Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Reithera, pelo projeto MIUR 2017K55HLC_006, e por 5 × 1000 do Bolsa Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). O seguinte tetramer foi obtido através da Instalação NIH Tetramer: H-2K (d) HIV conjugado a APC (d) hiv gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. 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Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

A. Folgori e S. Capone são funcionários da Reithera Srl. A. Nicosia é nomeada inventora no pedido de patente WO 2005071093 (A3) "Portadores de vacina contra o adenovírus chimpanzé". Os outros autores não têm nada a revelar.

Embora a expansão clonal de células T tenha sido intensamente estudada, alguns aspectos permanecem desconhecidos, principalmente porque as ferramentas disponíveis para investigá-la são poucas e têm suas próprias desvantagens. Nessa perspectiva, criamos um método citométrico de fluxo altamente sensível para analisar o ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno em momentos iniciais após a vacinação em um modelo de camundongo. O protocolo é baseado em uma combinação de Ki67 e coloração de DNA, que foi anteriormente usada para analisar o ciclo celular de células hematopoiéticas BM em camundongos13,14. Para adaptar o protocolo às células CD8 T específicas do antígeno, tivemos que considerar algumas questões críticas, incluindo a escolha do corante de DNA, as condições apropriadas para obter coloração de DNA comparável em diferentes amostras e a estratégia de gating para análise de dados.
Muitos corantes estão disponíveis para coloração de DNA, incluindo iodeto de propidium e 7-aminoactinomicina D; escolhemos Hoechst porque era compatível com a coloração da membrana e o protocolo de fixação/permeabilização leve necessário para a coloração de Ki67. Ao mesmo tempo, a coloração com Hoechst nos permitiu obter um histograma de DNA de excelente qualidade, ou seja, os picos de DNA G0/G1 e G2/M tinham um coeficiente de variação muito menor (CV) do que os picos de DNA normalmente obtidos com outros corantes de DNA, por exemplo, DRAQ519. De fato, Hoechst pode manchar DNA mesmo em células vivas20.
Algumas estratégias foram utilizadas para evitar a flutuação da intensidade hoechst em diferentes amostras do mesmo experimento. A coloração de hoechst foi realizada pouco antes da aquisição da amostra no citômetro de fluxo para minimizar o declínio da intensidade do corante durante o tempo. Para os interessados em reproduzir o protocolo em grandes experimentos com inúmeras amostras, recomendamos realizar a coloração de Hoechst em algumas amostras de cada vez. Outra desvantagem é que a intensidade de Hoechst pode ser fortemente influenciada pelo número de célula durante a incubação com o corante. Por essa razão, recomendamos sempre o uso do mesmo número de células e o mesmo volume por amostra para coloração de DNA. Se um alto número de células for necessário para aquisição no citômetro de fluxo, recomendamos preparar duas ou mais amostras idênticas e, em seguida, fundi-las pouco antes da etapa de coloração hoechst.
Um ponto-chave do protocolo é a estratégia de gating para análise de dados. Recentemente publicamos uma nova estratégia para análise de células T nos primeiros momentos da resposta imune, o que nos permitiu aumentar a sensibilidade da detecção de células T específicas de antígeno12. Aplicamos essa estratégia aos dados aqui apresentados. Primeiro, excluímos agregados celulares na trama de DNA-A/W. Em segundo lugar, depois de gating fora células mortas, usamos um portão de linfócito bastante grande no lote FSC/SSC ("portão relaxado"). Por essa estratégia, conseguimos incluir células CD8 T altamente ativadas específicas de antígeno em S-G2/M que geralmente são perdidas pelas estratégias atuais de gating, já que essas células têm FSC-A e SSC-A elevados. Em resumo, a análise dos dados representa uma parte crítica do método, essencial para obter uma detecção sensível de células T ativadas/proliferadoras específicas de antígenos.
O método previne a possibilidade de faltar dados críticos de células T em fases iniciais da resposta imune e abre novas perspectivas para o imunomonitoramento de células T. Uma melhoria futura pode incluir a coloração para fosfo-histona 3 que permitiria diferenciação entre G2 e M21. Uma limitação atual é que as células devem ser fixadas e permeabilizadas para manchar para o marcador nuclear, Ki67. Assim, as células não podem ser utilizadas para outros tipos de análise, como classificação e análise funcional subsequente. Além disso, corantes de DNA, incluindo Hoechst, geralmente interferem na análise genômica do DNA e não são adequados para este tipo de avaliação. A identificação de marcadores de membrana que se correlacionam com diferentes fases do ciclo celular e que podem ser manchadas em células vivas poderia superar essa limitação. Em conclusão, o método tem grande potencial para a avaliação de células T ativadas/proliferantes em diversos contextos como vacinação, infecção, doenças imuno medianas e imunoterapia.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

As células T ingênuas sofrem expansão clonal e diferenciação em relação à preparação de antígenos. Células T diferenciadas exibem funções de efeitos que são essenciais para o desembaraço do antígeno e para a manutenção da memória específica de antígeno, que é fundamental para uma proteção de longa duração. Durante os primeiros passos da resposta primária, a interação ingênua das células T com células que apresentam antígenos (APCs) dentro de nichos especializados em órgãos linfoides é fundamental para induzir a enorme proliferação de células T que caracteriza a fase de expansão clonal1,2,3. A interação célula T-APC é finamente regulada pela concentração e persistência de antígeno, sinais co-estimulantes e fatores solúveis (citocinas e quimiocinas) que influenciam a quantidade e a qualidade da prole clonal da célula T4,5,6,7.
Apesar dos estudos intensivos de expansão clonal de células T, ainda não se sabe se as células T preparadas por antígeno completam todo o seu ciclo celular no local do reconhecimento de antígenos, ou se migram para outros órgãos durante a progressão do ciclo celular. Essa falta de conhecimento se deve às propriedades das ferramentas disponíveis para análise do ciclo celular. Estes incluem anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para o marcador nuclear, Ki67, e corantes celulares que identificam células que foram submetidas à fase S do ciclo celular (por exemplo, Bromodeoxyuridina (BrdU)) ou discriminam entre células filhas e seus ancestrais (por exemplo, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)).
No entanto, os corantes de rotulagem celular, como CFSE e BrdU, não permitem a determinação se as células encontradas em um determinado órgão proliferaram localmente ou melhor migraram para este local após a divisão8,9. Além disso, a proteína intranuclear, Ki67, só é capaz de distinguir células em G0 (células Ki67-negativas) daquelas em qualquer outra fase de ciclo celular (células Ki67 positivas). Assim, a análise de Ki67 não distingue células em proliferação ativa (ou seja, em S, G2ou M) daquelas no G1, que podem progredir rapidamente para a divisão ou permanecer por longos períodos no G1 ou reverter para quiescência10,11.
Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para análise do ciclo celular das células CD8 T específicas de antígeno12 do baço e linfonodos (LNs) de camundongos vacinados(Figura 1). O método explora uma combinação de Ki67 e coloração de DNA que foi usada anteriormente para analisar o ciclo celular das células hematopoiéticas da medula óssea do camundongo (MM)13,14. Aqui, aplicamos com sucesso o Ki67 mais a coloração de DNA, juntamente com a recém-publicada estratégia inovadora de gating12,à análise da expansão clonal de células CD8 T. Pudemos discriminar claramente entre células CD8 T específicas de antígeno em G0, no G1, e nas fases S-G2/Mno baço e drenagem de LNs de camundongos vacinados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

O ciclo celular de células T específicas de antígeno in vivo foi examinado usando alguns métodos, todos os quais possuem algumas limitações. Bromodeoxyuridina (BrdU) marca células que estão na fase S ou recentemente concluída, e carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE) detecta células filhas após a divisão. No entanto, esses corantes não permitem a identificação da fase do ciclo celular no momento da análise. Uma abordagem alternativa é explorar o Ki67, um marcador que é altamente expresso pelas células em todas as fases do ciclo celular, exceto na fase quiescente G0. Infelizmente, o Ki67 não permite maior diferenciação, pois não separa células em fase S que estão comprometidas com mitose daquelas do G1 que podem permanecer nestafase, proceder ao ciclismo ou passar para OG 0.
Aqui, descrevemos um método citométrico de fluxo para capturar um "instantâneo" de células T em diferentes fases de ciclo celular em órgãos linfoides secundários do camundongo. O método combina a coloração de Ki67 e DNA com a coloração do complexo histocompatibilidade (MHC)-peptídeo-multimer e uma estratégia inovadora de gating, permitindo-nos diferenciar com sucesso entre células CD8 T específicas de antígeno em G0, em G1 e nas fases S-G2/M do ciclo celular no baço e drenagem de linfonodos de camundongos após a vacinação com vetores virais carregando a mordaça de antígeno modelo do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1.
As etapas críticas do método foram a escolha do corante de DNA e a estratégia de gating para aumentar a sensibilidade ao ensaio e incluir células T altamente ativadas/proliferantes específicas de antígeno que teriam sido perdidas pelos critérios atuais de análise. O corante de DNA, Hoechst 33342, nos permitiu obter uma discriminação de alta qualidade dos picos de DNA G0/G1 e G2/M, preservando a membrana e a coloração intracelular. O método tem grande potencial para aumentar o conhecimento sobre a resposta de células T in vivo e melhorar a análise de imunomonitoramento.

As fases do ciclo celular das células do baço, LNs e BM de camundongos Balb/c foram analisadas utilizando o corante de DNA fluorescente, Hoechst, e um anti-Ki67 mAb, de acordo com o protocolo resumido na Figura 1. Essa coloração permitiu a diferenciação de células nas seguintes fases do ciclo celular: G0 (Ki67neg, com 2N de DNA definido como DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) e S-G2/M (Ki67pos, com conteúdo de DNA composto entre 2N e 4N, ou igual a 4N de DNA definido como DNAmediainterte/alto).
Primeiro realizamos a análise do ciclo celular das células BM para reproduzir resultados publicados anteriormente13,14 e depois analisamos as células de interesse, ou seja, células CD8 T. A Figura 2 mostra um exemplo típico de análise do ciclo celular das células BM(Figura 2A). O protocolo rendeu um baixo coeficiente de variação (CV) dos picos de DNA G0/G1 e G2/M,indicando a excelente qualidade da coloração de DNA (Figura 2B,mostrando um exemplo com CV < 2,5; CV sempre foi < 5 em todos os experimentos).
Aplicamos então o mesmo protocolo às células CD8 T específicas de antígenos de camundongos vacinados. Os camundongos BALB/c foram vacinados contra a mordaça de antígeno do HIV-1 usando mordaça chad3 para priming e mva-gag para impulsionar, ambos projetados para transportar mordaça HIV-1. No dia (d) 3 pós-boost, analisamos a frequência de células CD8 T específicas da mordaça do baço e drenando LNs. Aproveitamos a estratégia de gating recém-definida para células T na fase inicial da resposta imune, que em contraste com a estratégia convencional, é apropriada para detectar células CD8 T altamente ativadas que respondem antígeno12. Executamos a nova estratégia em cinco etapas subsequentes. Na etapa 1, excluímos doublets ou agregados pelo portão DNA-A/ -W, e na etapa 2, identificamos células vivas por exclusão de marcadores de células mortas. Na etapa 3, identificamos a população de interesse usando um portão FSC-A/ SSC-A não convencional(Figura 3A)em vez do portão de linfócitos estreitos canônicos12. Após a gating em células CD3+CD8+ (etapa 4 da Figura 3A), identificamos células CD8 T específicas da mordaça usando dois multimers MHC diferentes, ou seja, pent-gag e Tetr-gag (passo 5 da Figura 3A). Utilizamos dois multimers em vez de um para melhorar a sensibilidade da detecção de células CD8 T específicas da mordaça em camundongos vacinados, sem aumentar o fundo de coloração em camundongos não tratados(Figura 3B e C, passo 5). Assim, distinguimos com sucesso camundongos não tratados (células CD8 T específicas de antígeno de 0,00% e 0,00% em LNs e baço, respectivamente) de camundongos vacinados (0,46% e 0,29% células CD8 T específicas de antígeno em LNs e baço, respectivamente, Figura 3B e C).
Notavelmente, o protocolo nos permitiu ter um fundo extremamente baixo no portão celular CD8 T específico de antígeno de LNs e baço de camundongos não tratados (geralmente 0,00% e no máximo 0,02%). A comparação de gráficos FSC-A/ SSC-A específicos da mordaça mostrou que as células específicas da mordaça tinham SSC-A e FSC-A elevados (Figura 3D),confirmando a necessidade de usar um portão FSC-A/ SSC-A "relaxado" para capturar essas células. Em seguida, avaliamos os percentuais de células CD8 T específicas da mordaça em diferentes fases do ciclo celular(Figura 4A). Descobrimos que as células CD8 T específicas da mordaça no baço e ainda mais nas LNs drenantes continham uma alta proporção de células nas fases S-G2/Mno dia 3 pós-boost (18,60% e 33,52%, respectivamente).
Além disso, descobrimos que as células CD8 T específicas da mordaça nas fases S-G2/M tinham FSC-A e SSC-A elevados, quando sobrepostas ao total de células CD8 T do mesmo órgão(Figura 4B). A expressão CD62L por células CD8 T específicas da mordaça foi baixa, como esperado para células T ativadas, com exceção de algumas células em G0 nas LNs(Figura 4C). Ao todo, esses resultados confirmaram que o portão "relaxado" (etapa 3 da Figura 3A, B e C) foi necessário para incluir todas as células CD8 T específicas de antígenosproliferando 12. O protocolo foi extremamente valioso para uma avaliação "instantânea" das fases de ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno no momento da análise e da expressão CD62L por células em diferentes fases do ciclo celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Figura 1: Esquema do protocolo para análise do ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Figura 2: Análise do ciclo celular das células BM. As células BM de camundongos Balb/c não tratados foram manchadas e analisadas por citometria de fluxo. (A) Exemplo de estratégia de gating. Nós emomos em células únicas na trama DNA-A/-W (esquerda) e, posteriormente, em células vivas por exclusão de corante de célula morta (meio). Em seguida, um portão FSC-A/SSC-A "relaxado" foi usado para todas as células BM (à direita). (B) Exemplo de análise do ciclo celular das células BM (esquerda). Utilizamos uma combinação de Ki67 e coloração de DNA para identificar células nas seguintes fases do ciclo celular: G0 (quadrante inferior esquerdo, células Ki67neg-DNAlow), G1 (quadrante superior esquerdo, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (quadrante superior direito, Ki67pos-DNAmediate/high). Fluorescência Menos Um (FMO) controle de Ki67 mAb (médio) e histograma de DNA (direita) são mostrados. Na trama do histograma de DNA, os portões esquerdo e direito correspondem ao G0/G1 e ao pico de DNA G2/M, respectivamente, e os números representam os coeficientes de variação (CV) de cada pico. Em todas as outras parcelas, os números representam porcentagens celulares nos portões indicados. O número mostra 1 experimento representativo de 5. Em cada experimento, analisamos células BM agrupadas de 3 camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Figura 3: Análise de células CD8 T específicas de antígeno de LNs e baço. Os ratos balb/c foram preparados intramuscularmente (i.m.) com chad3-gag e impulsionado i.m. com MVA-gag. No 3º dia, células de LN e baço de camundongos de controle vacinados e não tratados foram manchadas e analisadas por citometria de fluxo. (A) Esquema da estratégia de gating em cinco etapas para identificar células únicas (Passo 1); células vivas (Passo 2); linfócitos (Passo 3); Células CD8 T (Passo 4); e células específicas da mordaça (Passo 5). (B-C) Exemplo de plots: análise de células de (B) LNs e (C) baço de camundongos não tratados (superior) e vacinados (inferior). Identificamos células únicas na trama de DNA-A/ -W no passo 1. Então, no passo 2, selecionamos células vivas por exclusão de corante de célula morta. No passo 3, usamos um portão não canônico "relaxado" para linfócitos. No Passo 4, identificamos células CD8 T por sua dupla expressão de CD3 e CD8. Em seguida, identificamos células específicas da mordaça e não específicas da mordaça no Passo 5, com base em sua capacidade de vincular h-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) e H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), ou não, respectivamente. (D) Perfis FSC-A/SSC-A de células específicas de mordaça (azul) e não específicas de mordaça (cinza) após gating conforme descrito acima. Os números representam percentagens de células nos portões indicados. O número mostra 1 experimento representativo de 5. Em cada experimento, analisamos o baço agrupado e as células LN agrupadas de 3 camundongos vacinados e 3 camundongos não tratados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Figura 4: Análise do ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno. Os camundongos foram vacinados como na Figura 3 e a análise do ciclo celular de células específicas da mordaça foi realizada no 3º dia pós-impulso, após o gating em 5 passos como na Figura 3. (A) Exemplo de análise do ciclo celular de células CD8 T específicas da mordaça de LNs (topo) e baço (inferior) de camundongos vacinados. As fases do ciclo celular foram identificadas como na Figura 2B. Os painéis representam células em G0, em G1, e no controle S-G2/M (esquerda) e Fluorescência Minus One (FMO) de Ki67 mAb (direita). Os números representam percentagens de células nos portões indicados. (B) Gráficos de pontos FSC-A/SSC-A que mostram células CD8 T específicas da mordaça nas fases S-G2/M (em vermelho) sobrepostas em células CD3+CD8+ T totais (em cinza) de LNs (topo) e baço (inferior) de camundongos vacinados. (C) Compense os histogramas mostrando a expressão CD62L por células CD8 T específicas da mordaça em G0 (verde), em G1 (azul) e em S-G2/M (vermelho) de LNs (topo) e baço (fundo) de camundongos vacinados. Os y-axes indicam um número normalizado de eventos. O número mostra 1 exemplo representativo de 5 experimentos independentes com um total de 15 camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Material suplementar: Ajustes de citômetro de fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

A expansão clonal é uma característica fundamental da resposta celular T específica do antígeno. No entanto, o ciclo celular das células T que respondem antígeno tem sido pouco investigado, em parte devido a limitações técnicas. Descrevemos um método citométrico de fluxo para analisar células CD8 T específicas de antígeno em baço e linfonodos de camundongos vacinados.

Um ensaio de citometria de fluxo baseado em DNA/Ki67 para análise do ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno em camundongos vacinados

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Nosso protocolo fornece uma abordagem prática pela qual o baço do rato e os linfonodos podem ser usados para refletir a dinâmica da resposta celular T maior do que fornecer um instantâneo fenotípico de estado estável. Nossa técnica detecta sensivelmente células CD8 T específicas de antígeno que estão engajadas em uma resposta contínua. A proliferação de células CD8 T são medidas sem os efeitos possivelmente confusos do tratamento medicamentoso in vivo ou transferência celular.Nossa técnica pode fornecer uma janela na dinâmica imunológica em várias configurações. Por exemplo, em relação à resposta à vacinação e infecções, doenças autoimunes e imunoterapia contra o câncer. Prepare o tampão de lavagem de permeabilização fresco de 1x diluindo 10x tampão de permeabilização com água destilada e filtre-o através de um filtro de 0,45 micrômetros para eliminar agregados.Anticorpo monoclonal diluído Ki67 FITC em 1x tampão de lavagem de permeabilização como determinado com um experimento de titulação para um volume final de 100 microliters por amostra. Adicione 3 mililitros do tampão de lavagem de permeabilização de 1x em cada tubo com células e centrífuga a 400 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante.Novamente, adicione o tampão de lavagem de 1x pormeabilização e a centrífuga para pelotar as células. Então, descarte o supernatante. Adicione 100 microliters de anticorpo monoclonal diluído Ki67 FITC à pelota, depois vórtice e incubar por 30 minutos no escuro.Após a incubação, lave as células duas vezes com 4 mililitros de 1x tampão de permeabilização, percrifugando após cada lavagem e descarte o sobrenante. Adicione 350 microliters de PBS à pelota celular para que as amostras sejam adquiridas diretamente no citômetro de fluxo e 250 microliters de PBS à pelota celular para que as amostras sejam incubadas com Hoechst para coloração de DNA. Prepare a solução Hoechst e PBS e adicione-a a cada amostra para que a concentração final seja de dois microgramas por mililitro.Vórtice e incubar as amostras por 15 minutos no escuro. Em seguida, centrifufique as amostras por cinco minutos e adicione 350 microliters de PBS à pelota celular. Abra o software e crie diferentes grupos correspondentes aos diferentes órgãos a serem analisados clicando em Criar Grupo", na seção fita do espaço de trabalho.Abra a janela de grupo modificada clicando duas vezes no nome do grupo e sincronize os grupos recém-criados inserindo uma marca de verificação na função sincronizada. Arraste cada arquivo FCS para seu grupo correspondente e crie uma estratégia de gating começando com o grupo A-LN. Abra a janela de gráfico clicando duas vezes na amostra totalmente manchada para exibir os eventos não datados adquiridos para a amostra em um gráfico de pontos.Observe que o eixo x e y são rotulados como nos arquivos FCS, conforme indicado na tabela dois do arquivo de configurações do citômetro de fluxo deste manuscrito. Verifique se um número suficiente de eventos é exibido para visualização adequada. Se necessário, abra as preferências clicando no ícone do coração na fita do espaço de trabalho, selecione Gráficos e, em seguida, Dot Plot" como tipo de gráfico e verifique se o número de pontos sorteados na caixa correspondente está correto ou altere-o.Exibir os eventos untados na janela de gráfico em uma trama de pontos com DNA-A no eixo x e DNA-W no eixo y. Use escala linear para ambos os eixos. Se necessário, altere a escala de logarítmica para linear clicando na caixa indicada com um T próximo a cada eixo na janela de gráfico.Selecione uma única população celular clicando em retângulo na seção de ferramenta gating e clique duas vezes no centro do portão retangular para exibir células únicas em um gráfico de pontos com parâmetro FSC-A no eixo x e célula morta morrer no eixo y. Clique no polígono para selecionar a população de células vivas, que são negativas para a morte de células mortas. Clique duas vezes no centro do portão do polígono para exibir as células em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e o parâmetro SSC-A no eixo y.Clique em retângulo e crie um portão relaxado para incluir todas as células vivas únicas nesse gráfico. Clique duas vezes no centro do portão relaxado para exibir as células em um gráfico de pontos com CD3 no eixo x e CD8 no eixo y. Use a escala de acesso apropriada para visualização na janela de gráfico.Se necessário, modifique a escala x e y clicando na caixa, indicada com um T próximo a cada eixo, escolha Personalizar a Função de Acesso e modifique décadas extras com bases e décadas positivas conforme necessário. Selecione as células CD3+CD8+clicando no polígono. Clique duas vezes no centro do portão CD3+CD8+para exibir as células em um gráfico de pontos com tetr-gag no eixo x e pent-gag no eixo y.Selecione as células CD8 T específicas do antígeno clicando no polígono. Clique duas vezes no centro do portão específico da mordaça para exibir as células em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Selecione as células nas diferentes fases do ciclo celular clicando em Quad"na seção de ferramenta de gating da janela de gráfico.Copie a estratégia de gating criada em uma amostra para o grupo correspondente para aplicar os portões a todas as amostras do grupo. Em seguida, copie estratégias de gating para os grupos b-baço e CBM, conforme descrito no manuscrito do texto. Verifique se todos os portões são apropriados para cada amostra dos três grupos.Se necessário, dessincronize o grupo e modifique portões conforme descrito no manuscrito. Exibir as células BM do portão relaxado em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Visualize os resultados clicando no Editor de layout"na seção fita do espaço de trabalho.Arraste cada portão da estratégia de gating no painel de amostra para o editor de layout e coloque as parcelas de acordo com a sequência do gating. Se necessário, altere o tipo de gráfico clicando duas vezes no gráfico correspondente no layout e selecionando o tipo apropriado na janela de definição do gráfico. Clique no grupo e iterar por funções na fita de layout para visualizar os resultados obtidos em células CD8 T específicas de antígeno de cada órgão e comparar amostras diferentes.Visualize resultados de células de medula óssea representando um controle positivo. Um exemplo típico de análise do ciclo celular das células da medula óssea é mostrado aqui. O protocolo rendeu um baixo coeficiente de variação de G0 para G1 e G2 para M picos de DNA, indicando excelente qualidade da coloração de DNA.Uma estratégia de cinco passos foi empregada para identificar células CD8 específicas de antígeno. Dois multimers foram usados para melhorar a sensibilidade da detecção de células CD8 T específicas da mordaça em camundongos vacinados sem aumentar o fundo de coloração em camundongos não tratados. As células CD8 T específicas da mordaça nos linfonodos drenantes e no baço contêm uma alta proporção de células nas fases S-G2/M no terceiro dia após o impulso.Além disso, as células CD8 T específicas da mordaça nas fases S-G2/M apresentaram FSC-A e SSC-A elevados quando sobrepostas às células CD8 T totais do mesmo órgão. Os histogramas offset mostraram que a expressão CD62L por células CD8 T específicas da mordaça era baixa, como esperado para células T ativadas, exceto por algumas células em G0 nos linfonodos. Este método foi projetado para células T para obter uma excelente qualidade de coloração de DNA juntamente com a membrana e a coloração ki67.A análise de dados de citometria de fluxo é um ponto-chave. Certifique-se de usar o controle apropriado para posicionamento do portão. Usando este método, descobrimos células T em fases S-G2/M do ciclo celular em camundongos e sangue periférico humano.Esta técnica foi útil em estudos de imunomonitoramento em diabetes tipo 1, mononucleose infecciosa e COVID-19.

Research

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