Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Reithera, av MIUR-prosjektet 2017K55HLC_006, og med 5 × 1000 stipend fra Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Følgende tetramer ble innhentet gjennom NIH Tetramer Facility: APC-konjugert H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

A. Folgori og S. Capone er ansatte i Reithera Srl. A. Nikosia er utnevnt oppfinner på patentsøknad WO 2005071093 (A3) "Chimpanzee adenovirus vaksine bærere." De andre forfatterne har ingenting å avsløre.

Selv om T-celleklonal ekspansjon har blitt intensivt studert, er noen aspekter fortsatt ukjente, hovedsakelig fordi verktøyene som er tilgjengelige for å undersøke det er få og har sine egne ulemper. Fra dette perspektivet setter vi opp en svært følsom strømningscytometrisk metode for å analysere cellesyklusen til antigenspesifikke CD8 T-celler tidlig etter vaksinering i en musemodell. Protokollen er basert på en kombinasjon av Ki67 og DNA-farging, som tidligere ble brukt til å analysere cellesyklusen til BM hematopoietiske celler hos mus13,14. For å tilpasse protokollen til antigenspesifikke CD8 T-celler, måtte vi vurdere noen kritiske problemer, inkludert valg av DNA-fargestoff, de riktige forholdene for å oppnå sammenlignbar DNA-farging på tvers av forskjellige prøver, og gatingstrategien for dataanalyse.
Mange fargestoffer er tilgjengelige for DNA-farging, inkludert propidiumjodid og 7-aminoactinomycin D; vi valgte Hoechst fordi den var kompatibel med membranfarging og den milde fikserings- / permeabiliseringsprotokollen som kreves for Ki67-farging. Samtidig tillot farging med Hoechst oss å få et DNA-histogram av utmerket kvalitet, det vil si at G0/ G1 og G2/ M DNA-toppene hadde en mye lavere variasjonskoeffisient (CV) enn DNA-topper som vanligvis oppnås med andre DNA-fargestoffer, for eksempel DRAQ519. Faktisk kan Hoechst flekke DNA selv i levende celler20.
Noen strategier ble brukt for å unngå svingningene i Hoechst-intensiteten i forskjellige prøver av samme eksperiment. Hoechst farging ble utført like før prøveanskaffelse på strømningscytometeret for å minimere nedgangen i fargeintensiteten i løpet av tiden. For de som er interessert i å reprodusere protokollen i store eksperimenter med mange prøver, anbefaler vi å utføre Hoechst-farging på noen få prøver om gangen. En annen ulempe er at Hoechst-intensiteten kan bli sterkt påvirket av cellenummer under inkubasjon med fargestoffet. Av denne grunn anbefaler vi på det sterkeste alltid å bruke samme antall celler og samme volum per prøve for DNA-farging. Hvis et høyt antall celler kreves for oppkjøp ved strømningscytometeret, anbefaler vi å forberede to eller flere identiske prøver og deretter slå dem sammen like før Hoechst-fargingstrinnet.
Et sentralt punkt i protokollen er gatingstrategien for dataanalyse. Vi publiserte nylig en ny strategi for T-celleanalyse i tidlige tider av immunresponsen, noe som tillot oss å øke følsomheten for påvisning av antigenspesifikke T-celler12. Vi brukte denne strategien på dataene som vises her som følger. Først utelukket vi cellemengder i DNA-A/W-plottet. For det andre, etter å ha stirret ut døde celler, brukte vi en ganske stor lymfocyttport i FSC / SSC-tomten ("avslappet port"). Med denne strategien var vi i stand til å inkludere høyt aktiverte antigenspesifikke CD8 T-celler i S-G2/ M som vanligvis går glipp av dagens gatingstrategier, da disse cellene har høy FSC-A og SSC-A. Oppsummert representerer dataanalysen en kritisk del av metoden, noe som er viktig for å oppnå en sensitiv deteksjon av aktiverte / proliferaterende antigenspesifikke T-celler.
Metoden forhindrer muligheten for manglende kritiske T-celledata i tidlige faser av immunresponsen og åpner nye perspektiver for T-celleimmunoovervåking. En fremtidig forbedring kan være å inkludere farging for fosfo-histone 3 som vil tillate differensiering mellom G2 og M21. En nåværende begrensning er at celler må fikses og gjennomsyres for å flekke for atommarkøren Ki67. Celler kan derfor ikke brukes til andre typer analyser, for eksempel sortering og etterfølgende funksjonsanalyse. Videre forstyrrer DNA-fargestoffer, inkludert Hoechst, vanligvis den genomiske DNA-analysen og er ikke egnet for denne typen evaluering. Identifisering av membranmarkører som korrelerer med forskjellige cellesyklusfaser, og som kan farges på levende celler, kan overvinne denne begrensningen. Avslutningsvis har metoden et stort potensial for evaluering av aktiverte/prolifererende T-celler i flere sammenhenger som vaksinasjon, infeksjon, immunmediert sykdom og immunterapi.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naive T-celler gjennomgår klonisk ekspansjon og differensiering ved antigenpriming. Differensierte T-celler viser effektorfunksjoner som er avgjørende for antigenclearance og for vedlikehold av antigenspesifikk minne, som er nøkkelen for langvarig beskyttelse. I løpet av de første trinnene i den primære responsen er naiv T-celleinteraksjon med antigen-presenting celler (APCer) innenfor spesialiserte nisjer i lymfoide organer avgjørende for å indusere den enorme T-celleproliferasjonen som karakteriserer klonet ekspansjonsfase1,2,3. T celle-APC interaksjon er fint regulert av konsentrasjon og utholdenhet av antigen, kostimulatoriske signaler, og løselige faktorer (cytokiner og kjemokiner) som påvirker mengden og kvaliteten på T-celle klonet avkom4,5,6,7.
Til tross for intensive studier av T-celleklonal ekspansjon, er det fortsatt ikke kjent om antigenprimerte T-celler fullfører hele cellesyklusen på stedet for antigengjenkjenning, eller om de migrerer til andre organer under cellesyklusprogresjon. Denne mangelen på kunnskap skyldes egenskapene til tilgjengelige verktøy for cellesyklusanalyse. Disse inkluderer monoklonale antistoffer (mAbs) som er spesifikke for atommarkøren, Ki67 og cellefarger som enten identifiserer celler som har gjennomgått S-fasen av cellesyklusen (f.eks. Bromodeoxyuridine (BrdU)) eller diskriminerer blant datterceller og deres forfedre (f.eks. karboksyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)).
Cellemerkingsfarger, for eksempel CFSE og BrdU, tillater imidlertid ikke fastsettelse av om celler som finnes i et bestemt organ, spredte seg lokalt eller heller migrert til dette nettstedet etter divisjon8,9. Videre er det intranukleære proteinet, Ki67, bare i stand til å skille celler i G0 (Ki67-negative celler) fra de i en hvilken som helst annen cellesyklusfase (Ki67-positive celler). Dermed skiller Ki67-analysen ikke celler i aktiv spredning (dvs. i S, G2eller M) fra de i G1, som enten raskt kan gå videre til divisjon eller bli i lange perioder i G1 eller gå tilbake til passivence10,11.
Her beskriver vi en ny strømningscytometrisk metode for cellesyklusanalyse av antigenspesifikke CD8 T-celler12 fra milten og lymfeknuter (LNer) av vaksinerte mus (figur 1). Metoden utnytter en kombinasjon av Ki67 og DNA-farging som tidligere ble brukt til å analysere cellesyklusen til musebenmarg (BM) hematopoietiske celler13,14. Her brukte vi vellykket Ki67 pluss DNA-farging, sammen med den nylig publiserte innovative gatingstrategien12, til analysen av CD8 T celleklonal ekspansjon. Vi var i stand til å klart diskriminere mellom antigenspesifikke CD8 T-celler i G0, i G1, og i S-G2/ M-faser i milten og drenering av LNer av vaksinerte mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

Cellesyklusen til antigenspesifikke T-celler in vivo har blitt undersøkt ved hjelp av noen få metoder, som alle har noen begrensninger. Bromodeoxyuridine (BrdU) markerer celler som er i eller nylig fullført S-fase, og karboksyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) oppdager datterceller etter divisjon. Disse fargestoffene tillater imidlertid ikke identifisering av cellesyklusfasen på analysetidspunktet. En alternativ tilnærming er å utnytte Ki67, en markør som er sterkt uttrykt av celler i alle faser av cellesyklusen bortsett fra passiv fase G0. Dessverre tillater Ki67 ikke ytterligere differensiering, da det ikke skiller celler i S-fase som er forpliktet til mitose fra de i G1 som kan forbli i denne fasen, fortsett å sykle eller flytte inn i G0.
Her beskriver vi en strømningscytometrisk metode for å fange et "øyeblikksbilde" av T-celler i forskjellige cellesyklusfaser i musens sekundære lymfoidorganer. Metoden kombinerer Ki67 og DNA-farging med store histokompatibilitetskompleks (MHC)-peptid-multimer farging og en innovativ gating strategi, slik at vi kan skille mellom antigenspesifikke CD8 T-celler i G0, i G1 og i S-G2/ M-faser av cellesyklusen i milten og drenering av lymfeknuter av mus etter vaksinasjon med virale vektorer som bærer modellen antigen gag av humant immunsviktvirus (HIV)-1.
Kritiske trinn i metoden var valget av DNA-fargestoffet og gatingstrategien for å øke analysefølsomheten og inkludere svært aktiverte / proliferaterende antigenspesifikke T-celler som ville ha blitt savnet av dagens analysekriterier. DNA-fargestoffet, Hoechst 33342, gjorde det mulig for oss å få en diskriminering av G0/ G1 og G2/ M DNA-toppene, samtidig som vi bevarte membran- og intracellulær farging. Metoden har et stort potensial for å øke kunnskapen om T-cellerespons in vivo og forbedre immunovervåkingsanalysen.

Cellesyklusfasene til celler fra milt,LNer og BM av Balb/c-mus ble analysert ved hjelp av fluorescerende DNA-fargestoff, Hoechst og en anti-Ki67 mAb, i henhold til protokollen oppsummert i figur 1. Denne fargingen tillot differensiering av celler i følgende faser av cellesyklusen: G0 (Ki67neg, med 2N DNA definert som DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) og S-G2/M (Ki67pos, med et DNA-innhold som består av mellom 2N og 4N, eller lik 4N DNA definert som DNAintermediate/high).
Vi utførte først cellesyklusanalyse av BM-celler for å reprodusere tidligere publiserte resultater13,14 og deretter analyserte cellene av interesse, det vil si CD8 T-celler. Figur 2 viser et typisk eksempel på cellesyklusanalyse av BM-celler (Figur 2A). Protokollen ga en lav variasjonskoeffisient (CV) av G0/G1 og G2/M DNA-topper, noe som indikerer den utmerkede kvaliteten på DNA-fargingen (Figur 2B, som viser et eksempel med CV < 2,5; CV var alltid < 5 i alle forsøkene).
Deretter brukte vi den samme protokollen på antigenspesifikke CD8 T-celler fra vaksinerte mus. BALB/c mus ble vaksinert mot antigen gag av HIV-1 ved å bruke Chad3-gag for grunning og MVA-gag for boosting, begge konstruert for å bære HIV-1 gag. På dag (d) 3 etter boost analyserte vi frekvensen av gag-spesifikke CD8 T-celler fra milten og drenering av LNer. Vi benyttet oss av den nylig definerte gatingstrategien for T-celler i den tidlige fasen av immunresponsen, som i motsetning til den konvensjonelle strategien er egnet for å oppdage høyt aktiverte antigenresponserende CD8 T-celler12. Vi utførte den nye strategien i fem påfølgende trinn. I trinn 1 ekskluderte vi dobler eller aggregater ved DNA-A / -W gate, og i trinn 2 identifiserte vi levende celler ved utelukkelse av dødcellemarkør. I trinn 3 identifiserte vi interessepopulasjonen ved hjelp av en ikke-konvensjonell "avslappet" FSC-A / SSC-A-port (figur 3A) i stedet for den kanoniske smale lymfocyttporten12. Etter å ha kneblet på CD3+CD8+ celler (trinn 4 i figur 3A), identifiserte vi gag-spesifikke CD8 T-celler ved hjelp av to forskjellige MHC-multimere, det vil si Pent-gag og Tetr-gag (trinn 5 i figur 3A). Vi brukte to multimere i stedet for en for å forbedre følsomheten til gag-spesifikk CD8 T celledeteksjon hos vaksinerte mus, uten å øke fargingsbakgrunnen hos ubehandlede mus (Figur 3B og C, trinn 5). Dermed utmerket vi ubehandlede mus (henholdsvis 0,00% og 0,00% antigenspesifikke CD8 T-celler i LNer og milt) fra vaksinerte mus (henholdsvis 0,46% og 0,29% antigenspesifikke CD8 T-celler i LNer og milt, henholdsvis figur 3B og C).
Spesielt tillot protokollen oss å ha en ekstremt lav bakgrunn i den antigenspesifikke CD8 T-celleporten til LNer og milt av ubehandlede mus (vanligvis 0,00% og maksimalt 0,02%). Sammenligningen av gag-spesifikke og ikke gag-spesifikke FSC-A / SSC-A-tomter viste at de gag-spesifikke cellene hadde høy SSC-A og FSC-A (Figur 3D), som bekrefter behovet for å bruke en "avslappet" FSC-A / SSC-A-port for å fange disse cellene. Deretter evaluerte vi prosentandelene av gag-spesifikke CD8 T-celler i ulike cellesyklusfaser (figur 4A). Vi fant at gag-spesifikke CD8 T-celler i milten og enda mer i drenerings-LN-ene inneholdt en høy andel celler i S-G2/ M-faser på dag 3 etter boost (henholdsvis 18,60% og 33,52%).
Videre fant vi ut at gag-spesifikke CD8 T-celler i S-G2/ M-faser hadde høye FSC-A og SSC-A, når de ble lagt over på de totale CD8 T-cellene fra samme organ (Figur 4B). CD62L-uttrykk ved gag-spesifikke CD8 T-celler var lavt, som forventet for aktiverte T-celler, bortsett fra noen få celler i G0 i LN-ene (figur 4C). Til sammen bekreftet disse resultatene at den "avslappede" porten (trinn 3 i figur 3A, B og C) var nødvendig for å inkludere alle de proliferaterende antigenspesifikke CD8 T-cellene12. Protokollen var ekstremt verdifull for en "snapshot" evaluering av cellesyklusfaser av antigenspesifikke CD8 T-celler på analysetidspunktet og av CD62L-uttrykk av celler i forskjellige cellesyklusfaser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Figur 1: Skjema for protokollen for cellesyklusanalyse av antigenspesifikke CD8 T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Figur 2: Cellesyklusanalyse av BM-celler. BM-celler fra ubehandlede Balb/c-mus ble farget og analysert ved strømningscytometri. (A) Eksempel på gating strategi. Vi gated på enkeltceller i DNA-A / W plottet (venstre) og deretter på levende celler ved død celle fargestoff ekskludering (midten). Deretter ble en "avslappet" FSC-A / SSC-A-port brukt til alle BM-celler (høyre). (B) Eksempel på cellesyklusanalyse av BM-celler (venstre). Vi brukte en kombinasjon av Ki67 og DNA-farging for å identifisere celler i følgende faser av cellesyklusen: G0 (nederst til venstre kvadrant, Ki67neg-DNAlow-celler), G1 (øverst til venstre kvadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (øverste høyre kvadrant, Ki67pos-DNAintermediate/high). Fluorescens Minus En (FMO) kontroll av Ki67 mAb (midten) og DNA histogram (høyre) vises. I DNA-histogramplottet tilsvarer venstre og høyre porter henholdsvis G0/G1 og G2/M DNA-toppen, og tallene representerer variasjonskoeffisientene (CV) for hver topp. I alle de andre plottene representerer tallene celleprosenter i de angitte portene. Figuren viser 1 representativt eksperiment av 5. I hvert eksperiment analyserte vi samlede BM-celler fra 3 mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Figur 3: Analyse av antigenspesifikke CD8 T-celler fra LNer og milt. Balb/c mus ble primet intramuskulært (i.m.) med Chad3-gag og forsterket i.m. med MVA-gag. På dag 3 etter boost ble drenering av LN- og miltceller fra vaksinerte og ubehandlede kontrollmus farget og analysert av strømningscytometri. (A) Ordningen med gating strategien i fem trinn for å identifisere enkeltceller (Trinn 1); levende celler (trinn 2); lymfocytter (trinn 3); CD8 T-celler (trinn 4); og gag-spesifikke celler (trinn 5). (B-C) Eksempel på plott: analyse av celler fra (B) LNer og (C) milt av ubehandlede (topp) og vaksinerte (nederste) mus. Vi identifiserte enkeltceller på DNA-A/ -W-plottet i trinn 1. Så, i trinn 2, valgte vi levende celler etter utelukkelse av død cellefarge. I trinn 3 brukte vi en ikke-kanonisk "avslappet" port for lymfocytter. I trinn 4 identifiserte vi CD8 T-celler ved deres doble uttrykk for CD3 og CD8. Vi identifiserte deretter gag-spesifikke celler og ikke gag-spesifikke i trinn 5, basert på deres evne til å binde fluorokrom-merket H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) og H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), eller ikke, henholdsvis. (D) FSC-A/SSC-A-profiler av gag-spesifikke (blå) og ikke gag-spesifikke (grå) celler etter gating som beskrevet ovenfor. Tall representerer celleprosenter i de angitte portene. Figuren viser 1 representativt eksperiment av 5. I hvert eksperiment analyserte vi samlet milt og samlet LN-celler fra 3 vaksinerte mus og 3 ubehandlede mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Figur 4: Cellesyklusanalyse av antigenspesifikke CD8 T-celler. Mus ble vaksinert som i figur 3 og cellesyklusanalyse av gag-spesifikke celler ble utført på dag 3 etter boost, etter gating i 5 trinn som i figur 3. (A) Eksempel på cellesyklusanalyse av gag-spesifikke CD8 T-celler fra LNer (øverst) og milt (bunn) av vaksinerte mus. Cellesyklusfaser ble identifisert som i figur 2B. Panelene representerer celler i G0, i G1og i S-G2/M (venstre) og Fluorescence Minus One (FMO) kontroll av Ki67 mAb (høyre). Tall representerer celleprosenter i de angitte portene. (B) FSC-A/SSC-A-punktplott som viser gag-spesifikke CD8 T-celler i S-G2/M-faser (i rødt) lagt over på total CD3+CD8+ T-celler (i grått) fra LNer (øverst) og milt (nederst) av vaksinerte mus. (C) Forskjøvet histogrammer som viser CD62L-uttrykk ved gag-spesifikke CD8 T-celler i G0 (grønn), i G1 (blå) og i S-G2/M (rød) fra LNer (øverst) og milt (nederst) av vaksinerte mus. Y-aksene angir normalisert antall hendelser. Figuren viser 1 representativt eksempel av 5 uavhengige eksperimenter med totalt 15 mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsmateriale: Innstillinger for flytcytometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Clonal ekspansjon er et sentralt trekk ved antigenspesifikk T-cellerespons. Cellesyklusen til antigenresponserende T-celler har imidlertid blitt dårlig undersøkt, blant annet på grunn av tekniske begrensninger. Vi beskriver en strømningscytometrisk metode for å analysere clonally ekspanderende antigenspesifikke CD8 T-celler i milt og lymfeknuter av vaksinerte mus.

En DNA/Ki67-basert flowcytometrianalyse for cellesyklusanalyse av antigenspesifikke CD8 T-celler hos vaksinerte mus

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Vår protokoll gir en praktisk tilnærming der mus milt og lymfeknuter kan brukes til å gjenspeile dynamikken i T cellerespons større enn å gi en steady-state fenotypisk øyeblikksbilde. Vår teknikk oppdager sensitivt antigenspesifikke CD8 T-celler som er engasjert i en pågående respons. Proliferating CD8 T celler måles uten de muligens forvirrende effektene av in vivo narkotika behandling eller celleoverføring.Vår teknikk kan gi et vindu i immundynamikk i flere innstillinger. For eksempel, i forhold til respons på vaksinasjon og infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreftimmunoterapi. Forbered fersk 1x permeabiliseringsvaskbuffer ved å fortynne 10x permeabiliseringsbuffer med destillert vann og filtrer den gjennom et 0,45 mikrometer filter for å eliminere aggregater.Fortynn monoklonalt antistoff Ki67 FITC i 1x permeabiliseringsvaskbuffer som bestemt med et titreringsforsøk for et sluttvolum på 100 mikroliter per prøve. Tilsett 3 milliliter av 1x permeabiliseringsvaskbufferen til hvert rør med celler og sentrifuger ved 400 G i fem minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.Igjen, tilsett 1x permeabilisering vaskebuffer og sentrifuge til pellet cellene. Kast deretter supernatanten. Tilsett 100 mikroliter fortynnet monoklonalt antistoff Ki67 FITC til pelletsen, deretter virvel og inkuber i 30 minutter i mørket.Etter inkubasjonen, vask cellene to ganger med 4 milliliter 1x permeabiliseringsbuffer, sentrifuger etter hver vask, og kast supernatanten. Tilsett 350 mikroliter PBS i cellepelleten for prøver som skal anskaffes direkte ved strømningscytometeret og 250 mikroliter PBS til cellepelleten for prøver som skal inkuberes med Hoechst for DNA-farging. Forbered Hoechst og PBS-løsning og legg den til hver prøve slik at den endelige konsentrasjonen er to mikrogram per milliliter.Virvel og inkuber prøvene i 15 minutter i mørket. Sentrifuger deretter prøvene i fem minutter og tilsett 350 mikroliter PBS til cellepelleten. Åpne programvaren og opprett forskjellige grupper som tilsvarer de forskjellige organene som skal analyseres ved å klikke Opprett gruppe i arbeidsområdebånddelen.Åpne det endrede gruppevinduet ved å dobbeltklikke gruppenavnet og synkronisere de nyopprettede gruppene ved å sette en hake i funksjonen som synkroniseres. Dra hver FCS-fil til den tilsvarende gruppen, og opprett deretter en gating-strategi som starter med en LN-gruppe. Åpne diagramvinduet ved å dobbeltklikke på den fullstendig fargede prøven for å vise de utakknemlige hendelsene som er anskaffet for prøven i en prikkplott.Legg merke til at x- og y-aksen er merket som i FCS-filene, som angitt i tabell to av flow cytometer innstillingsfilen for dette manuskriptet. Kontroller at et tilstrekkelig antall hendelser vises for riktig visualisering. Om nødvendig åpner du preferanser ved å klikke på hjerteikonet på arbeidsområdebåndet, velger Grafer, deretter Dot Plot"som graftype, og kontroller at antall prikker som er tegnet i den tilsvarende boksen, er riktig eller endre det.Vis de utakknemlige hendelsene i grafvinduet i et punktplott med DNA-A på x-aksen og DNA-W på y-aksen. Bruk lineær skala for begge aksene. Endre om nødvendig skala fra logaritmisk til lineær ved å klikke på boksen som er angitt med en T nær hver akse i grafvinduet.Velg en enkelt cellepopulasjon ved å klikke på rektangel i delen for trykkingsverktøyet, og dobbeltklikk deretter midt i den rektangulære porten for å vise enkeltceller i en prikkplott med FSC-A-parameter på x-aksen og død celle dø på y-aksen. Klikk på polygonen for å velge levende cellepopulasjon, som er negative for død celledød. Dobbeltklikk midt i polygonporten for å vise cellene i en prikktegning med FSC-A-parameteren på x-aksen og SSC-A-parameteren på y-aksen.Klikk på rektangel og lag en avslappet port for å inkludere alle enkelt levende celler i den grafen. Dobbeltklikk midt i den avslappede porten for å vise cellene i en prikkplott med CD3 på x-aksen og CD8 på y-aksen. Bruk riktig tilgangsskala for visualisering i diagramvinduet.Hvis det er nødvendig, endrer du x- og y-skalaen ved å klikke på boksen, angitt med en T nær hver akse, velge Tilpass tilgangsfunksjon og endre ekstra neg tiår med baser og positive tiår etter behov. Velg CD3+CD8+-cellene ved å klikke på polygon. Dobbeltklikk midt på CD3+CD8+-porten for å vise cellene i en prikktegning med Tetr-gag på x-aksen og Pent-gag på y-aksen.Velg de antigenspesifikke CD8 T-cellene ved å klikke på polygon. Dobbeltklikk midt i den gag-spesifikke porten for å vise cellene i et punktplott med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Velg cellene i de forskjellige cellesyklusfasene ved å klikke på Quad"i gatingverktøydelen av grafvinduet.Kopier gatingstrategien som er opprettet i ett utvalg, til den tilsvarende gruppen for å bruke portene på alle eksemplene i gruppen. Kopier deretter gatingstrategier for b-milten og CBM-gruppene, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Kontroller at alle portene passer for hvert utvalg av de tre gruppene.Desynkroniser om nødvendig gruppen og endre portene som beskrevet i manuskriptet. Vis BM-cellene i den avslappede porten i en prikkplott med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Visualiser resultatene ved å klikke Oppsettredigering i delen på båndet i arbeidsområdet.Dra hver port i gating-strategien i eksempelruten til oppsettredigeringsprogrammet, og plasser plottene i henhold til sekvensen av gangen. Endre om nødvendig graftypen ved å dobbeltklikke på den tilsvarende tomten i oppsettet og velge riktig type i grafdefinisjonsvinduet. Klikk på gruppen og gjenta etter funksjoner på layoutbåndet for å visualisere resultatene oppnådd i antigenspesifikke CD8 T-celler fra hvert organ og sammenligne forskjellige prøver.Visualiser resultatene av benmargsceller som representerer en positiv kontroll. Et typisk eksempel på cellesyklusanalyse av benmargsceller vises her. Protokollen ga en lav koeffisient av variasjon av G0 til G1 og G2 til M DNA-topper, noe som indikerer utmerket kvalitet på DNA-fargingen.En femtrinns gating strategi ble brukt til å identifisere antigen spesifikke CD8 celler. To multimere ble brukt til å forbedre følsomheten til gag-spesifikk CD8 T celledeteksjon hos vaksinerte mus uten å øke fargingsbakgrunnen hos ubehandlede mus. Gag-spesifikke CD8 T-celler i drenerende lymfeknuter og i milten inneholder en høy andel celler i S-G2 / M-fasene på dag tre innleggsøkning.Videre hadde gag-spesifikke CD8 T-celler i S-G2/ M-fasene høy FSC-A og SSC-A når de ble lagt over på de totale CD8 T-cellene fra samme organ. Offset histogrammer viste at CD62L-uttrykket ved gag-spesifikke CD8 T-celler var lavt, som forventet for aktiverte T-celler, bortsett fra noen få celler i G0 i lymfeknuter. Denne metoden er designet for T-celler for å oppnå en utmerket kvalitet på DNA-farging sammen med membranen og Ki67-fargingen.Flow cytometridataanalyse er et nøkkelpunkt. Pass på at du bruker riktig kontroll for portposisjonering. Ved hjelp av denne metoden oppdaget vi T-celler i S-G2 / M faser av cellesyklus i mus og menneskelig perifert blod.Denne teknikken var nyttig i immunovervåkingsstudier i type 1 diabetes, smittsom mononukleose og COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Hel-dyr Imaging og strømningscytometriske Teknikker for analyse av Antigen-spesifikke CD8 + T celle responser etter Nanopartikkel Vaksinasjon

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Oppdagelse og berikelse av Rare antigen-spesifikke B-celler for analyse av fenotype og funksjon

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer flekker og kvantitativ analyse for å fastslå plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler i vev

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering av mus nyre-resident CD8+ T celler for Flow Cytometry Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...