Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Эта работа была поддержана Reithera, проектом MIUR 2017K55HLC_006 и грантом 5 × 1000 от Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Следующий тетрамер был получен через тетрамерную установку NIH: APC-конъюгированный H-2K (d) ВИЧ-кляп 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

А. Фолгори и С. Капоне являются сотрудниками Reithera Srl. A. Никосия названа изобретателем по патентной заявке WO 2005071093 (A3) «Носители аденовирусной вакцины шимпанзе». Другим авторам нечего раскрывать.

Хотя клональное расширение Т-клеток интенсивно изучается, некоторые аспекты остаются неизвестными, главным образом потому, что инструменты, доступные для его исследования, немногочисленны и имеют свои недостатки. С этой точки зрения мы создали высокочувствительный проточный цитометрический метод для анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток на ранних этапах после вакцинации на мышиной модели. Протокол основан на комбинации Ki67 и окрашивания ДНК, которое ранее использовалось для анализа клеточного цикла кроветворных клеток BM у мышей13,14. Чтобы адаптировать протокол к антиген-специфическим CD8 Т-клеткам, нам пришлось рассмотреть несколько критических вопросов, включая выбор красителя ДНК, соответствующие условия для получения сопоставимого окрашивания ДНК в разных образцах и стратегию анализа данных.
Многие красители доступны для окрашивания ДНК, включая йодид пропидия и 7-аминоактиномицин D; мы выбрали Hoechst, потому что он был совместим с окрашиванием мембраны и протоколом мягкой фиксации / пермеабилизации, необходимым для окрашивания Ki67. В то же время окрашивание Хёхстом позволило получить гистограмму ДНК отличного качества, т.е. пики ДНК G0/G1 иG2/Mимели гораздо более низкий коэффициент вариации (CV), чем пики ДНК, обычно получаемые с помощью других ДНК-красителей, например, DRAQ519. Действительно, Хёхст может окрашивать ДНК даже в живых клетках20.
Некоторые стратегии были использованы, чтобы избежать колебаний интенсивности Хёхста в разных образцах одного и того же эксперимента. Окрашивание Hoechst проводилось непосредственно перед получением образца на проточном цитометре, чтобы свести к минимуму снижение интенсивности красителя с течением времени. Для тех, кто заинтересован в воспроизведении протокола в больших экспериментах с многочисленными образцами, мы рекомендуем выполнять окрашивание Hoechst на нескольких образцах одновременно. Еще одним недостатком является то, что интенсивность Hoechst может сильно зависеть от количества клеток во время инкубации с красителем. По этой причине мы настоятельно рекомендуем всегда использовать одинаковое количество клеток и одинаковый объем на образец для окрашивания ДНК. Если для сбора на проточном цитометре требуется большое количество клеток, мы рекомендуем подготовить два или более одинаковых образца, а затем объединить их непосредственно перед этапом окрашивания Hoechst.
Ключевым моментом протокола является стратегия анализа данных. Недавно мы опубликовали новую стратегию анализа Т-клеток на ранних стадиях иммунного ответа, которая позволила нам повысить чувствительность обнаружения антиген-специфических Т-клеток12. Мы применили эту стратегию к данным, показанным здесь следующим образом. Во-первых, мы исключили клеточные агрегаты на графике ДНК-A/W. Во-вторых, после уничтожения мертвых клеток мы использовали довольно большие лимфоцитарные ворота на участке FSC / SSC («расслабленные ворота»). С помощью этой стратегии мы смогли включить высокоактивированные антиген-специфические CD8 Т-клетки в S-G2/ M, которые обычно пропускаются текущими стратегиями гатинга, поскольку эти клетки имеют высокий FSC-A и SSC-A. Таким образом, анализ данных представляет собой критическую часть метода, которая необходима для получения чувствительного обнаружения активированных /пролиферирующих антиген-специфических Т-клеток.
Метод предотвращает возможность пропуска критических данных Т-клеток на ранних стадиях иммунного ответа и открывает новые перспективы для иммуномониторинга Т-клеток. Будущее улучшение может заключаться в том, чтобы включить окрашивание для фосфогистона 3, которое позволит дифференцировать G2 и M21. Текущее ограничение заключается в том, что клетки должны быть зафиксированы и проницаемы для окрашивания ядерного маркера Ki67. Таким образом, клетки не могут быть использованы для других видов анализа, таких как сортировка и последующий функциональный анализ. Более того, красители ДНК, в том числе Hoechst, обычно мешают геномному анализу ДНК и не подходят для этого типа оценки. Идентификация мембранных маркеров, которые коррелируют с различными фазами клеточного цикла и которые могут быть окрашены на живых клетках, может преодолеть это ограничение. В заключение, метод имеет большой потенциал для оценки активированных / пролиферирующих Т-клеток в нескольких контекстах, таких как вакцинация, инфекция, иммуноопосредованные заболевания и иммунотерапия.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Наивные Т-клетки подвергаются клональному расширению и дифференцировке при антиген-прайминге. Дифференцированные Т-клетки демонстрируют эффекторные функции, которые необходимы для клиренса антигена и для поддержания антиген-специфической памяти, что является ключом к длительной защите. Во время первых шагов первичного ответа наивное взаимодействие Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками (АПК) в специализированных нишах в лимфоидных органах имеет решающее значение для индуцирования огромной пролиферации Т-клеток, которая характеризует фазу клонального расширения1,2,3. Взаимодействие Т-клеток и АПК тонко регулируется концентрацией и персистенцией антигена, костимулирующих сигналов и растворимых факторов (цитокинов и хемокинов), влияющих на количество и качество клонального потомства Т-клеток4,5,6,7.
Несмотря на интенсивные исследования клональной экспансии Т-клеток, до сих пор неизвестно, завершают ли антиген-праймированные Т-клетки весь свой клеточный цикл в месте распознавания антигена или они мигрируют в другие органы во время прогрессирования клеточного цикла. Этот недостаток знаний обусловлен свойствами доступных инструментов для анализа клеточного цикла. К ним относятся моноклональные антитела (mAbs), специфичные для ядерного маркера Ki67, и клеточные красители, которые либо идентифицируют клетки, прошедшие S-фазу клеточного цикла (например, бромодеоксиуридин (BrdU)), либо дискриминируют дочерние клетки и их предков (например, карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE)).
Однако клеточные меченые красители, такие как CFSE и BrdU, не позволяют определить, размножались ли клетки, обнаруженные в конкретном органе, локально или, скорее, мигрировали в этот участок после деления8,9. Более того, внутриядерный белок, Ki67, способен отличать клетки только в G0 (Ki67-отрицательные клетки) от клеток в любой другой фазе клеточного цикла (Ki67-положительные клетки). Таким образом, анализ Ki67 не отличает клетки в активной пролиферации (т.е. в S,G2или M) от клеток вG1,которые могут либо быстро прогрессировать до деления, либо оставаться в течение длительных периодов в G1, либо возвращаться кпокоям 10,11.
Здесь мы описываем новый метод проточной цитометрии для анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток12 из селезенки и лимфатических узлов (LN) вакцинированных мышей(Рисунок 1). Метод использует комбинацию Ki67 и окрашивания ДНК, которое ранее использовалось для анализа клеточного цикла мышиного костного мозга (БМ) кроветворных клеток13,14. Здесь мы успешно применили окрашивание ДНК Ki67 plus вместе с недавно опубликованной инновационной стратегией12для анализа клонального расширения CD8 Т-клеток. Мы смогли четко различать антиген-специфические CD8 Т-клетки в G0,вG1и в фазах S-G2/ M в селезенке и дренирующих LN вакцинированных мышей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

Клеточный цикл антиген-специфических Т-клеток in vivo был исследован с использованием нескольких методов, каждый из которых обладает некоторыми ограничениями. Бромодеоксиуридин (BrdU) отмечает клетки, которые находятся в S-фазе или недавно завершены, а карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE) обнаруживает дочерние клетки после деления. Однако эти красители не позволяют идентифицировать фазу клеточного цикла на момент анализа. Альтернативный подход заключается в использовании Ki67, маркера, который высоко экспрессируется клетками во всех фазах клеточного цикла, кроме фазы покоя G0. К сожалению, Ki67 не допускает дальнейшей дифференцировки, поскольку он не отделяет клетки в S-фазе, которые привержены митозу, от клеток в G1, которые могут оставаться в этойфазе, переходить в цикл или переходить в G0.
Здесь мы описываем метод проточной цитометрии для захвата «снимка» Т-клеток в различных фазах клеточного цикла во вторичных лимфоидных органах мыши. Метод сочетает в себе окрашивание Ki67 и ДНК с основным комплексом гистосовместимости (MHC)-пептидно-мультимерным окрашиванием и инновационной стратегией гатинга, что позволяет успешно дифференцировать антиген-специфические CD8 Т-клетки в G0,вG1 и в фазах S-G2/Mклеточного цикла в селезенке и дренирующих лимфатические узлы мышей после вакцинации вирусными векторами, несущими модельный антигенный кляп вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)-1.
Критическими шагами метода были выбор красителя ДНК и стратегия гатинга для повышения чувствительности анализа и включения высокоактивированных / пролиферирующих антиген-специфических Т-клеток, которые были бы пропущены текущими критериями анализа. Днк-краситель, Hoechst 33342, позволил получить высококачественную дискриминацию пиков ДНК G0/G1 и G2/M, сохраняя при этом мембранное и внутриклеточное окрашивание. Метод имеет большой потенциал для расширения знаний о реакции Т-клеток in vivo и улучшения анализа иммуномониторинга.

Фазы клеточного цикла клеток из селезенки, LN и BM мышей Balb/c были проанализированы с использованием флуоресцентного красителя ДНК Hoechst и анти-Ki67 mAb, в соответствии с протоколом, обобщенным на рисунке 1. Это окрашивание позволило дифференцировать клетки в следующих фазах клеточного цикла: G0 (Ki67neg, с 2N ДНК, определяемым как DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) и S-G2/ M (Ki67pos, с содержанием ДНК, содержащимся между 2N и 4N, или равным 4N ДНК, определенной как DNA промежуточный / высокий).
Сначала мы провели анализ клеточного цикла клеток BM для воспроизведения ранее опубликованных результатов13,14, а затем проанализировали интересующие клетки, то есть CD8 Т-клетки. На рисунке 2 показан типичный пример анализа клеточного цикла BM-клеток(рисунок 2A). Протокол дал низкий коэффициент вариации (CV) пиков ДНК G0/G1 иG2/M, что указывает на отличное качество окрашивания ДНК(рисунок 2B,показывающий пример с CV < 2,5; CV всегда было < 5 во всех экспериментах).
Затем мы применили тот же протокол к антиген-специфическим CD8 Т-клеткам вакцинированных мышей. Мышей BALB/c вакцинировали против антигенного кляпа ВИЧ-1, используя Chad3-кляп для прайминга и MVA-кляп для бустирования, оба спроектированы для переноса кляпа ВИЧ-1. В день (d) 3 после повышения мы проанализировали частоту специфических для кляпа CD8 Т-клеток из селезенки и дренирующих LN. Мы воспользовались недавно определенной стратегией гатинга для Т-клеток на ранней стадии иммунного ответа, которая, в отличие от обычной стратегии, подходит для обнаружения высокоактивированных антиген-реагирующих CD8 Т-клеток12. Мы реализовали новую стратегию в пять последующих шагов. На шаге 1 мы исключили дублеты или агрегаты с помощью ДНК-A/-W gate, а на шаге 2 мы идентифицировали живые клетки путем исключения мертвых клеточных маркеров. На шаге 3 мы идентифицировали интересующую популяцию, используя нетрадиционный «расслабленный» затвор FSC-A/ SSC-A(рисунок 3A)вместо канонического узкого лимфоцитарного затвора12. После захвата CD3+CD8+ клеток (шаг 4 на рисунке 3A)мы идентифицировали специфические для кляпа CD8 Т-клетки с помощью двух различных мультимеров MHC, то есть Pent-gag и Tetr-gag (шаг 5 на рисунке 3A). Мы использовали два мультимера вместо одного для улучшения чувствительности обнаружения CD8 T-клеток у вакцинированных мышей, не увеличивая фон окрашивания у необработанных мышей(рисунок 3B и C,шаг 5). Таким образом, мы успешно дифференцировали необработанных мышей (0,00% и 0,00% антиген-специфических CD8 Т-клеток в LN и селезенке соответственно) от вакцинированных мышей (0,46% и 0,29% антиген-специфических CD8 Т-клеток в LN и селезенке соответственно, рисунок 3В и С).
Примечательно, что протокол позволил нам иметь чрезвычайно низкий фон в антиген-специфических CD8 T-клеточных воротах LN и селезенки необработанных мышей (обычно 0,00% и максимум 0,02%). Сравнение участков FSC-A/SSC-A показал, что клетки, специфичные для кляпа, имели высокий уровень SSC-A и FSC-A(рисунок 3D),подтверждая необходимость использования «расслабленного» затвора FSC-A/SSC-A для захвата этих клеток. Затем мы оценили процентное содержание CD8-специфических CD8 Т-клеток в разных фазах клеточного цикла(рисунок 4A). Мы обнаружили, что специфические для кляпа CD8 Т-клетки в селезенке и даже больше в дренирующих LN содержали высокую долю клеток в фазах S-G2/ M на 3-й день после буста (18,60% и 33,52% соответственно).
Кроме того, мы обнаружили, что специфические для кляпа CD8 Т-клетки в фазах S-G2/ M имели высокий FSC-A и SSC-A при наложении на общие CD8 Т-клетки из того же органа(рисунок 4B). Экспрессия CD62L специфическими для Кляпа CD8 Т-клетками была низкой, как и ожидалось для активированных Т-клеток, за исключением нескольких клеток в G0 вLN (рисунок 4C). В целом, эти результаты подтвердили, что «расслабленный» затвор (этап 3 фиг.3A, B и C)должен был включать все пролиферирующие антиген-специфические CD8 Т-клетки12. Протокол был чрезвычайно ценным для «моментальной» оценки фаз клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток во время анализа и экспрессии CD62L клетками в разных фазах клеточного цикла.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Рисунок 1: Схема протокола анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Рисунок 2:Анализ клеточного цикла клеток BM. Клетки BM от необработанных мышей Balb/c окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. (A) Пример стратегии гатинга. Мы остановились на отдельных клетках на участке ДНК-A/-W (слева), а затем на живых клетках путем исключения красителя мертвых клеток (посередине). Затем для всех ячеек БМ (справа) использовался «расслабленный» затвор FSC-A/SSC-A. (B) Пример анализа клеточного цикла клеток БМ (слева). Мы использовали комбинацию Окрашивания Ki67 и ДНК для идентификации клеток в следующих фазах клеточного цикла: G0 (нижний левый квадрант, клетки Ki67neg-DNAlow), G1 (верхний левый квадрант, Ki67pos-DNAlow), S-G2/ M (верхний правый квадрант, Ki67pos-DNA промежуточный / высокий). Показан флуоресцентный минус один (FMO) контроль Ki67 mAb (в середине) и гистограммы ДНК (справа). На графике гистограммы ДНК левая и правая вентили соответствуют пику ДНК G0/G1 иG2/M соответственно, а числа представляют коэффициенты вариации (CV) каждого пика. На всех остальных графиках числа представляют собой процент ячеек в указанных затворах. На рисунке показан 1 репрезентативный эксперимент из 5. В каждом эксперименте мы анализировали объединенные BM-клетки 3 мышей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Рисунок 3:Анализ антиген-специфических CD8 Т-клеток из LN и селезенки. Мышей Balb/c вводили внутримышечно (i.m.) с Chad3-gag и усиленным i.m. с MVA-клягом. На 3-й день после форсирования дренирование клеток LN и селезенки у вакцинированных и необработанных контрольных мышей окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. а) схема стратегии определения отдельных ячеек в пять этапов для выявления отдельных ячеек (этап 1); живые клетки (Шаг 2); лимфоциты (Шаг 3); CD8 Т-клетки (Шаг 4); и клетки, специфичные для кляпа (шаг 5). (В-С) Пример графиков: анализ клеток (В) LN и (С) селезенки необработанных (сверху) и вакцинированных (нижних) мышей. Мы идентифицировали отдельные клетки на участке ДНК-A/-W на шаге 1. Затем, на шаге 2, мы выбрали живые клетки путем исключения красителя мертвых клеток. На шаге 3 мы использовали неканонические «расслабленные» ворота для лимфоцитов. На шаге 4 мы идентифицировали CD8 Т-клетки по их двойной экспрессии CD3 и CD8. Затем мы идентифицировали клетки, специфичные для кляпа, а не гэг-специфические на этапе 5, основываясь на их способности связывать меченые фторхромом H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) и H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), или нет, соответственно. (D) Профили FSC-A/SSC-A клеток, специфичных для кляпа (синий), а не для кляпов (серый), после вскрытия, как описано выше. Числа представляют проценты ячеек в указанных воротах. На рисунке показан 1 репрезентативный эксперимент из 5. В каждом эксперименте мы анализировали объединенную селезенку и объединенные LN-клетки 3 вакцинированных мышей и 3 необработанных мышей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Рисунок 4:Анализ клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток. Мышей вакцинировали, как показано на рисунке 3, а анализ клеточного цикла клеток, специфичных для кляпа, проводили на 3-й день после форсирования, после гастинга в 5 шагов, как на рисунке 3. (A)Пример анализа клеточного цикла специфических CD8 Т-клеток из LNs (сверху) и селезенки (снизу) вакцинированных мышей. Фазы клеточного цикла были идентифицированы, как показано на рисунке 2B. Панели представляют собой ячейки в G0,в G1и в S-G 2 / M(слева)и флуоресценция минус один (FMO) управления Ki67 mAb (справа). Числа представляют проценты ячеек в указанных воротах. (B) Точечные графики FSC-A/SSC-A, показывающие специфические для кляпа CD8 Т-клетки в фазах S-G2/ M (красным цветом), наложенные на общее количество CD3+CD8+ Т-клеток (серым цветом) из LNs (вверху) и селезенки (снизу) вакцинированных мышей. (C) Смещенные гистограммы, показывающие экспрессию CD62L специфическими для кляпа CD8 Т-клетками в G0 (зеленый), в G1 (синий)и в S-G 2 / M (красный) из LNs (вверху) и селезенки (снизу) вакцинированных мышей. Оси Y указывают на нормализованное число событий. На рисунке показан 1 репрезентативный пример из 5 независимых экспериментов с 15 мышами. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный материал: настройки проточного цитометра. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Клональная экспансия является ключевой особенностью антиген-специфического ответа Т-клеток. Тем не менее, клеточный цикл Т-клеток, реагирующих на антиген, был плохо изучен, отчасти из-за технических ограничений. Описан проточный цитометрический метод анализа клонально расширяющихся антиген-специфических CD8 Т-клеток в селезенке и лимфатических узлах вакцинированных мышей.

Анализ проточной цитометрии на основе ДНК/Ki67 для анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток у вакцинированных мышей

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Наш протокол обеспечивает практический подход, с помощью которого мышиная селезенка и лимфатические узлы могут быть использованы для отражения динамики ответа Т-клеток, превышающей обеспечение стационарного фенотипического снимка. Наш метод чувствительно обнаруживает антиген-специфические CD8 Т-клетки, которые участвуют в постоянном ответе. Пролиферирующие CD8 Т-клетки измеряются без возможных смешанных эффектов лечения препаратами in vivo или переноса клеток.Наша методика может обеспечить окно в иммунную динамику в нескольких настройках. Например, в отношении ответа на вакцинацию и инфекции, аутоиммунные заболевания и иммунотерапию рака. Подготовьте свежий 1-кратный буфер для промывки пермеабилизации, разбавляя 10-кратный буфер пермеабилизации дистиллированной водой и фильтруя его через фильтр 0,45 микрометра для устранения заполнителей.Разбавляют моноклональное антитело Ki67 FITC в 1x буфере промывки пермеабилизации, как определено в эксперименте по титрованию для конечного объема 100 микролитров на образец. Добавьте 3 миллилитра 1x проницаемого промывочного буфера в каждую трубку с ячейками и центрифугой при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант.Опять же, добавьте 1x проницаемый промывочный буфер и центрифугу к гранулированным ячейкам. Затем отбросьте супернатант. Добавьте в гранулу 100 микролитров разбавленного моноклонального антитела Ki67 FITC, затем вихрь и инкубируйте в течение 30 минут в темноте.После инкубации дважды промывайте клетки 4 миллилитрами 1x буфера проницаемости, центрифугируя после каждой промывки, и выбрасывайте супернатант. Добавьте 350 микролитров PBS к клеточной грануле для образцов, которые будут получены непосредственно на проточном цитометре, и 250 микролитров PBS в гранулу клетки для образцов, которые будут инкубированы с Hoechst для окрашивания ДНК. Приготовьте раствор Hoechst и PBS и добавьте его в каждый образец так, чтобы конечная концентрация составляла два микрограмма на миллилитр.Вихрь и инкубация образцов в течение 15 минут в темноте. Затем центрифугируйте образцы в течение пяти минут и добавьте 350 микролитров PBS в гранулу ячейки. Откройте программное обеспечение и создайте различные группы, соответствующие различным органам для анализа, щелкнув Создать группу» в разделе ленты рабочей области.Откройте окно измененной группы, дважды щелкнув по имени группы, и синхронизируйте вновь созданные группы, вставив галочку на синхронизированную функцию. Перетащите каждый файл FCS в соответствующую группу, а затем создайте стратегию gating, начиная с группы a-LN. Откройте окно графика, дважды щелкнув по полностью окрашенному образцу, чтобы отобразить неочищенные события, полученные для образца, на точечном графике.Обратите внимание, что оси X и Y помечены как в файлах FCS, как указано во второй таблице файла настроек проточного цитометра этой рукописи. Убедитесь, что отображается достаточное количество событий для соответствующей визуализации. При необходимости откройте настройки, щелкнув значок сердца на ленте рабочей области, выберите «Графики», затем «Точечный график» в качестве типа графика и проверьте правильность количества точек, нарисованных в соответствующем поле, или измените его.Отображение неочищенных событий в окне графика в виде точечного графика с ДНК-A на оси x и DNA-W на оси Y. Используйте линейное масштабирование для обеих осей. При необходимости измените масштаб с логарифмического на линейный, нажав на поле, указанное буквой Т рядом с каждой осью в окне графика.Выберите популяцию одной ячейки, щелкнув по прямоугольнику в разделе инструмента gating, а затем дважды щелкните в центре прямоугольного затвора, чтобы отобразить одиночные ячейки на точечном графике с параметром FSC-A на оси X и мертвой ячейкой на оси Y. Нажмите на полигон, чтобы выбрать популяцию живых клеток, которые являются отрицательными для мертвых клеток. Дважды щелкните в центре затвора полигона, чтобы отобразить ячейки на точечном графике с параметром FSC-A по оси X и параметром SSC-A по оси Y.Нажмите на прямоугольник и создайте расслабленные ворота, чтобы включить все отдельные живые ячейки в этот график. Дважды щелкните в центре расслабленных ворот, чтобы отобразить ячейки на точечном графике с CD3 по оси X и CD8 по оси Y. Используйте соответствующую шкалу доступа для визуализации в окне графика.При необходимости измените шкалу x и y, щелкнув по полю, обозначенному буквой T рядом с каждой осью, выберите «Настроить функцию доступа» и при необходимости измените дополнительные десятилетия с базами и положительными десятилетиями. Выберите CD3+CD8+ячейки, щелкнув по полигону. Дважды щелкните в центре затвора CD3+CD8+, чтобы отобразить ячейки на точечном графике с Tetr-gag на оси x и Pent-gag на оси Y.Выберите антиген-специфические CD8 Т-клетки, нажав на полигон. Дважды щелкните в центре затвора, специфичного для кляпа, чтобы отобразить клетки на точечном графике с ДНК-A на оси X и Ki67 на оси Y. Выделите ячейки в различных фазах цикла ячеек, нажав на Quad" в разделе инструмента gating окна графика.Скопируйте стратегию блокировки, созданную в одном образце, в соответствующую группу, чтобы применить ворота ко всем образцам группы. Затем скопируйте стратегии захвата для групп b-spleen и CBM, как описано в рукописи текста. Убедитесь, что все затворы подходят для каждого образца из трех групп.При необходимости десинхронизируйте группу и измените ворота, как описано в рукописи. Отображение BM-клеток расслабленных ворот на точечном графике с ДНК-A по оси x и Ki67 по оси Y. Визуализируйте результаты, щелкнув Редактор макетов" в разделе ленты рабочей области.Перетащите каждый вентиль стратегии затвора в области примера в редактор макета и разместите графики в соответствии с последовательностью затвора. При необходимости измените тип графика, дважды щелкнув по соответствующему графику в макете и выбрав соответствующий тип в окне определения графика. Нажмите на группу и выполните итерацию по функциям на ленте макета, чтобы визуализировать результаты, полученные в антиген-специфических CD8 Т-клетках из каждого органа и сравнить различные образцы.Визуализируйте результаты клеток костного мозга, представляющих положительный контроль. Типичный пример анализа клеточного цикла клеток костного мозга показан здесь. Протокол дал низкий коэффициент вариации от G0 до G1 и от G2 до M пиков ДНК, что указывает на отличное качество окрашивания ДНК.Для идентификации антиген-специфических CD8 клеток была использована пятиступенчатая стратегия гейтинга. Два мультимера были использованы для улучшения чувствительности обнаружения CD8 T-клеток у вакцинированных мышей без увеличения фона окрашивания у необработанных мышей. Кляп-специфические CD8 Т-клетки в дренирующих лимфатических узлах и в селезенке содержат высокую долю клеток в фазах S-G2 / M на третий день после повышения.Кроме того, специфические для кляпа CD8 Т-клетки в фазах S-G2 / M имели высокий FSC-A и SSC-A при наложении на общие CD8 Т-клетки из того же органа. Офсетные гистограммы показали, что экспрессия CD62L специфическими для кляпа CD8 Т-клетками была низкой, как и ожидалось для активированных Т-клеток, за исключением нескольких клеток в G0 в лимфатических узлах. Этот метод предназначен для Т-клеток для достижения отличного качества окрашивания ДНК вместе с мембраной и окрашиванием Ki67.Анализ данных проточной цитометрии является ключевым моментом. Обязательно используйте соответствующий контроль для позиционирования ворот. Используя этот метод, мы обнаружили Т-клетки в фазах S-G2 / M клеточного цикла в периферической крови мыши и человека.Этот метод был полезен в исследованиях иммуномониторинга при диабете 1 типа, инфекционном мононуклеозе и COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Изоляция мыши Почки-Резидент CD8 -Т-клетки для анализа цитометрии потока

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...