अंगों में विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में टी कोशिकाओं के "स्नैपशॉट" पर कब्जा करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि का वर्णन करते हैं। विधि प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) -पेप्टाइड-मल्टीमर स्टेनिंग और एक अभिनव गेटिंग रणनीति के साथ Ki67 और डीएनए धुंधला को जोड़ती है, हमें सफलतापूर्वक जी 0 में एंटीजन विशिष्ट सीडी8टी कोशिकाओं के बीच अंतर करने की अनुमति, जी1 में और एस-जी2/एमचरणों में तिल्ली में कोशिका चक्र के और वायरल वैक्टर के साथ टीकाकरण के बाद चूहों के लिम्फ नोड्स को मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी)-1 के मॉडल एंटीजन गैग ले जाने के बाद ।
विधि के महत्वपूर्ण कदम डीएनए डाई और गेटिंग रणनीति का चुनाव परख संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए और अत्यधिक सक्रिय/प्रसार एंटीजन विशिष्ट टी कोशिकाओं है कि विश्लेषण के वर्तमान मापदंड से याद किया गया होता शामिल थे । डीएनए डाई, Hoechst ३३३४२, हमें जी0/जी 1और जी2/एमडीएनए चोटियों के एक उच्च गुणवत्ता वाले भेदभाव प्राप्त करने के लिए सक्षम है, जबकि झिल्ली और इंट्रासेलुलर धुंधला संरक्षण । विधि वीवो में टी सेल प्रतिक्रिया के बारे में ज्ञान बढ़ाने के लिए और इम्यूनो निगरानी विश्लेषण में सुधार करने के लिए महान क्षमता है ।

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A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

क्लोनल विस्तार एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रिया की एक प्रमुख विशेषता है। हालांकि, एंटीजन-प्रतिक्रिया टी कोशिकाओं के सेल चक्र खराब जांच की गई है, आंशिक रूप से तकनीकी सीमाओं की वजह से । हम टीका लगाए गए चूहों की तिल्ली और लिम्फ नोड्स में एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं के क्लोनी विस्तार का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि का वर्णन करते हैं।

टीका लगाया चूहों में एंटीजन विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं के सेल चक्र विश्लेषण के लिए एक डीएनए/Ki67 आधारित प्रवाह साइटोमेट्री परख

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

हमारा प्रोटोकॉल एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसके द्वारा माउस तिल्ली और लिम्फ नोड्स का उपयोग स्थिर-राज्य फेनोटाइपिक स्नैपशॉट प्रदान करने से अधिक टी सेल प्रतिक्रिया के गतिशील को प्रतिबिंबित करने के लिए किया जा सकता है। हमारी तकनीक संवेदनशीलता से एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं का पता लगाती है जो चल रही प्रतिक्रिया में लगे हुए हैं। सीडी 8 टी कोशिकाओं का प्रसार वीवो दवा उपचार या सेल हस्तांतरण में संभवतः भ्रामक प्रभावों के बिना मापा जाता है।हमारी तकनीक कई सेटिंग्स में प्रतिरक्षा गतिशीलता में एक खिड़की प्रदान कर सकती है। उदाहरण के लिए, टीकाकरण और संक्रमण, ऑटोइम्यून रोगों और कैंसर इम्यूनोथेरेपी के जवाब के संबंध में। आसुत पानी के साथ 10x परमेबिलाइजेशन बफर को पतला करके ताजा 1x परमेबिलाइजेशन वॉश बफर तैयार करें और इसे एग्रीगेट्स को खत्म करने के लिए 0.45 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।1x परमेबिलाइजेशन वॉश बफर में एकेक्लोनल एंटीबॉडी Ki67 फिटसी को प्रति नमूना 100 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा के लिए एक टिटरेशन प्रयोग के साथ निर्धारित किया गया है। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 400 ग्राम पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के साथ प्रत्येक ट्यूब में 1x पर्मेबिलाइजेशन वॉश बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें। सुपरनेट को त्याग दें।फिर, कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 1x परमेबिलाइजेशन वॉश बफर और अपकेंद्रित्र जोड़ें। इसके बाद सुपरनिटेंट को त्याग दें। गोली में पतला मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Ki67 FITC के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर भंवर और अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 1x पारमेबिलाइजेशन बफर के 4 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं, प्रत्येक धोने के बाद अपकेंद्री करें, और सुपरनैट्रेशन को त्यागें। नमूनों के लिए सेल गोली के लिए पीबीएस के ३५० माइक्रोलीटर जोड़ें सीधे प्रवाह साइटोमीटर पर प्राप्त किया जा करने के लिए और नमूनों के लिए सेल गोली के लिए PBS के २५० माइक्रोलीटर डीएनए धुंधला के लिए Hoechst के साथ इनक्यूबेटेड किया जाएगा । Hoechst और PBS समाधान तैयार करें और इसे प्रत्येक नमूने में जोड़ें ताकि अंतिम एकाग्रता दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर हो।भंवर और अंधेरे में 15 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट। फिर, पांच मिनट के लिए नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और सेल पेलेट में पीबीएस के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें। सॉफ्टवेयर खोलें और कार्यक्षेत्र रिबन अनुभाग में बनाएं समूह पर क्लिक करके विश्लेषण किए जाने वाले विभिन्न अंगों के अनुरूप विभिन्न समूह बनाएं।समूह के नाम पर डबल क्लिक करके संशोधित समूह विंडो खोलें और फ़ंक्शन सिंक्रोनाइज्ड पर चेक मार्क डालकर नवसृजित समूहों को सिंक्रोनाइज करें। प्रत्येक एफसीएस फ़ाइल को अपने संबंधित समूह में खींचें, फिर ए-एलएन समूह से शुरू होने वाली गेटिंग रणनीति बनाएं। एक डॉट प्लॉट में नमूने के लिए अधिग्रहीत घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए पूरी तरह से दाग वाले नमूने पर डबल-क्लिक करके ग्राफ विंडो खोलें।ध्यान दें कि एक्स-एंड वाई-एक्सिस को एफसीएस फाइलों में लेबल किया गया है, जैसा कि इस पांडुलिपि की फ्लो साइटोमीटर सेटिंग्स फाइल की तालिका दो में दर्शाया गया है। जांच करें कि उपयुक्त दृश्य के लिए पर्याप्त संख्या में घटनाएं प्रदर्शित की जाती हैं। यदि आवश्यक हो, तो कार्यक्षेत्र रिबन में हार्ट आइकन पर क्लिक करके प्राथमिकताएं खोलें, ग्राफ का चयन करें, फिर डॉट प्लॉट"ग्राफ प्रकार के रूप में, और जांचें कि संबंधित बॉक्स में खींचे गए डॉट्स की संख्या सही है या इसे बदलें।एक्स-एक्सिस पर डीएनए-ए और वाई-एक्सिस पर डीएनए-डब्ल्यू के साथ एक डॉट प्लॉट में ग्राफ विंडो में अनगेटेड घटनाओं को प्रदर्शित करें । दोनों अक्षों के लिए रैखिक पैमाने का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो तो ग्राफ विंडो में प्रत्येक धुरी के करीब टी के साथ इंगित बॉक्स पर क्लिक करके लॉगरिथम से रैखिक तक का पैमाना बदलें।गेटिंग टूल सेक्शन में आयत पर क्लिक करके एकल सेल आबादी का चयन करें फिर आयताकार गेट के केंद्र में डबल-क्लिक करें एक्स-एक्सिस पर एफएससी-ए पैरामीटर के साथ एक डॉट प्लॉट में एकल कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए और मृत कोशिका वाई-एक्सिस पर मर जाती है। लाइव सेल आबादी का चयन करने के लिए बहुभुज पर क्लिक करें, जो मृत कोशिका मरने के लिए नकारात्मक हैं। पॉलीगॉन गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें एक्स-एक्सिस पर एफएससी-ए पैरामीटर और वाई-एक्सिस पर एसएससी-ए पैरामीटर के साथ डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए ।आयत पर क्लिक करें और उस ग्राफ में सभी एकल जीवित कोशिकाओं को शामिल करने के लिए एक आराम से गेट बनाएं। वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और सीडी8 पर सीडी 3 के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए आराम गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें। ग्राफ विंडो में दृश्य के लिए उपयुक्त पहुंच पैमाने का उपयोग करें।यदि आवश्यक हो, तो बॉक्स पर क्लिक करके एक्स और वाई स्केल को संशोधित करें, प्रत्येक धुरी के करीब टी के साथ इंगित करें, अनुकूलन एक्सेस फ़ंक्शन चुनें, और आवश्यक के रूप में कुर्सियां और सकारात्मक दशकों के साथ अतिरिक्त नेग दशकों को संशोधित करें। बहुभुज पर क्लिक करके CD3+ CD8 + कोशिकाओं का चयन करें। CD3 + CD8 + गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें एक्स-एक्सिस पर टेटर-गैग और वाई-एक्सिस पर पेंट-गैग के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए।बहुभुज पर क्लिक करके एंटीजन विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं का चयन करें। वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और Ki67 पर डीएनए-ए के साथ एक डॉट प्लॉट में कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए गैग-स्पेसिफिक गेट के केंद्र में डबल क्लिक करें। ग्राफ विंडो के गेटिंग टूल सेक्शन में क्वाड पर क्लिक करके विभिन्न सेल चक्र चरणों में कोशिकाओं का चयन करें।समूह के सभी नमूनों के लिए फाटक लागू करने के लिए इसी समूह के लिए एक नमूने में बनाई गई गेटिंग रणनीति की प्रतिलिपि। फिर पाठ पांडुलिपि में वर्णित बी-तिल्ली और सीबीएम समूहों के लिए गेटिंग रणनीतियों की प्रतिलिपि। सत्यापित करें कि सभी द्वार तीन समूहों के प्रत्येक नमूने के लिए उपयुक्त हैं।यदि आवश्यक हो, तो समूह को कम करें और पांडुलिपि में वर्णित फाटकों को संशोधित करें। वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और Ki67 पर डीएनए-ए के साथ एक डॉट प्लॉट में आराम गेट की बीएम कोशिकाओं को प्रदर्शित करें। कार्यक्षेत्र रिबन अनुभाग में लेआउट एडिटर पर क्लिक करके परिणामों की कल्पना करें।गेटिंग रणनीति के प्रत्येक गेट को लेआउट एडिटर के पास सैंपल फलक में खींचें और गेटिंग के सीक्वेंस के अनुसार प्लॉट रखें। यदि आवश्यक हो, तो लेआउट में संबंधित प्लॉट पर डबल क्लिक करके ग्राफ प्रकार बदलें और ग्राफ परिभाषा विंडो में उपयुक्त प्रकार का चयन करें। समूह पर क्लिक करें और प्रत्येक अंग से एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों की कल्पना करने और विभिन्न नमूनों की तुलना करने के लिए लेआउट रिबन पर कार्यों द्वारा फिर से शुरू करें।एक सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व बोन मैरो कोशिकाओं के परिणामों की कल्पना करें। बोन मैरो कोशिकाओं के कोशिका चक्र विश्लेषण का एक विशिष्ट उदाहरण यहां दिखाया गया है। प्रोटोकॉल जी0 से जी 1 और जी 2 से एम डीएनए चोटियों में भिन्नता का कम गुणांक निकला, जो डीएनए धुंधला की उत्कृष्ट गुणवत्ता का संकेत है ।एंटीजन विशिष्ट सीडी 8 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक पांच कदम गेटिंग रणनीति नियोजित की गई थी। अनुपचारित चूहों में धुंधला पृष्ठभूमि में वृद्धि के बिना टीका लगाया चूहों में चुप विशिष्ट सीडी 8 टी सेल का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए दो मल्टीमर्स का इस्तेमाल किया गया । गैग-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं में नाली लिम्फ नोड्स और तिल्ली में तीन दिन के बाद बढ़ावा देने पर एस-G2/M चरणों में कोशिकाओं का एक उच्च अनुपात होते हैं ।इसके अलावा, एस-G2/M चरणों में गैग-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं में उच्च एफएससी-ए और एसएससी-ए था जब एक ही अंग से कुल सीडी8 टी कोशिकाओं पर मढ़ा । ऑफसेट हिस्टोग्राम से पता चला है कि गैग-विशिष्ट सीडी 8 टी कोशिकाओं द्वारा CD62L अभिव्यक्ति कम थी, जैसा कि सक्रिय टी कोशिकाओं के लिए उम्मीद थी, लिम्फ नोड्स में G0 में कुछ कोशिकाओं को छोड़कर। इस विधि टी कोशिकाओं के लिए बनाया गया है झिल्ली और Ki67 धुंधला के साथ एक साथ धुंधला डीएनए की एक उत्कृष्ट गुणवत्ता को प्राप्त करने के लिए ।फ्लो साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण एक महत्वपूर्ण बिंदु है। गेट पोजिशनिंग के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग करना सुनिश्चित करें। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने माउस और मानव परिधीय रक्त में कोशिका चक्र के एस-जी2/एम चरणों में टी-कोशिकाओं की खोज की ।यह तकनीक टाइप 1 मधुमेह, संक्रामक मोनोन्यूक्लियोसिस और कोविड-19 में इम्यूनो-मॉनिटरिंग अध्ययन में उपयोगी थी।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर murine aortas Cytometry विश्लेषण फ्लो

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

कुशल के लिए खूनी कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं (KaAPC)<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की कमी

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Nanoparticle के टीकाकरण के बाद के विश्लेषण से प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए पूरे पशु इमेजिंग और प्रवाह cytometric तकनीकों

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

स्व-प्रतिरक्षात्मकता खिलाफ स्टेम सेल व्युत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं के विकास

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

मानव पूरे रक्त में प्राकृतिक हत्यारा सेल Lytic गतिविधि का प्रवाह cytometric विश्लेषण

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Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

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सीटू में MHC-tetramer धुंधला और मात्रात्मक विश्लेषण स्थान, बहुतायत, और Phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए

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Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल के मास साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पूरे अस्थि मज्जा की तैयारी

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प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए माउस किडनी-रेजिडेंट सीडी 8+ टी कोशिकाओं का अलगाव

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...