Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Reithera, av MIUR-projektet 2017K55HLC_006 och av 5 × 1000 bidrag från Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Följande tetramer erhölls genom NIH Tetramer Facility: APC-konjugerad H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

A. Folgori och S. Capone är anställda av Reithera Srl. A. Nicosia namnges uppfinnare på patentansökan WO 2005071093 (A3) "Chimpanzee adenovirusvaccinbärare." De andra författarna har inget att avslöja.

Även om T-cellsklonal expansion har studerats intensivt, är vissa aspekter fortfarande okända, främst för att de verktyg som finns tillgängliga för att undersöka det är få och har sina egna nackdelar. Ur detta perspektiv sätter vi upp en mycket känslig flöde cytometrisk metod för att analysera cellcykeln av antigenspecifika CD8 T-celler tidigt efter vaccination i en musmodell. Protokollet är baserat på en kombination av Ki67 och DNA-färgning, som tidigare användes för att analysera cellcykeln av BM-hematopoetiska celler hos möss13,14. För att anpassa protokollet till antigenspecifika CD8 T-celler var vi tvungna att överväga några kritiska frågor, inklusive valet av DNA-färgämnet, lämpliga villkor för att erhålla jämförbar DNA-färgning över olika prover och gatingstrategin för dataanalys.
Många färgämnen finns tillgängliga för DNA-färgning, inklusive propidiumjodid och 7-aminoactinomycin D; vi valde Hoechst eftersom det var kompatibelt med membranfärgning och det milda fixerings- / permeabiliseringsprotokollet som krävs för Ki67-färgning. Samtidigt gjorde färgning med Hoechst det möjligt för oss att få ett DNA-histogram av utmärkt kvalitet, dvs. G0/ G1 och G2/ M DNA-topparna hade en mycket lägre variationskoefficient (CV) än DNA-toppar som vanligtvis erhålls med andra DNA-färgämnen, t.ex. DRAQ519. Faktum är att Hoechst kan färga DNA även i levande celler20.
Vissa strategier användes för att undvika fluktuationer i Hoechst-intensiteten i olika prover av samma experiment. Hoechst färgning utfördes strax före prov förvärv vid flödet cytometer för att minimera nedgången av färgämne intensitet under tiden. För dem som är intresserade av att reproducera protokollet i stora experiment med många prover rekommenderar vi att du utför Hoechst-färgning på några prover åt gången. En annan nackdel är att Hoechst-intensiteten kan påverkas kraftigt av cellantal under inkubation med färgämnet. Av denna anledning rekommenderar vi starkt att du alltid använder samma antal celler och samma volym per prov för DNA-färgning. Om ett stort antal celler krävs för förvärv vid flödescytometern rekommenderar vi att du förbereder två eller flera identiska prover och sedan sammanfogar dem strax före Hoechst-färgningssteget.
En viktig punkt i protokollet är gating-strategin för dataanalys. Vi publicerade nyligen en ny strategi för T-cellsanalys i tidiga tider av immunsvaret, vilket gjorde det möjligt för oss att öka känsligheten för detektion av antigenspecifika T-celler12. Vi tillämpade denna strategi på de uppgifter som visas här på följande sätt. Först uteslöt vi cellaggregat i DNA-A/W-området. För det andra, efter att ha gating ut döda celler, använde vi en ganska stor lymfocytport i FSC / SSC-tomten ("avslappnad grind"). Genom denna strategi kunde vi inkludera högaktiverade antigen-specifika CD8 T celler i S-G2/ M som vanligtvis missas av nuvarande gating strategier, eftersom dessa celler har hög FSC-A och SSC-A. Sammanfattningsvis representerar dataanalysen en kritisk del av metoden, vilket är viktigt för att erhålla en känslig detektion av aktiverade /prolifererande antigenspecifika T-celler.
Metoden förhindrar möjligheten att missa kritiska T-celldata i tidiga faser av immunsvaret och öppnar nya perspektiv för T-cellsimmunövervakning. En framtida förbättring kan vara att inkludera färgning för fospho-histon 3 som skulle möjliggöra differentiering mellan G2 och M21. En aktuell begränsning är att celler måste fixeras och permeabiliseras för att färga för kärnmarkören Ki67. Celler kan därför inte användas för andra typer av analyser, till exempel sortering och efterföljande funktionell analys. Dessutom stör DNA-färgämnen, inklusive Hoechst, vanligtvis den genomiska DNA-analysen och är inte lämpliga för denna typ av utvärdering. Identifiering av membranmarkörer som korrelerar med olika cellcykelfaser och som kan färgas på levande celler kan övervinna denna begränsning. Sammanfattningsvis har metoden stor potential för utvärdering av aktiverade/prolifererande T-celler i flera sammanhang såsom vaccination, infektion, immunmedierade sjukdomar och immunterapi.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naiva T-celler genomgår klonisk expansion och differentiering vid antigenpriming. Differentierade T-celler uppvisar effektorfunktioner som är väsentliga för antigenfrigång och för underhåll av antigenspecifikt minne, vilket är nyckeln till långvarigt skydd. Under de första stegen i det primära svaret är naiv T-cellinteraktion med antigenpresenterande celler (APCs) inom specialiserade nischer i lymfoida organ avgörande för att inducera den enorma T-cellsproliferation som kännetecknar klonexpansionsfas1,2,3. T-cell-APC-interaktionen regleras fint av koncentration och persistens av antigen, samstimulerande signaler och lösliga faktorer (cytokiner och kemokner) som påverkar kvantiteten och kvaliteten på T-cellsklonalaavkomman 4,5,6,7.
Trots intensiva studier av T-cells klonurvalet expansion, är det fortfarande inte känt om antigen-primed T-celler slutföra hela sin cellcykel på platsen för antigen erkännande, eller om de migrerar till andra organ under cell cykel progression. Denna brist på kunskap beror på egenskaperna hos tillgängliga verktyg för cellcykelanalys. Dessa inkluderar monoklonala antikroppar (mAbs) som är specifika för kärnmarkören Ki67 och cellfärgämnen som antingen identifierar celler som har genomgått S-fasen av cellcykeln (t.ex. Bromodeoxyuridin (BrdU)) eller diskriminerar mellan dotterceller och deras förfäder (t.ex. karboxoxyfluoresceinsuccinimidyl ester (CFSE)).
Cellmärkningsfärgämnen, såsom CFSE och BrdU, tillåter dock inte bestämning av om celler som finns i ett visst organ förökade sig lokalt eller snarare migrerade till denna plats efter division8,9. Dessutom kan det intranukleära proteinet, Ki67, endast skilja celler i G0 (Ki67-negativa celler) från dem i någon annan cellcykelfas (Ki67-positiva celler). Således skiljer Ki67-analysen inte celler i aktiv spridning (dvs. i S, G2eller M) från dem i G1, som antingen snabbt kan utvecklas till delning eller stanna under långa perioder i G1 eller återgå till quiescence10,11.
Här beskriver vi en ny flödescytometrisk metod för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler12 från mjälte- och lymfkörtlarna (LN) hos vaccinerade möss (figur 1). Metoden utnyttjar en kombination av Ki67 och DNA-färgning som tidigare användes för att analysera cellcykeln för musbensmärg (BM) hematopoetiska celler13,14. Här tillämpade vi framgångsrikt Ki67 plus DNA-färgning, tillsammans med den nyligen publicerade innovativa gatingstrategin12, på analysen av CD8 T-cellklonal expansion. Vi kunde tydligt skilja mellan antigenspecifika CD8 T-celler i G0, i G1, och i S-G2/ M faser i mjälten och dränera LNs av vaccinerade möss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

Cellcykeln av antigenspecifika T-celler in vivo har undersökts med hjälp av några metoder, som alla har vissa begränsningar. Bromodeoxyuridin (BrdU) markerar celler som är i eller nyligen avslutade S-fas, och karboxoxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) upptäcker dotterceller efter delning. Dessa färgämnen tillåter dock inte identifiering av cellcykelfasen vid tidpunkten för analysen. Ett alternativt tillvägagångssätt är att utnyttja Ki67, en markör som uttrycks starkt av celler i alla faser av cellcykeln utom den quiescent fas G0. Tyvärr tillåter Ki67 inte ytterligare differentiering eftersom det inte separerar celler i S-fas som är engagerade i mitos från de i G1 som kan förbli i denna fas, fortsätt till cykling eller flytta in i G0.
Här beskriver vi en flöde cytometrisk metod för att fånga en "ögonblicksbild" av T-celler i olika cellcykel faser i musen sekundära lymfoida organ. Metoden kombinerar Ki67 och DNA-färgning med större histokompatibilitetskomplex (MHC)-peptid-multimerfärgning och en innovativ gatingstrategi, vilket gör det möjligt för oss att framgångsrikt skilja mellan antigenspecifika CD8 T-celler i G0, i G1 och i S-G2/ M faser av cellcykeln i mjälten och dränera lymfkörtlarna hos möss efter vaccination med virusvektorer som bär modellantigenskämt av humant immunbristvirus (HIV)-1.
Kritiska steg i metoden var valet av DNA-färgämnet och gatingstrategin för att öka analyskänsligheten och inkludera högaktiverade/prolifererande antigenspecifika T-celler som skulle ha missats av nuvarande analyskriterier. DNA-färgämnet, Hoechst 33342, gjorde det möjligt för oss att få en högkvalitativ diskriminering av G0/ G1 och G2/ M DNA-toppar, samtidigt som membran och intracellulär färgning bevaras. Metoden har stor potential att öka kunskapen om T-cells respons in vivo och förbättra immunoövervakningsanalysen.

Cellcykelfaserna av celler från mjälte, LNs och BM hos Balb/c-möss analyserades med hjälp av det fluorescerande DNA-färgämnet Hoechst och en anti-Ki67 mAb, enligt protokollet som sammanfattas i figur 1. Denna färgning möjliggjorde differentiering av celler i följande faser av cellcykeln: G0 (Ki67neg, med 2N DNA definierat som DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) och S-G2/M (Ki67pos, med en DNA-halt som består av mellan 2N och 4N, eller lika med 4N DNA definierat som DNAintermediate/high).
Vi utförde först cellcykelanalys av BM-celler för att reproducera tidigare publicerade resultat13,14 och analyserade sedan de celler som var av intresse, dvs CD8 T-celler. Figur 2 visar ett typiskt exempel på cellcykelanalys av BM-celler (figur 2A). Protokollet gav en låg variationskoefficient (CV) på G0/G1 och G2/M DNA-toppar, vilket indikerar den utmärkta kvaliteten på DNA-färgningen(figur 2B, som visar ett exempel med CV < 2.5; CV var alltid < 5 i alla experiment).
Vi tillämpade sedan samma protokoll på antigenspecifika CD8 T-celler från vaccinerade möss. BALB/c möss vaccinerades mot antigen gag av HIV-1 genom att använda Chad3-gag för priming och MVA-gag för boosting, båda konstruerade för att bära HIV-1 munkavle. På dag (d) 3 post-boost analyserade vi frekvensen av gag-specifika CD8 T celler från mjälten och dräneraNDE LNs. Vi utnyttjade den nyligen definierade gatingstrategin för T-celler i den tidiga fasen av immunsvaret, som i motsats till den konventionella strategin är lämplig för att upptäcka högaktiverade antigensvarande CD8 T-celler12. Vi genomförde den nya strategin i fem efterföljande steg. I steg 1 uteslöt vi dubbelgångare eller aggregat med DNA-A/ -W-grind, och i steg 2 identifierade vi levande celler genom uteslutning av döda celler. I steg 3 identifierade vi den intressepopulation som använde en icke-konventionell "avslappnad" FSC-A / SSC-A-grind(figur 3A) istället för den kanoniska smala lymfocytporten12. Efter gating på CD3+CD8+ celler (steg 4 i figur 3A) identifierade vi munkavlespecifika CD8 T-celler med hjälp av två olika MHC-multimerer, dvs. Pent-gag och Tetr-gag (steg 5 i figur 3A). Vi använde två multimerer istället för en för att förbättra känsligheten hos gag-specifika CD8 T-celldetektering hos vaccinerade möss, utan att öka färgningsbakgrunden hos obehandlade möss (figur 3B och C, steg 5). Således utmärkte vi framgångsrikt obehandlade möss (0,00% och 0,00% antigenspecifika CD8 T-celler i LN respektive mjälte) från vaccinerade möss (0, 46% respektive 0,29% antigenspecifika CD8 T-celler i LN respektive mjälte, figur 3B respektive C).
Protokollet tillät oss att ha en extremt låg bakgrund i den antigenspecifika CD8 T-cellporten av LNs och mjälte av obehandlade möss (vanligtvis 0,00% och högst 0,02%). Jämförelsen av gag-specifika och inte gag-specifika FSC-A / SSC-A tomter visade att de gag-specifika cellerna hade hög SSC-A och FSC-A (Figur 3D), bekräftar behovet av att använda en "avslappnad" FSC-A / SSC-A gate för att fånga dessa celler. Vi utvärderade sedan procentandelarna av gag-specifika CD8 T-celler i olika cellcykelfaser (figur 4A). Vi fann att gag-specifika CD8 T celler i mjälten och ännu mer i dränerande LNs innehöll en hög andel celler i S-G2/M faser på dag 3 post-boost (18,60% respektive 33,52%).
Dessutom fann vi att gag-specifika CD8 T-celler i S-G2/ M faser hade hög FSC-A och SSC-A, när de överlagrades på de totala CD8 T-cellerna från samma organ (figur 4B). CD62L-uttrycket av gagspecifika CD8 T-celler var lågt, som förväntat för aktiverade T-celler, med undantag för några celler i G0 i LN(figur 4C). Sammantaget bekräftade dessa resultat att den "avslappnade" porten (steg 3 i figur 3A, B och C) var skyldig att inkludera alla prolifererande antigenspecifika CD8 T-celler12. Protokollet var extremt värdefullt för en "ögonblicksbild" utvärdering av cell cykel faser av antigen-specifika CD8 T celler vid tidpunkten för analysen och av CD62L uttryck av celler i olika cell cykel faser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Figur 1: Protokollsystemet för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Figur 2: Cellcykelanalys av BM-celler. BM celler från obehandlade Balb/c möss färgades och analyseras av flöde cytometry. A) Exempel på gatingstrategi. Vi gated på enstaka celler i DNA-A/-W plot (vänster) och därefter på levande celler genom död cell färg uteslutning (mitten). Sedan användes en "avslappnad" FSC-A / SSC-A gate för alla BM-celler (höger). (B) Exempel på cellcykelanalys av BM-celler (vänster). Vi använde en kombination av Ki67 och DNA-färgning för att identifiera celler i följande faser av cellcykeln: G0 (nedre vänstra kvadranten, Ki67neg-DNAlow celler), G1 (övre vänstra kvadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (övre högra kvadrant, Ki67pos-DNAintermediate/hög). Fluorescens minus en (FMO) kontroll av Ki67 mAb (mitten) och DNA histogram (höger) visas. I DNA-histogramdiagrammet motsvarar vänster och höger grindar G0/G1 respektive G2/M DNA-topp, och siffrorna representerar variationskoefficienterna (CV) för varje topp. I alla andra diagram representerar siffrorna cellprocent i de angivna portarna. Siffran visar 1 representativt experiment av 5. I varje experiment analyserade vi poolade BM-celler från 3 möss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Figur 3: Analys av antigenspecifika CD8 T-celler från LN och mjälte. Balb/c möss primedes intramuskulärt (i.m.) med Chad3-gag och boosted i.m. med MVA-gag. Dag 3 efter boost, dränerande LN och mjälte celler från vaccinerade och obehandlade kontroll möss färgades och analyseras av flöde cytometri. A) Gitterstrategins system i fem steg för att identifiera enstaka celler (steg 1). levande celler (steg 2); lymfocyter (steg 3); CD8 T-celler (steg 4); och gag-specifika celler (steg 5). (B-C) Exempel på diagram: analys av celler från (B) LNs och (C) mjälte av obehandlade (övre) och vaccinerade (botten) möss. Vi identifierade enstaka celler på DNA-A/ -W-området i steg 1. Sedan, i steg 2, valde vi levande celler genom uteslutning av döda celler. I steg 3 använde vi en icke-kanonisk "avslappnad" grind för lymfocyter. I steg 4 identifierade vi CD8 T-celler genom deras dubbla uttryck av CD3 och CD8. Vi identifierade sedan gag-specifika celler och inte gag-specific i steg 5, baserat på deras förmåga att binda fluorokrom-märkt H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) och H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag), respektive inte. D) FSC-A/SSC-A-profiler av munkavlespecifika (blå) och inte gagspecifika (grå) celler efter gating enligt beskrivningen ovan. Tal representerar cellprocent i de angivna portarna. Siffran visar 1 representativt experiment av 5. I varje experiment analyserade vi poolade mjälte och poolade LN-celler från 3 vaccinerade möss och 3 obehandlade möss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Figur 4: Cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler. Möss vaccinerades som i figur 3 och cellcykelanalys av munkavlespecifika celler utfördes dag 3 efter boost, efter gating i 5 steg som i figur 3. (A)Exempel på cellcykelanalys av gagspecifika CD8 T-celler från LN (överst) och mjälte (botten) av vaccinerade möss. Cellcykelfaserna identifierades som i figur 2B. Panelerna representerar celler i G0, i G1och i S-G2/M (vänster) och Fluorescence Minus One (FMO) kontroll av Ki67 mAb (höger). Tal representerar cellprocent i de angivna portarna. B) FSC-A/SSC-A punktdiagram som visar gagspecifika CD8 T-celler i S-G2/M-faser (i rött) överlagrade på totalt CD3+CD8+ T-celler (i grått) från LN (överst) och mjälte (botten) av vaccinerade möss. C) Offset histogram som visar CD62L-uttryck genom munkavlerespecifika CD8 T-celler i G0 (grön), i G1 (blå) och i S-G2/M (röd) från LNs (överst) och mjälte (botten) av vaccinerade möss. Y-axlarna anger normaliserat antal händelser. Figuren visar 1 representativt exempel av 5 oberoende experiment med totalt 15 möss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande material: Flödescytometerinställningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Klonisk expansion är en viktig egenskap hos antigenspecifika T-cellssvar. Cellcykeln av antigen-svarande T-celler har dock dåligt undersökts, delvis på grund av tekniska begränsningar. Vi beskriver en flöde cytometric metod för att analysera clonally expandera antigen-specifika CD8 T celler i mjälte och lymfkörtlar av vaccinerade möss.

En DNA/Ki67-baserad flödescytometrianalys för cellcykelanalys av antigenspecifika CD8 T-celler hos vaccinerade möss

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Vårt protokoll ger ett praktiskt tillvägagångssätt genom vilket mus mjälte och lymfkörtlar kan användas för att återspegla dynamiken i T-cellsrespons större än att ge en steady-state fenotypisk ögonblicksbild. Vår teknik detekterar känsligt antigen-specifika CD8 T celler som är engagerade i en pågående svar. Prolifererande CD8 T-celler mäts utan de eventuellt förvirrande effekterna av in vivo läkemedelsbehandling eller cellöverföring.Vår teknik kan ge ett fönster i immundynamik i flera miljöer. Till exempel i förhållande till svar på vaccination och infektioner, autoimmuna sjukdomar och cancerimmunterapi. Förbered färsk 1x permeabiliseringstvättbuffert genom att späda ut 10x permeabiliseringsbuffert med destillerat vatten och filtrera den genom ett 0,45 mikrometerfilter för att eliminera aggregat.Späd monoklonal antikropp Ki67 FITC i 1x permeabiliseringstvättbuffert enligt en titreringsexperiment för en slutlig volym på 100 mikroliter per prov. Tillsätt 3 milliliter av 1x permeabiliseringstvättbuffert till varje rör med celler och centrifugera vid 400 G i fem minuter vid rumstemperatur. Kasta supernatanten.Lägg återigen till 1x permeabiliseringstvättbuffert och centrifug för att pelletera cellerna. Kassera sedan supernatanten. Tillsätt 100 mikroliter utspädd monoklonal antikropp Ki67 FITC till pelleten, virvel och inkubera i 30 minuter i mörker.Efter inkubationen tvätta cellerna två gånger med 4 milliliter 1x permeabiliseringsbuffert, centrifugering efter varje tvätt och kassera supernatanten. Tillsätt 350 mikroliter PBS i cellpelleten för prover som ska införskaffas direkt vid flödescytometern och 250 mikroliter PBS till cellpelleten för prover som ska inkuberas med Hoechst för DNA-färgning. Förbered Hoechst- och PBS-lösningen och tillsätt den till varje prov så att den slutliga koncentrationen är två mikrogram per milliliter.Virvel och inkubera proverna i 15 minuter i mörker. Centrifugera sedan proverna i fem minuter och tillsätt 350 mikroliter PBS till cellpelleten. Öppna programvaran och skapa olika grupper som motsvarar de olika organ som ska analyseras genom att klicka på Skapa grupp"i avsnittet arbetsyta.Öppna det ändrade gruppfönstret genom att dubbelklicka på gruppnamnet och synkronisera de nyskapade grupperna genom att markera den synkroniserade funktionen. Dra varje FCS-fil till motsvarande grupp och skapa sedan en gating-strategi som börjar med a-LN-gruppen. Öppna diagramfönstret genom att dubbelklicka på det helt färgade provet för att visa de ofärgade händelser som förvärvats för provet i ett punktdiagram.Observera att x- och y-axeln är märkta som i FCS-filerna, vilket anges i tabell två av flödescytometerinställningsfilen för detta manuskript. Kontrollera att ett tillräckligt antal händelser visas för lämplig visualisering. Öppna vid behov inställningar genom att klicka på hjärtikonen i menyfliksområdet, välj Diagram och sedan Punktdiagram"som diagramtyp och kontrollera att antalet punkter som ritas i motsvarande ruta är korrekt eller ändra det.Visa de oanerade händelserna i diagramfönstret i ett punktdiagram med DNA-A på x-axeln och DNA-W på y-axeln. Använd linjär skala för båda axlarna. Ändra vid behov skala från logaritmisk till linjär genom att klicka på rutan som anges med ett T nära varje axel i diagramfönstret.Markera en enskild cellpopulation genom att klicka på rektangeln i avsnittet gatingverktyg och dubbelklicka sedan i mitten av den rektangulära porten för att visa enstaka celler i ett punktdiagram med FSC-A-parametern på x-axeln och döda celler dör på y-axeln. Klicka på polygonen för att välja den levande cellpopulationen, som är negativa för död celldöd. Dubbelklicka i mitten av polygonporten om du vill visa cellerna i ett prickdiagram med FSC-A-parametern på x-axeln och parametern SSC-A på y-axeln.Klicka på rektangeln och skapa en avslappnad grind för att inkludera alla enskilda levande celler i diagrammet. Dubbelklicka i mitten av den avslappnade grinden för att visa cellerna i ett prickdiagram med CD3 på x-axeln och CD8 på y-axeln. Använd lämplig åtkomstskala för visualisering i diagramfönstret.Om det behövs ändrar du x- och y-skalan genom att klicka på rutan, indikerad med ett T nära varje axel, väljer Anpassa åtkomstfunktion och ändrar extra neg årtionden med baser och positiva årtionden efter behov. Markera CD3+CD8+-cellerna genom att klicka på polygon. Dubbelklicka i mitten av CD3+CD8+-porten om du vill visa cellerna i ett prickdiagram med Tetr-gag på x-axeln och Pent-gag på y-axeln.Välj de antigenspecifika CD8 T-cellerna genom att klicka på polygon. Dubbelklicka i mitten av den gag-specifika porten för att visa cellerna i ett prickdiagram med DNA-A på x-axeln och Ki67 på y-axeln. Markera cellerna i de olika cellcykelfaserna genom att klicka på Quad"i avsnittet gatingverktyg i diagramfönstret.Kopiera gating-strategin som skapats i ett exempel till motsvarande grupp för att tillämpa portarna på alla exempel i gruppen. Kopiera sedan gatingstrategier för b-mjälte- och CBM-grupperna, som beskrivs i textmanuskriptet. Kontrollera att alla portar är lämpliga för varje prov av de tre grupperna.Om det behövs, desynkronisera gruppen och ändra grindar enligt beskrivningen i manuskriptet. Visa BM-cellerna i den avslappnade porten i ett prickdiagram med DNA-A på x-axeln och Ki67 på y-axeln. Visualisera resultaten genom att klicka på Layoutredigeraren"i avsnittet menyfliksområdet på arbetsytan.Dra varje grind i gatingstrategin i exempelfönstret till layoutredigeraren och placera tomterna enligt gatingsekvensen. Om det behövs ändrar du diagramtypen genom att dubbelklicka på motsvarande diagram i layouten och välja lämplig typ i fönstret diagramdefinition. Klicka på gruppen och iterera efter funktioner i layoutbandet för att visualisera resultaten som erhållits i antigenspecifika CD8 T-celler från varje organ och jämföra olika prover.Visualisera resultat av benmärgsceller som representerar en positiv kontroll. Ett typiskt exempel på cellcykelanalys av benmärgsceller visas här. Protokollet gav en låg variationskoefficient av G0 till G1 och G2 till M DNA toppar, vilket indikerar utmärkt kvalitet på DNA färgning.En fem steg gating strategi användes för att identifiera antigen specifika CD8 celler. Två multimers användes för att förbättra känsligheten hos gag-specifika CD8 T cell upptäckt i vaccinerade möss utan att öka färgning bakgrund i obehandlade möss. Gag-specifika CD8 T celler i dränerande lymfkörtlar och i mjälten innehåller en hög andel celler i S-G2/M faser vid dag tre post boost.Dessutom hade gag-specifika CD8 T celler i S-G2/M faser hög FSC-A och SSC-A när de överlagras på de totala CD8 T celler från samma organ. Offset histogram visade att CD62L uttryck av gag-specifika CD8 T celler var låg, som förväntat för aktiverade T-celler, med undantag för några celler i G0 i lymfkörtlarna. Denna metod är utformad för T-celler för att uppnå en utmärkt kvalitet på DNA-färgning tillsammans med membranet och Ki67-färgning.Flödescytometridataanalys är en nyckelpunkt. Se till att använda lämplig kontroll för gatepositionering. Med denna metod upptäckte vi T-celler i S-G2/M faser av cellcykeln i mus och humant perifert blod.Denna teknik var användbar i immun-övervakning studier i typ 1 diabetes, infektiös mononukleos och COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Hel-djur Imaging och Flödescytometrisk Tekniker för analys av antigen-specifika CD8 + T-cellssvar efter Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detection och anrikning av sällsynta antigenspecifika B-celler för analys av Fenotyp och funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer färgning och kvantitativ analys att bestämma plats, överflöd och fenotyp av Antigen-specifika CD8 T-celler i vävnader

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering av Mus Njure-Resident CD8+ T-celler för Flow cytometri Analys

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...