Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

この作品は、Ronea、MIURプロジェクト2017K55HLC_006、アソシアツィオーネ・イタリアーノ・リセルカ・スル・カンクロ(AIRC)から5×1000助成金によって支援されました。以下の四トラマーはNIHテトラマー施設を通じて得られた:APC共役H-2K(d)HIVギャグ197-205 AMQMLKETI。

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. 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Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. 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A. フォルゴリとS.カポネは、特許出願WO 2005071093(A3)「チンパンジーアデノウイルスワクチンキャリア」の発明者に指名されているRona Srl.A.ニコシアの従業員です。他の著者は開示するものは何もない。

T細胞クローン拡張は集中的に研究されているが、いくつかの側面は未知のままであるが、主にそれを調査するために利用可能なツールは少なく、独自の欠点を有する。この観点から、マウスモデルでワクチン接種後早起き早期に抗原特異的CD8T細胞の細胞周期を解析する高感度フローサイトメトリック法を設定した。このプロトコルは、Ki67とDNA染色の組み合わせに基づいており、以前はマウス13,14におけるBM造血細胞の細胞周期を解析するために使用された。このプロトコルを抗原特異的CD8 T細胞に適応させるためには、DNA染料の選択、異なるサンプル間で同等のDNA染色を得るための適切な条件、データ分析のための格言戦略など、いくつかの重要な問題を考慮する必要がありました。
多くの色素は、DNA染色のために利用可能です, ヨウ化プロピジウムと7-アミノアクチノマイシンDを含む;Hoechstを選んだのは、膜染色とKi67染色に必要な軽度の固定/透過性プロトコルと互換性があったからです。同時に、Hoechstによる染色は、優れた品質のDNAヒストグラムを得ることを可能にし、すなわち、G0/G1およびG2/MDNAピークは、通常他のDNA色素で得られるDNAピークよりも変動係数(CV)がはるかに低かった、例えばDRAQ519。実際、Hoechstは生細胞20でもDNAを染色することができる。
いくつかの戦略は、同じ実験の異なるサンプルでHoechst強度の変動を避けるために使用されました。フローサイトメーターでサンプル集録の直前に、経時の色素強度の低下を最小限に抑えるために、Hoechst染色を行った。多数のサンプルを用いた大きな実験でプロトコルを再現することに興味がある方には、一度に数サンプルのHoechst染色を行うことをお勧めします。もう一つの欠点は、色素とのインキュベーション中に、Hoechstの強度が細胞数によって大きく影響されることです。そのため、DNA染色には、常に同じ数の細胞とサンプル当たりの体積を使用することを強くお勧めします。フローサイトメーターでの取得に多数の細胞が必要な場合は、2つ以上の同一サンプルを調製し、Hoechst染色工程の直前に結合することをお勧めします。
プロトコルの重要なポイントは、データ分析のための格言戦略です。我々は最近、免疫応答の早期にT細胞分析のための新しい戦略を発表し、抗原特異的T細胞12の検出の感度を高めさせた。この戦略を、以下のようにして、ここに示すデータに適用しました。まず、DNA-A/Wプロットで細胞凝集体を除外しました。第二に、死んだ細胞をゲートアウトした後、FSC/SSCプロット(「リラックスゲート」)でかなり大きなリンパ球ゲートを使用しました。この戦略により、高いFSC-AおよびSSC-Aを有するため、現在の格言戦略では通常見逃される高活性抗原特異的CD8T細胞をS-G2/Mに含めることができた。要約すると、データ分析は、活性化/増殖抗原特異的T細胞の感受性検出を得るために不可欠である方法の重要な部分を表す。
この方法は、免疫応答の初期段階で重要なT細胞データが欠落する可能性を防ぎ、T細胞免疫モニタリングのための新しい視点を開きます。将来の改善は、G2とM21の間で分化を可能にするホスホヒストン3の染色を含むかもしれません。現在の制限は、核マーカーKi67の染色には細胞を固定し、透過させなければならないということです。したがって、並べ替えやそれに続く機能解析など、他のタイプの解析にはセルを使用できません。また、Hoechstを含むDNA染料は、通常ゲノムDNA解析を妨げ、この種の評価には適さない。異なる細胞周期相と相関し、生きた細胞に染色できる膜マーカーの同定は、この限界を克服できる。結論として、この方法は、ワクチン接種、感染、免疫媒介性疾患、免疫療法などのいくつかの文脈で活性化/増殖T細胞の評価に大きな可能性を秘めています。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

ナイーブT細胞は、抗原プライミング時にクローン拡張と分化を受ける。分化されたT細胞は、抗原クリアランスや抗原特異的記憶の維持に不可欠なエフェクター機能を示し、これは長期的な保護の鍵となります。一次応答の最初のステップの間に、リンパ管内の特殊なニッチ内の抗原提示細胞(APC)とのナイーブT細胞相互作用は、クローン拡張フェーズ1、2、3を特徴付ける巨大なT細胞増殖を誘導するために重要である。T細胞-APC相互作用は、抗原の濃度および持続性によって細かく調節され、共刺激シグナル、および可溶性因子(サイトカインおよびケモカイン)がT細胞クローンの子孫4、5、6、7の量および質に影響を及ぼす。
T細胞クローナル拡張の鋭意研究にもかかわらず、抗原プライミングT細胞が抗原認識部位で細胞周期全体を完了するのか、細胞周期進行中に他の器官に移行するのかはまだ分かっていない。この知識の欠如は、細胞周期解析に利用できるツールの特性によるものです。これらには、核マーカーに特異的なモノクローナル抗体(mAbs)、Ki67、および細胞周期のS相を受けた細胞(例えばブロモデオキシウリジン(BrdU)))を識別するか、または娘細胞とその祖先(例えば、カルボキシフルオレセイン・スハクニミドリルエステル)を区別する細胞色素が含まれる。
しかし、CFSEやBrdUなどの細胞標識色素は、特定の器官に見つかった細胞が局所的に増殖するか、またはむしろ第8部、9の後にこの部位に移動したのかについて決定を許さない。また、核内タンパク質であるKi67は、G0(Ki67陰性細胞)の細胞を他の細胞周期期(Ki67陽性細胞)の細胞としか区別できない。したがって、Ki67解析では、活性増殖中の細胞(すなわち、S、G2、M)をG1内の細胞と区別せず、G1内で素早く分裂するか、またはG1に長期間滞在するか、静止10、11に戻る。
ここでは、ワクチン接種マウスの脾臓およびリンパ節(LNs)からの抗原特異的CD8 T細胞12の細胞周期解析のための新しいフローサイトメトリック法について説明する(図1)。この方法は、マウス骨髄(BM)造血細胞13,14の細胞周期を解析するために以前に使用されたKi67とDNA染色の組み合わせを利用する。ここでは、KI67とDNA染色を、最近発表された革新的な格言戦略12と共に、CD8 T細胞クローン拡張の分析にうまく適用しました。G0、G1、S-G2/M相では抗原特異的CD8 T細胞を明確に区別することができた。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

生体内の抗原特異的T細胞の細胞周期は、いくつかの方法を用いて調べられており、そのすべてがいくつかの制限を有する。ブロモデオキシウリジン(BrdU)は、S相中または最近完了した細胞をマークし、カルボキシフルオレセイン・スクシニミジルエステル(CFSE)は分裂後に娘細胞を検出する。しかし、これらの色素は分析時の細胞周期段階の同定を認めておらず。別のアプローチは、Ki67を利用することです, 静止期G0を除く細胞周期のすべての段階で細胞によって高度に発現しているマーカー.残念ながら、Ki67は、有糸分裂にコミットしているS相の細胞を、この段階に残ることができるG1の細胞から分離したり、サイクリングに進んだり、G0に移行したりしないため、さらなる分化は許されない。
ここでは、マウス二次リンパ器官における異なる細胞周期期におけるT細胞の「スナップショット」を捕捉するためのフローサイトメトリック法について述べた。この方法は、Ki67とDNA染色を主要組織適合性複合体(MHC)ペプチドマルチマー染色および革新的な格子戦略と組み合わせたものです。 ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1のモデル抗原ギャグを運ぶウイルスベクターを用いたワクチン接種後、マウスの脾臓およびリンパ節のG1およびS-G2/M相の抗原特異的CD8 T細胞の区別に成功した。 
この方法の重要なステップは、DNA色素の選択と、アッセイ感度を高め、現在の分析基準で見逃されたであろう高度に活性化/増殖する抗原特異的T細胞を含む格言戦略であった。DNA染料であるHoechst 33342は、膜と細胞内染色を維持しながら、G0/G1およびG2/M DNAピークの高品質な差別を得ることを可能にしました。この方法は、生体内でのT細胞応答に関する知識を高め、免疫モニタリング分析を改善する大きな可能性を秘めています。

図1に要約したプロトコルによれば、バルブ/cマウスの脾臓、RN、およびBM由来の細胞の細胞周期相を、蛍光DNA色素、Hoechst、および抗Ki67 mAbを用いて分析した。この染色により、細胞周期の次の段階で細胞の分化が可能となった:G 0(Ki67neg、DNAlowと定義されたDNAの2N)、G 1(Ki67pos、DNAlow)、およびS-G2/M(Ki67pos、2Nと4Nの間で構成されるDNA含有量、またはDNA中間/高と定義されるDNAの4Nに等しい)。
まず、BM細胞の細胞周期解析を行い、以前に公表された結果13,14を再現し、次に目的の細胞、すなわちCD8 T細胞を解析した。図2は、BM細胞の細胞周期解析の代表的な例を示す(図2A)。このプロトコルは、G0/G1およびG2/MDNAピークの低変動係数(CV)をもたらし、DNA染色の優れた品質を示す(図2B、CV<2.5との例を示す;CVは、すべての実験において常に5)<5)
次に、ワクチン接種を受けたマウスから抗原特異的CD8 T細胞に同じプロトコルを適用しました。BALB/cマウスは、プライミングにChad3-gagを使用し、HIV-1ギャグを運ぶように設計されたMVAギャグを増強することによって、HIV-1の抗原ギャグに対してワクチン接種を行った。日目(d)3ポストブーストでは、脾臓と排出LNからのギャグ特異的CD8 T細胞の頻度を分析した。我々は、免疫応答の初期段階におけるT細胞に対する新たに定義された格子戦略を利用したが、これは従来の戦略とは対照的に、高度に活性化された抗原応答性CD8 T細胞12を検出するのに適している。その後5つのステップで新しい戦略を実行しました。ステップ1では、DNA-A/-Wゲートでダブレットまたは凝集体を除外し、ステップ2では死細胞マーカー排除によって生細胞を同定した。ステップ3では、正規狭いリンパ球ゲート12の代わりに非従来型の「リラックスした」FSC-A/SSC-Aゲート(図3A)を用いて対象集団を同定した。CD3+CD8+細胞をギガティングした後 (図 3Aのステップ 4)、2 つの異なる MHC マルチマー、すなわち、ペントギャグと Tetr-gag (図 3Aのステップ 5) を使用して、ギャグ特異的 CD8 T 細胞を同定しました。ワクチン接種マウスにおけるギャグ特異的CD8 T細胞検出の感度を向上させるために、1個ではなく2つのマルチマーを用いたが、未治療マウスにおける染色の背景を増加させることなく(図3B及びC、ステップ5)。したがって、ワクチン接種を受けたマウス(それぞれ0.46%および0.29%の抗原特異的CD8 T細胞、図3BおよびC)から、未治療マウス(それぞれ0.00%および0.00%の抗原特異的CD8 T細胞)を同定した。
特に、このプロトコルは、LNの抗原特異的CD8 T細胞ゲートと未治療マウスの脾臓(通常0.00%および最大0.02%)のバックグラウンドを非常に低くすることができました。ギャグ特異的とギャグ特異的ではないFSC-A/SSC-Aプロットの比較は、ギャグ特異的細胞が高いSSC-AおよびFSC-A(図3D)を持っていることを示し、これらの細胞を捕捉するために「リラックスした」FSC-A/SSC-Aゲートを使用する必要性を確認した。次に、異なる細胞周期期におけるギャグ特異的CD8 T細胞の割合を評価した(図4A)。脾臓内のギャグ特異的CD8 T細胞および排水中のLNのさらに多くの細胞は、3日目のポストブースト(それぞれ18.60%と33.52%)でS-G2/M相の細胞の高い割合を含むことがわかりました。
さらに、S-G2/M相のギャグ特異的CD8 T細胞は、同じ器官から全CD8T細胞に重ね合わされた場合、FSC-AおよびSSC-Aが高いことがわかりました(図4B)。ギャグ特異的CD8T細胞によるCD62L発現は低く、活性化T細胞に対して期待通り、LNs中のG0内の数個の細胞を除く(図4C)。全体として、これらの結果は、「緩和された」ゲート(図3A、B、およびCのステップ3)が、増殖抗原特異的CD8T細胞12のすべてを含む必要があることを確認した。このプロトコルは、分析時の抗原特異的CD8 T細胞の細胞周期期の「スナップショット」評価と、異なる細胞周期期の細胞によるCD62L発現の「スナップショット」評価にとって極めて有用であった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> 図1:抗原特異的CD8T細胞の細胞周期解析用プロトコルのスキーム<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> 図2:BM細胞の細胞周期解析未治療のBalb/cマウスからのBM細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。(A)格言戦略の例DNA-A/-Wプロット(左)の単一細胞にゲートを付け、その後死細胞色素排除(中央)によって生細胞にゲートを付けた。その後、すべてのBM細胞に「リラックスした」FSC-A/SSC-Aゲートを使用しました(右)。(B)BM細胞の細胞周期解析例(左)。Ki67とDNA染色の組み合わせを使用して、細胞周期の次の段階で細胞を同定しました:G0(左下象限、Ki67neg-DNAlow細胞)、G1(左上象限、Ki67pos-DNAlow)、S-G2/M(右上象限、Ki67pos-DNA中間/高)。Ki67 mAb(中央)およびDNAヒストグラム(右)の蛍光マイナス1(FMO)制御が示されている。DNAヒストグラムプロットでは、左右のゲートはそれぞれG0/G1とG2/MDNAピークに対応し、その数は各ピークの変動係数(CV)を表します。他のすべてのプロットでは、数字は示されたゲートのセルパーセンテージを表します。図は、5の中の1つの代表的な実験を示しています。各実験では、3匹のマウスからプールされたBM細胞を分析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> 図3:LNsおよび脾臓からの抗原特異的CD8 T細胞の解析 Balb/cマウスは、チャド3ギャグで筋肉内(i.m.)をプライミングし、MVAギャグでi.mを後押しした。3日目のブースト後、ワクチン接種および未治療の対照マウスからLNおよび脾臓細胞を排出し、フローサイトメトリーによって染色および分析した。 (A) 単一細胞を同定するための5つのステップにおける格言戦略のスキーム(ステップ1)。生細胞(ステップ2);リンパ球(ステップ3);CD8 T細胞(ステップ4);そしてギャグ特異的細胞(ステップ5)。 (B-C) プロットの例 :(B)RN および (C) 未治療(上)およびワクチン接種(下)マウスの脾臓からの細胞の分析。ステップ1でDNA-A/-Wプロット上の単一細胞を同定した。そして、ステップ2では、死細胞染色除外により生細胞を選択した。ステップ3では、リンパ球に非正規の「リラックスした」ゲートを使用しました。ステップ4では、CD3とCD8の二重発現によりCD8 T細胞を同定した。次に、フルオロクロムラベル付きH-2kd-gag-Pentamer(Pent-gag)とH-2kd-gag-テトラマー(Tetr-gag)をそれぞれ結合する能力に基づいて、ステップ5でギャグ特異的細胞とギャグ特異的でない細胞を同定しました。 (D) 上記のようにガッティングした後のギャグ特異的(青)およびギャグ特異的(灰色)細胞のFSC-A/SSC-Aプロファイル。数値は、示されたゲートのセルのパーセンテージを表します。図は、5の中の1つの代表的な実験を示しています。各実験では、3つのワクチン接種マウスおよび3つの未治療マウスからプールされた脾臓およびプールLN細胞を分析した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> 図4:抗原特異的CD8T細胞の細胞周期解析マウスは、図3のようにワクチンを接種し、細胞周期分析のギャグ特異的細胞を3日目の後昇圧で行い、図3のように5段階で食い込んだ後に行った。(A)ワクチン接種マウスのLNs(上)および脾臓(下)からのギャグ特異的CD8 T細胞の細胞周期解析の例細胞周期相は図2Bに示すように同定された。パネルは、G0、G1、および S-G2/M (左)および蛍光マイナス 1 (FMO) の Ki67 mAb (右) のセルを表します。数値は、示されたゲートのセルのパーセンテージを表します。(B) S-G2/M相(赤)のギャグ特異的CD8 T細胞(赤)を示すSC-A/SSC-Aドットプロットは、リンから合計CD3+CD8+ T細胞(灰色)に重ね合せ、ワクチン接種されたマウスの脾臓(下)に重ね合った。(C)G0(緑色)においてギャグ特異的CD8T細胞によるCD62L発現を示すオフセットヒストグラムを、G1(青)において、S-G2/M(赤)で、Nから(上)および脾臓(下)ワクチン接種マウスの。y 軸は、正規化されたイベント数を示します。図は、合計15匹のマウスを用いた5つの独立した実験のうち1つの代表的な例を示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足材料: フローサイトメーターの設定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

クローン拡張は、抗原特異的T細胞応答の重要な特徴である。しかし、抗原応答性T細胞の細胞周期は、技術的な制限もあって、十分に調査されていない。ワクチン接種マウスの脾臓およびリンパ節におけるクローン膨張性抗原特異的CD8 T細胞を分析するフローサイトメトリック法について述べた。

ワクチン接種マウスにおける抗原特異的CD8 T細胞の細胞周期解析のためのDNA/Ki67ベースのフローサイトメトリーアッセイ

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

我々のプロトコルは、マウス脾臓およびリンパ節を使用して、定常型の表向きのスナップショットを提供するよりも大きいT細胞応答の動的を反映することができる実用的なアプローチを提供する。我々の技術は、応答を継続している抗原特異的CD8 T細胞を敏感に検出する。増殖CD8 T細胞は、インビボ薬物治療または細胞転移の交和作用を伴わずに測定される。我々の技術は、いくつかの設定で免疫力学のウィンドウを提供することができます。例えば、ワクチン接種および感染症への応答に関連して、自己免疫疾患、および癌免疫療法が挙げられる。蒸留水で10倍の透過バッファーを希釈して新鮮な1倍の透過性洗浄バッファーを準備し、0.45マイクロメートルのフィルターを通してろ過し、凝集体を排除します。サンプルあたり100マイクロリットルの最終体積の滴定実験で決定された1x透過性洗浄バッファーの希薄モノクローナル抗体Ki67 FITC。細胞と遠心分離器を400 Gで各チューブに1x透過洗浄バッファーの3ミリリットルを室温で5分間加えます。上清を捨てます。再度、細胞をペレットに1倍の透過性洗浄バッファーと遠心分離機を加えます。その後、上清を捨てます。希釈モノクローナル抗体Ki67 FITCを100マイクロリットルペレットに加え、次に渦を加え、暗闇の中で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4ミリリットルの1倍の透過バッファーで2回洗浄し、各洗浄後に遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットに350マイクロリットルのPBSを加えて、フローサイトメーターで直接取得するサンプルを細胞ペレットに250マイクロリットル、細胞ペレットに250マイクロリットルを加え、DNA染色のためにHoechstと共にインキュベートするサンプルを細胞ペレットに追加します。HoechstとPBS溶液を調製し、最終的な濃度が1ミリリットルあたり2マイクログラムになるように各サンプルに加えます。渦を起たし、暗闇の中で15分間サンプルをインキュベートします。次いで、サンプルを5分間遠心分離し、350マイクロリットルのPBSを細胞ペレットに加える。ソフトウェアを開き、ワークスペースリボンセクションで[グループを作成]をクリックして、分析するさまざまな臓器に対応する異なるグループを作成します。変更したグループウィンドウを開くには、グループ名をダブルクリックし、同期された関数にチェックマークを挿入して、新しく作成したグループを同期します。各 FCS ファイルを対応するグループにドラッグし、A-LN グループから開始するギャティングストラテジーを作成します。完全に染色されたサンプルをダブルクリックしてグラフウィンドウを開き、サンプルに対して取得したイベントをドットプロットで表示します。X軸およびy軸は、この原稿のフローサイトメーター設定ファイルの表2に示すように、FCSファイルのようにラベル付けされることに注意してください。適切な視覚化のために十分な数のイベントが表示されていることを確認します。必要に応じて、ワークスペースリボンのハートアイコンをクリックして環境設定を開き、グラフを選択し、次に「ドットプロット」をグラフタイプとして選択し、対応するボックスに描画されるドットの数が正しいか、それを変更することを確認します。x 軸に DNA-A、y 軸に DNA-W を使用して、グラフ ウィンドウに有数のイベントをドット プロットで表示します。両方の軸に線形スケールを使用します。必要に応じて、グラフウィンドウの各軸にT近く表示されたボックスをクリックして、スケールを対数から線形に変更します。ゲーティングツールセクションで長方形をクリックして単一のセルの母集団を選択し、長方形ゲートの中央をダブルクリックして、X軸にFSC-Aパラメータを持つドットプロットの単一セルを表示し、死んだセルがy軸に死んで表示します。ポリゴンをクリックして、死細胞死に負の生細胞集団を選択します。ポリゴン ゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に FSC-A パラメータ、Y 軸に SSC-A パラメータを使用して、ドット プロットのセルが表示されます。長方形をクリックし、リラックスしたゲートを作成して、そのグラフ内のすべての単一のライブセルを含めます。リラックスしたゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に CD3、Y 軸に CD8 を使用したドット プロットのセルが表示されます。グラフ ウィンドウでの視覚化に適切なアクセス スケールを使用します。必要に応じて、各軸に近い T で示されているボックスをクリックして x および y のスケールを変更し、[アクセス関数のカスタマイズ] を選択し、必要に応じてベースと肯定的な数十年で余分なネグ数十年を変更します。多角形をクリックして、CD3+CD8+セルを選択します。CD3+CD8+ゲートの中央をダブルクリックすると、X軸にTetr-gag、Y軸に「ペントガグ」を使用して、ドットプロットのセルが表示されます。多角形をクリックして抗原特異的CD8 T細胞を選択します。gag 固有のゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に DNA-A、Y 軸に Ki67 を持つドットプロットのセルが表示されます。グラフウィンドウのギャティングツールセクションでQuad"をクリックして、異なるセル周期フェーズのセルを選択します。1 つのサンプルで作成したゲーティングストラテジーを対応するグループにコピーして、グループのすべてのサンプルにゲートを適用します。次に、テキスト原稿に記述されているように、b-脾臓およびCBMグループの格言戦略をコピーします。すべてのゲートが 3 つのグループの各サンプルに適していることを確認します。必要に応じて、原稿に記載されているとおりにグループを同期解除し、ゲートを修正します。リラックスしたゲートのBM細胞を、x軸にDNA-A、Y軸にKi67を用いたドットプロットで表示する。ワークスペース リボン セクションの [レイアウト エディター] をクリックして結果を視覚化します。サンプルペインのゲーティングストラテジーの各ゲートをレイアウトエディタにドラッグし、ゲーティングの順序に従ってプロットを配置します。必要に応じて、レイアウト内の対応するプロットをダブルクリックし、グラフ定義ウィンドウで適切なタイプを選択して、グラフタイプを変更します。グループをクリックし、レイアウトリボン上の機能によって反復して、各器官から抗原特異的CD8 T細胞で得られた結果を視覚化し、異なるサンプルを比較します。陽性のコントロールを表す骨髄細胞の結果を視覚化します。骨髄細胞の細胞周期解析の典型的な例をここに示す。このプロトコルは、G0からG1、G2の変動係数が低く、MDNAピークに対して、DNA染色の優れた品質を示した。抗原特異的CD8細胞を同定するために5段階の格言戦略を採用した。2つのマルチマーは、未治療マウスの染色背景を増加させることなく、ワクチン接種マウスにおけるギャグ特異的CD8 T細胞検出の感受性を改善するために使用された。排出リンパ節および脾臓におけるギャグ特異的CD8 T細胞は、3日目のポストブーストでS-G2/M相中の細胞の高い割合を含む。さらに、S-G2/M相におけるギャグ特異的CD8 T細胞は、同じ器官から全CD8T細胞に重ね合った場合に高いFSC-AおよびSSC-Aを持っていた。オフセットヒストグラムは、G0リンパ節の数個の細胞を除いて、活性化T細胞に対して予想されるように、ギャグ特異的CD8 T細胞によるCD62L発現が低いことを示した。この方法は、膜およびKi67染色と一緒にDNA染色の優れた品質を達成するためにT細胞のために設計されています。フローサイトメトリーデータ解析は重要なポイントです。ゲートの位置決めには適切な制御を使用してください。この方法を用いて、マウスおよびヒト末梢血における細胞周期のS-G2/M相のT細胞を発見した。この技術は、1型糖尿病、感染性単核球症、およびCOVID-19における免疫モニタリング研究において有用であった。

Research

JoVE Journal

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