Name: a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

Bu çalışma Reithera, MIUR proje 2017K55HLC_006 ve Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) tarafından 5 × 1000 hibe ile desteklendi. Nih Tetramer Tesisi aracılığıyla aşağıdaki tetramer elde edildi: APC-konjuge H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol>
	<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li><li>Baj&#233;noff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highways,+byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li><li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8+response+on+autopilot.">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li><li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation.">Na&#239;ve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer:+making+sense+of+T-cell+memory.">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li><li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow.">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow:+survival+or+homeostatic+proliferation.">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+niches+in+the+bone+marrow:+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory.">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li><li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary:+Memory+CD8(+)+T+cells+colocalize+with+IL-7(+)+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription.">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102 (2016).</li><li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination.">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735 (2019).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li><li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li><li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species.">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use.">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li><li>. Mouse phenotype Available from: <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020)</li><li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+time+of+CD8++T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus.">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423 (2010).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot.">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425 (2013).</li></ol>

A. Folgori ve S. Capone Reithera Srl. A. Lefkoşa'nın çalışanlarıdır ve WO 2005071093 (A3) "Şempanze adenovirüs aşı taşıyıcıları" patent başvurusunda mucit olarak adlandırılmıştır. Diğer yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

T hücre klonal genişlemesi yoğun bir şekilde çalışılmış olsa da, bazı yönler bilinmemektedir, çünkü araştırma için mevcut araçlar azdır ve kendi dezavantajları vardır. Bu açıdan bakıldığında, bir fare modelinde aşılamadan sonra erken zamanlarda antijene özgü CD8 T hücrelerinin hücre döngüsünü analiz etmek için son derece hassas bir akış sitometrik yöntemi kurduk. Protokol, daha önce farelerde BM hematopoetik hücrelerinin hücre döngüsünü analiz etmek için kullanılan Ki67 ve DNA boyama kombinasyonuna dayanmaktadır13,14. Protokolü antijene özgü CD8 T hücrelerine uyarlamak için, DNA boyasının seçimi, farklı örnekler arasında karşılaştırılabilir DNA boyama elde etmek için uygun koşullar ve veri analizi için gating stratejisi de dahil olmak üzere birkaç kritik konuyu göz önünde bulundurmamız gerekiyordu.
Propidium İyodür ve 7-aminoaktinomisin D dahil olmak üzere DNA boyama için birçok boya mevcuttur; Membran lekelenmesi ve Ki67 boyama için gerekli olan hafif fiksasyon / permeabilizasyon protokolü ile uyumlu olduğu için Hoechst'i seçtik. Aynı zamanda, Hoechst ile lekeleme, mükemmel kalitede bir DNA histogramı elde etmemizi sağladı, yani G0/ G1 ve G2/ M DNA zirveleri, genellikle diğer DNA boyalarıyla elde edilen DNA tepelerinden çok daha düşük bir varyasyon katsayısına (CV) sahipti, örneğin DRAQ519. Gerçekten de, Hoechst canlı hücrelerde bile DNA lekeleyebilir20.
Aynı deneyin farklı örneklerinde Hoechst yoğunluğundaki dalgalanmayı önlemek için bazı stratejiler kullanılmıştır. Hoechst lekeleme, zaman içinde boya yoğunluğunun azalmasını en aza indirmek için akış sitometresinde numune alımından hemen önce gerçekleştirildi. Protokolü çok sayıda örnekle yapılan büyük deneylerde yeniden üretmek isteyenler için hoechst boyamayı aynı anda birkaç örnek üzerinde yapmanızı öneririz. Diğer bir dezavantajı, Hoechst yoğunluğunun boya ile inkübasyon sırasında hücre sayısından yoğun bir şekilde etkilenebilmesidir. Bu nedenle, DNA boyama için her zaman aynı sayıda hücre ve örnek başına aynı hacim kullanılmasını şiddetle öneririz. Akış sitometresinde elde etmek için yüksek sayıda hücre gerekiyorsa, iki veya daha fazla özdeş numune hazırlamanızı ve ardından Hoechst boyama adımından hemen önce birleştirmenizi öneririz.
Protokolün önemli bir noktası, veri analizi için gating stratejisidir. Yakın zamanda bağışıklık yanıtının erken zamanlarında T hücre analizi için yeni bir strateji yayınladık, bu da antijene özgü T hücrelerinin tespit hassasiyetini artırmamızı sağladı12. Bu stratejiyi burada gösterilen verilere aşağıdaki gibi uyguladık. İlk olarak, DNA-A/W çiziminde hücre agregalarını hariç tutmuşuz. İkincisi, ölü hücrelerin gating sonra, FSC / SSC arsa oldukça büyük bir lenfosit kapısı kullandık ("rahat kapı"). Bu strateji ile, S-G2/ M'de genellikle mevcut gating stratejileri tarafından kaçırılan yüksek aktif antijene özgü CD8 T hücrelerini dahil edebildik, çünkü bu hücreler yüksek FSC-A ve SSC-A'ya sahip. Özetle, veri analizi, aktif /çoğalan antijene özgü T hücrelerinin hassas bir şekilde algılanmasını sağlamak için gerekli olan yöntemin kritik bir bölümünü temsil eder.
Yöntem, immün yanıtın erken aşamalarında kritik T hücre verilerinin eksik olma olasılığını önler ve T hücre immün izleme için yeni bakış açıları açar. Gelecekteki bir gelişme, G2 ve M21arasında farklılaşmaya izin verecek fosfo-histon 3 için boyama içerebilir. Mevcut bir sınırlama, hücrelerin nükleer işaretleyici Ki67 için lekelenmek için sabit ve geçirgen olması gerektiğidir. Bu nedenle, hücreler sıralama ve sonraki fonksiyonel analiz gibi diğer analiz türleri için kullanılamaz. Ayrıca, Hoechst de dahil olmak üzere DNA boyaları genellikle genomik DNA analizine müdahale eder ve bu tür değerlendirmeler için uygun değildir. Farklı hücre döngüsü evreleriyle ilişkili ve canlı hücrelerde lekelenebilen membran belirteçlerinin tanımlanması bu sınırlamanın üstesinden gelebilir. Sonuç olarak, yöntem aşı, enfeksiyon, immün aracılı hastalıklar ve immün tedavi gibi çeşitli bağlamlarda aktive /çoğalan T hücrelerinin değerlendirilmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome &#8220;Sapienza&#8221;, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naif T hücreleri antijen astarlama üzerine klonal genişleme ve farklılaşmaya uğrar. Farklılaştırılmış T hücreleri, antijen boşluğu ve uzun süreli koruma için anahtar olan antijene özgü belleğin bakımı için gerekli olan efektör işlevlerini görüntüler. Birincil yanıtın ilk adımları sırasında, lenfoid organlarda özel nişler içinde antijen sunan hücrelerle (APC' ler) naif T hücre etkileşimi, klonal genişlemefazı 1,2,3'ü karakterize eden büyük T hücre çoğalmasını teşvik etmek için kritik öneme sahiptir. T hücre-APC etkileşimi, T hücre klonal soyunun miktarını ve kalitesini etkileyen antijen, ko-uyarıcı sinyaller ve çözünür faktörlerin (sitokinler ve kemokinler) konsantrasyonu ve kalıcılığı ile ince bir şekilde düzenlenir4,5,6,7.
T hücre klonal genişlemesinin yoğun çalışmalarına rağmen, antijen astarlı T hücrelerinin tüm hücre döngülerini antijen tanıma alanında tamamlayıp tamamlamadıkları veya hücre döngüsü ilerlemesi sırasında diğer organlara göç edip etmedikleri hala bilinmemektedir. Bu bilgi eksikliği, hücre döngüsü analizi için mevcut araçların özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Bunlar arasında nükleer işaretleyiciye özgü monoklonal antikorlar (mAbs), Ki67 ve hücre döngüsünün S fazını geçiren hücreleri tanımlayan hücre boyaları (örneğin, Bromodeoxyuridine (BrdU)) veya kız hücreleri ve ataları (örneğin, karboksifluorescein succinimidyl ester (CFSE)) arasında ayrım yapmak sayabilirsiniz.
Bununla birlikte, CFSE ve BrdU gibi hücre etiketleme boyaları, belirli bir organda bulunan hücrelerin yerel olarak çoğalıp çoğalmadığı veya bölüm8,9'dansonra bu bölgeye geçirilip geçirilmediği konusunda tespite izin vermez. Ayrıca, intranükleer protein, Ki67, sadece G0'daki hücreleri (Ki67 negatif hücreler) diğer hücre döngüsü fazlarındakilerden (Ki67-pozitif hücreler) ayırt edebilir. Bu nedenle, Ki67 analizi aktif çoğalmadaki hücreleri (yani S, G2veya M'de) G1'dekilerden ayırt etmez , bu da hızla bölünmeye ilerleyebilir veya G1'de uzun süre kalabilir veya sessize alma10,11'e geri dönebilir.
Burada, aşılanmış farelerin dalak ve lenf düğümlerinden (LN) antijene özgü CD8 T hücrelerinin12 hücrelerinin hücre döngüsü analizi için yeni bir akış sitometrik yöntemi açıklıyoruz (Şekil 1). Yöntem, daha önce fare kemik iliği (BM) hematopoetik hücrelerinin hücre döngüsünü analiz etmek için kullanılan Ki67 ve DNA boyama kombinasyonundan yararlanır13,14. Burada, cd8 T hücre klonal genişlemesi analizine son yayınlanan yenilikçi gating stratejisi12ile birlikte Ki67 artı DNA boyamayı başarıyla uyguladık. G0,G1'deantijene özgü CD8 T hücreleri ile dalaktaki S-G 2 /M evrelerinde ve aşılanmış farelerin LN'lerini boşaltmada açıkça ayrım yapabildik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1-200 &#956;L universal fit bulk packed pipet tips</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >CLS4866-1000EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.4G2 anti-Fc&#947;R mAb&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >553141</td>
			<td>10 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml syringe plunger</td>
			<td>BD Emerald&#160;</td>
			<td >307733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml conical tubes</td>
			<td >MercK Millipore&#160;</td>
			<td >SBHA025SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well Clear Round Bottom TC-treated Culture Microplate</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rat/Hamster Ig,k/Negative Control Compensation Particles</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta-mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BUV805 Rat Anti-Mouse CD8a&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td>564920</td>
			<td>4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium&#160;</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB4004L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >34852-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt solution (EDTA)&#160;</td>
			<td >Sigma&#160;</td>
			<td >E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-079-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filcon, Sterile, Syringe-Type 70 &#956;m</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >65-0865-14</td>
			<td>1:1000 final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-5523-00</td>
			<td>This Set contains fixation/permeabilization concentrate and diluent, and permeabilization buffer 10x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-labelled tetramer</td>
			<td >provided by NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td ></td>
			<td>6 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) labelled pentamer</td>
			<td >Proimmune&#160;</td>
			<td >F176-2A-E - 176</td>
			<td>10 &#956;L / sample&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >11-5698-82</td>
			<td>5 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 100X (200 mM)</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3000D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millex-HA Filters 0,45 &#181;m</td>
			<td>BD</td>
			<td >340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB3001D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td >Biolegend&#160;</td>
			<td >104418</td>
			<td>0.2 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PerCP-Cy&#8482;5.5 Hamster Anti-Mouse CD3e&#160;</td>
			<td >BD- Bioscience</td>
			<td >551163</td>
			<td>4.4 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td >Falcon&#160;</td>
			<td >352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Medium without L-Glutamine with Phenol Red</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECB9006L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software package for analyzing flow cytometry data</td>
			<td >FlowJo</td>
			<td>v.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software for acquisition of samples at flowcytometer</td>
			<td >BD FACSDiva&#160;</td>
			<td>v 6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue Solution</td>
			<td >Euroclone</td>
			<td >ECM0990D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a dna/ki67-based flow cytometry assay for cell cycle analysis of antigen-specific cd8 t cells in vaccinated mice

Vivo antijene özgü T hücrelerinin hücre döngüsü, hepsi bazı sınırlamalara sahip olan birkaç yöntem kullanılarak incelenmiştir. Bromodeoxyuridine (BrdU), S fazında veya yakın zamanda tamamlanan hücreleri işaretler ve karboksifluorescein succinimidyl ester (CFSE) bölünmeden sonra kız hücrelerini algılar. Bununla birlikte, bu boyalar analiz sırasında hücre döngüsü fazının tanımlanmasına izin vermez. Alternatif bir yaklaşım, hücre döngüsünün tüm aşamalarında hücreler tarafından yüksek oranda ifade edilen bir işaretleyici olan Ki67'denyararlanmaktır. Ne yazık ki, Ki67 daha fazla farklılaşmaya izin vermez, çünkü S fazında mitoz için taahhüt edilen hücreleri G1'dekilerden ayırmaz bu aşamada kalabilir, bisiklete binin veya G0'a geçin .
Burada, fare ikincil lenfoid organlarda farklı hücre döngüsü aşamalarında T hücrelerinin "anlık görüntüsünü" yakalamak için bir akış sitometrik yöntemini açıklıyoruz. Yöntem, Ki67 ve DNA boyamayı büyük histocompatibility complex (MHC)-peptit-multimer boyama ve yenilikçi bir gating stratejisi ile birleştirir, G0'dakiantijene özgü CD8 T hücreleri ile dalaktaki hücre döngüsünün S-G2 /M fazlarında başarılı bir şekilde ayırt etmemizi ve insan immün yetmezlik virüsünün (HIV)-1 model antijen gagını taşıyan viral vektörlerle aşılamadan sonra farelerin lenf düğümlerini boşaltmamızı sağlar.
Yöntemin kritik adımları, DNA boyasının seçimi ve test duyarlılığını artırmak ve mevcut analiz kriterleri tarafından kaçırılacak yüksek oranda aktive/çoğalan antijene özgü T hücrelerini dahil etmek için gating stratejisiydi. Hoechst 33342 DNA boyası, membran ve hücre içi lekelenmeyi korurken G0/G1 ve G2/M DNA zirvelerinde yüksek kaliteli bir ayrımcılık elde etmemizi sağladı. Yöntem, in vivo T hücre yanıtı hakkında bilgiyi artırmak ve immün izleme analizini geliştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir.

Balb/c farelerinin dalak, LN ve BM hücre döngüsü aşamaları, Şekil 1'de özetlenen protokole göre floresan DNA boyası, Hoechst ve bir Anti-Ki67 mAb kullanılarak analiz edilmiştir. Bu boyama, hücre döngüsünün aşağıdaki aşamalarında hücrelerin farklılaşmasına izin verdi: G0 (Ki67neg, DNAlow olarak tanımlanan 2N DNA ile), G1 (Ki67pos, DNAlow) ve S-G2/M (Ki67pos, 2N ile 4N arasında bir DNA içeriğine sahip veya DNAintermediate/high olarak tanımlanan 4N DNA'ya eşit).
Daha önce yayınlanan sonuçlar13,14'ü çoğaltmak için önce BM hücrelerinin hücre döngüsü analizini yaptık ve daha sonra ilgi çekici hücreleri, yani CD8 T hücrelerini analiz ettik. Şekil 2, BM hücrelerinin hücre döngüsü analizinin tipik bir örneğini göstermektedir (Şekil 2A). Protokol, DNA boyamanın mükemmel kalitesini gösteren düşük bir G0/ G1 ve G2/ M DNA zirveleri değişim katsayısı (CV) sağladı (Şekil 2B, CV < 2.5 ile bir örnek gösterdi; CV her zaman tüm deneylerde 5 <).
Daha sonra aşılanmış farelerden antijene özgü CD8 T hücrelerine aynı protokolü uyguladık. BALB/c fareleri, Astarlama için Chad3-gag ve takviye için MVA-gag kullanılarak HIV-1'in antijen gag'ına karşı aşılandı, her ikisi de HIV-1 gag taşımak için tasarlandı. Gün (d) 3 post-boost'ta, dalaktan gag spesifik CD8 T hücrelerinin sıklığını analiz ettik ve LN'leri boşalttık. Bağışıklık yanıtının erken evresinde T hücreleri için yeni tanımlanan gating stratejisinden yararlandık, bu da geleneksel stratejinin aksine, yüksek oranda aktive edilen antijen yanıt veren CD8 T hücrelerini tespit etmek için uygundur12. Yeni stratejiyi sonraki beş adımda uyguladık. 1. adımda, DNA-A/ -W kapısı ile çiftleri veya agregaları hariç tuttuk ve 2. 3. adımda, kurallı dar lenfosit kapısı12yerine geleneksel olmayan "rahat" bir FSC-A / SSC-A kapısı (Şekil 3A) kullanarak ilgi nüfusunu belirledik. CD3+CD8+ hücrelerde (Şekil 3A'nın 4.adımı) gating yaptıktan sonra, pent-gag ve Tetr-gag (Şekil 3A'nın5. adımı) olmak üzere iki farklı MHC multimer kullanarak gag'a özgü CD8 T hücrelerini tanımladık. Tedavi edilmemiş farelerde boyama arka planını artırmadan, aşılanmış farelerde gag spesifik CD8 T hücre algılama hassasiyetini artırmak için bir yerine iki multimer kullandık(Şekil 3B ve C, adım 5). Bu nedenle, tedavi edilmemiş fareleri (LN'lerde ve dalaklarda sırasıyla% 0.00 ve% 0.00 antijene özgü CD8 T hücreleri) aşılanmış farelerden (sırasıyla LN'lerde ve dalaklarda% 0.46 ve% 0.29 antijene özgü CD8 T hücreleri, Şekil 3B ve C)başarıyla ayırt ettik.
Özellikle, protokol, LN'lerin antijene özgü CD8 T hücre kapısında ve tedavi edilmemiş farelerin dalaklarında (genellikle% 0.00 ve maksimum% 0.02) son derece düşük bir arka plana sahip olmamızı sağladı. Gag-spesifik ve gag-spesifik olmayan FSC-A / SSC-A arazilerinin karşılaştırılması, gag'a özgü hücrelerin yüksek SSC-A ve FSC-A'ya sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 3D), bu hücreleri yakalamak için "rahat" bir FSC-A / SSC-A kapısı kullanma ihtiyacını doğrulamamıştır. Daha sonra farklı hücre döngüsü aşamalarında gag spesifik CD8 T hücrelerinin yüzdelerini değerlendirdik (Şekil 4A). Dalaktaki gag spesifik CD8 T hücrelerinin ve hatta boşaltılan LN'lerdeki daha fazlasının, 3.
Ayrıca, S-G2/M fazlarındaki gag spesifik CD8 T hücrelerinin, aynı organdan toplam CD8 T hücrelerine bindirildiğinde yüksek FSC-A ve SSC-A'ya sahip olduğunu bulduk (Şekil 4B). GAG'a özgü CD8 T hücreleri tarafından CD62L ifadesi, LN'lerdeki G0'daki birkaç hücre dışında, aktif T hücreleri için beklendiği gibi düşüktü (Şekil 4C). Tamamen, bu sonuçlar "rahat" kapının (Şekil 3A, B ve C'nin 3.adımı) çoğalan antijene özgü CD8 T hücrelerinin12'siniiçermesi gerektiğini doğruladı. Protokol, analiz anında antijene özgü CD8 T hücrelerinin hücre döngüsü aşamalarının ve farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreler tarafından CD62L ekspresyonunun "anlık görüntü" değerlendirmesi için son derece değerliydi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg"> Şekil 1: Antijene özgü CD8 T hücrelerinin hücre döngüsü analizi için protokolün şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg"> Şekil 2: BM hücrelerinin hücre döngüsü analizi. Tedavi edilmeyen Balb/c farelerinden alınan BM hücreleri akış sitometrisi ile boyandı ve analiz edildi. (A) Gating stratejisi örneği. DNA-A/W grafiğindeki (solda) tek hücrelere ve daha sonra ölü hücre boyası dışlama (ortada) ile canlı hücrelere geçiş yaptık. Daha sonra tüm BM hücreleri için "rahat" bir FSC-A/SSC-A kapısı kullanıldı (sağda). (B) BM hücrelerinin hücre döngüsü analizi örneği (solda). Hücre döngüsünün aşağıdaki aşamalarında hücreleri tanımlamak için Ki67 ve DNA boyama kombinasyonu kullandık: G0 (sol alt kadran, Ki67neg-DNAlow hücreleri), G1 (sol üst kadran, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (sağ üst kadran, Ki67pos-DNAintermediate/yüksek). Ki67 mAb (ortada) ve DNA histogramının (sağda) floresan Eksi Bir (FMO) kontrolü gösterilmiştir. DNA histogramı grafiğinde, sol ve sağ kapılar sırasıyla G0/G1 ve G2/M DNA zirvesine karşılık gelir ve sayılar her tepenin değişim katsayılarını (CV) temsil eder. Diğer tüm çizimlerde, sayılar belirtilen kapılardaki hücre yüzdelerini temsil eder. Rakam, 5 üzerinden 1 temsili deney göstermektedir. Her deneyde, 3 fareden havuzlanmış BM hücrelerini analiz ettik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg"> Şekil 3: LN'lerden ve dalaklardan antijene özgü CD8 T hücrelerinin analizi. Balb/c fareleri Chad3-gag ile intramüsküler (i.m.) astarlandı ve I.m. 3. günde, LN ve dalak hücrelerinin aşılanmış ve tedavi edilmemiş kontrol farelerinden boşaltılması akış sitometrisi ile lekelendi ve analiz edildi. (A) Tek hücreleri tanımlamak için beş adımda gating stratejisinin şeması (Adım 1); canlı hücreler (Adım 2); lenfositler (Adım 3); CD8 T hücreleri (Adım 4); ve gag'a özgü hücreler (Adım 5). (B-C) Çizimlere örnek: (B) LN'lerden ve (C) tedavi edilmemiş (üstten) ve aşılanmış (altta) farelerden hücrelerin analizi. Adım 1'deki DNA-A/ -W arsasında tek bir hücre tespit ettik. Daha sonra, Adım 2'de, ölü hücre boyası dışlama ile canlı hücreler seçtik. Adım 3'te lenfositler için kanonik olmayan "rahat" bir kapı kullandık. Adım 4'te, CD8 T hücrelerini CD3 ve CD8'in çift ekspresyyleriyle tanımladık. Daha sonra, sırasıyla florokrom etiketli H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) ve H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag) bağlama kapasitelerine dayanarak, Adım 5'te gag'a özgü olmayan ve gag spesifik olmayan hücreler belirledik. (D) FSC-A/SSC-A profilleri gag-spesifik (mavi) ve yukarıda açıklandığı gibi gating sonra gag-spesifik (gri) hücreleri değil. Sayılar belirtilen kapılardaki hücre yüzdelerini temsil eder. Rakam, 5 üzerinden 1 temsili deney göstermektedir. Her deneyde, aşılanmış 3 fare ve 3 tedavi edilmemiş fareden havuzlanmış dalak ve havuza alınan LN hücrelerini analiz ettik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg"> Şekil 4: Antijene özgü CD8 T hücrelerinin hücre döngüsü analizi. Fareler Şekil 3'te olduğu gibi aşılandı ve gag'a özgü hücrelerin hücre döngüsü analizi, Şekil 3'te olduğu gibi 5 adımda gating yapıldıktan sonra, 3. (A)Aşılanmış farelerin LN'lerinden (üstte) ve dalaklardan (altta) gag spesifik CD8 T hücrelerinin hücre döngüsü analizi örneği. Hücre döngüsü aşamaları Şekil 2B'deolduğu gibi tanımlanmıştır. Paneller G0, G1ve Ki67 mAb (sağda) S-G2/M (solda) ve Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolündeki hücreleri temsil eder. Sayılar belirtilen kapılardaki hücre yüzdelerini temsil eder. (B) Aşılanmış farelerin LN'lerinden (üstte) ve dalaktan (altta) toplam CD3+CD8+ T hücrelerine (gri) üst üste bindirilmiş S-G2/ M fazlarındaki (kırmızı) gag'a özgü CD8 T hücrelerini gösteren FSC-A/SSC-A nokta çizimleri. (C) CD62L ekspresyonunu gösteren histogramları, aşılanmış farelerin G0 (yeşil), G1 (mavi) ve S-G 2 /M (kırmızı) ile LN'lerden (üst) ve dalak (altta) gag spesifik CD8 T hücreleriyle dengeleyin. y eksenleri normalleştirilmiş olay sayısını gösterir. Rakam, toplam 15 fare ile yapılan 5 bağımsız deneyden 1 temsili örnek göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tamamlayıcı Malzeme: Akış sitometresi ayarları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice at JoVE.com

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Klonal genleşme antijene özgü T hücre yanıtının önemli bir özelliğidir. Bununla birlikte, antijen yanıt veren T hücrelerinin hücre döngüsü, kısmen teknik sınırlamalar nedeniyle kötü bir şekilde araştırılmıştır. Aşılanmış farelerin dalak ve lenf düğümlerinde klonal olarak genişleyen antijene özgü CD8 T hücrelerini analiz etmek için bir akış sitometrik yöntemi açıklıyoruz.

Aşılanmış Farelerde Antijene Özgü CD8 T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için DNA/Ki67 Tabanlı Akış Sitometrisi Tahlili

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Protokolümüz, fare dalak ve lenf düğümlerinin sabit durum fenotipik enstantane sağlamaktan daha büyük T hücre tepkisinin dinamiği yansıtmak için kullanılabileceği pratik bir yaklaşım sağlar. Tekniğimiz, devam eden bir yanıtla uğraşan antijene özgü CD8 T hücrelerini hassas bir şekilde algılar. Çoğalan CD8 T hücreleri, in vivo ilaç tedavisinin veya hücre transferinin muhtemelen şaşırtıcı etkileri olmadan ölçülür.Tekniğimiz çeşitli ortamlarda bağışıklık dinamiklerinde bir pencere sağlayabilir. Örneğin, aşılama ve enfeksiyonlara, otoimmün hastalıklara ve kanser immünoterapisine yanıt olarak. 10x permeabilizasyon tamponunu damıtılmış su ile seyrelterek taze 1x permeabilizasyon yıkama tamponu hazırlayın ve agregaları ortadan kaldırmak için 0,45 mikrometre filtreden filtreleyin.Monoklonal antikor Ki67 FITC'yi, numune başına 100 mikrolitrelik son hacim için bir titrasyon deneyi ile belirlenen 1x permeabilizasyon yıkama tamponunda seyreltin. Her tüpe 1x permeabilizasyon yıkama tamponunun 3 mililitresini ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj ekleyin. Üstnatant atın.Yine, hücreleri peletmek için 1x permeabilizasyon yıkama tamponunu ve santrifüjü ekleyin. Ardından, üstnatant atın. Pelete 100 mikrolitre seyreltilmiş monoklonal antikor Ki67 FITC ekleyin, ardından girdap ve karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, hücreleri 4 mililitre 1x permeabilizasyon tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra santrifüj ve süpernatantı atın. Doğrudan akış sitometresinde elde edilecek numuneler için hücre peletine 350 mikrolitre PBS ve DNA lekesi için Hoechst ile inkübe edilecek numuneler için hücre peletine 250 mikrolitre PBS ekleyin. Hoechst ve PBS çözeltisini hazırlayın ve her numuneye ekleyin, böylece son konsantrasyon mililitre başına iki mikrogram olacaktır.Girdap ve karanlıkta 15 dakika boyunca örnekleri kuluçkaya yatır. Daha sonra, numuneleri beş dakika santrifüjleyin ve hücre peletine 350 mikrolitre PBS ekleyin. Yazılımı açın ve çalışma alanı şeridi bölümünde Grup Oluştur"u tıklatarak analiz edilecek farklı organlara karşılık gelen farklı gruplar oluşturun.Grup adına çift tıklayarak değiştirilen grup penceresini açın ve eşitlenen işleve onay işareti ekleyerek yeni oluşturulan grupları eşitleyin. Her FCS dosyasını ilgili grubuna sürükleyin, sonra a-LN grubuyla başlayan bir gating stratejisi oluşturun. Örnek için alınan ungated olayları bir nokta çiziminde görüntülemek için tam lekeli örneği çift tıklatarak grafik penceresini açın.X ve y ekseninin, bu makalenin akış sitometresi ayarları dosyasının ikinci tablosunda belirtildiği gibi FCS dosyalarında olduğu gibi etiketlendiğini unutmayın. Uygun görselleştirme için yeterli sayıda olayın görüntülendiğinden denetleyin. Gerekirse, çalışma alanı şeridindeki kalp simgesine tıklayarak tercihleri açın, Grafikler'i seçin, ardından grafik türü olarak Nokta Çizimi"ni seçin ve ilgili kutuda çizilen nokta sayısının doğru olup olmadığını denetleyin veya değiştirin.Grafik penceresindeki düzenlenmemiş olayları, x ekseninde DNA-A ve y ekseninde DNA-W bulunan bir nokta grafiğinde görüntüleyin. Her iki eksen için doğrusal ölçek kullanın. Gerekirse, grafik penceresindeki her eksene yakın bir T ile gösterilen kutuyu tıklatarak logaritmaktan doğrusala kadar ölçeği değiştirin.Gating tool bölümünde dikdörtgene tıklayarak tek bir hücre popülasyonu seçin, sonra dikdörtgen kapının ortasına çift tıklayarak x ekseninde FSC-A parametresine sahip bir nokta çiziminde tek hücreleri görüntüleyin ve ölü hücre y ekseninde kalıplanın. Ölü hücre ölümü için negatif olan canlı hücre popülasyonu seçmek için çokgene tıklayın. Hücreleri x ekseninde FSC-A parametresi ve y ekseninde SSC-A parametresi olan bir nokta çiziminde görüntülemek için çokgen kapının ortasına çift tıklatın.Dikdörtgene tıklayın ve bu grafikteki tüm tek canlı hücreleri dahil etmek için rahat bir kapı oluşturun. Hücreleri x ekseninde CD3 ve y ekseninde CD8 ile nokta çiziminde görüntülemek için rahat kapının ortasına çift tıklayın. Grafik penceresinde görselleştirme için uygun erişim ölçeğini kullanın.Gerekirse, her eksene yakın bir T ile belirtilen kutuya tıklayarak x ve y ölçeğini değiştirin, Erişim İşlevini Özelleştir'i seçin ve gerektiğinde temeller ve pozitif on yıllar ile ekstra olumsuzg on yıllarını değiştirin. Çokgeni tıklatarak CD3+CD8+hücreleri seçin. Hücreleri x ekseninde Tetr-gag ve y ekseninde Pent-gag ile nokta çiziminde görüntülemek için CD3+CD8+gate'in ortasına çift tıklayın.Çokgen üzerine tıklayarak antijene özgü CD8 T hücrelerini seçin. Hücreleri x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 bulunan bir nokta grafiğinde görüntülemek için gaga özgü kapının ortasına çift tıklayın. Grafik penceresinin gating aracı bölümünde Quad"'yı tıklatarak farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri seçin.Kapıları grubun tüm örneklerine uygulamak için tek bir örnekte oluşturulan gating stratejisini ilgili gruba kopyalayın. Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi b-dalak ve CBM grupları için gating stratejilerini kopyalayın. Tüm kapıların üç grubun her örneği için uygun olduğunu doğrulayın.Gerekirse, grubu desynchronize ve el yazmasında açıklandığı gibi kapıları değiştirin. Rahat kapının BM hücrelerini x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 ile noktasal bir çizimde görüntüleyin. Çalışma alanı şeridi bölümünde Düzen Düzenleyicisi"ne tıklayarak sonuçları görselleştirin.Örnek bölmedeki gating stratejisinin her kapısını düzen düzenleyicisine sürükleyin ve çizimleri gating sırasına göre yerleştirin. Gerekirse, düzende karşılık gelen çizimi çift tıklatıp grafik tanımı penceresinde uygun türü seçerek grafik türünü değiştirin. Gruba tıklayın ve her organdan antijene özgü CD8 T hücrelerinde elde edilen sonuçları görselleştirmek ve farklı örnekleri karşılaştırmak için düzen şeridindeki işlevlere göre yineleyin.Pozitif bir kontrolü temsil eden kemik iliği hücrelerinin sonuçlarını görselleştirin. Kemik iliği hücrelerinin hücre döngüsü analizinin tipik bir örneği burada gösterilmiştir. Protokol, DNA boyamanın mükemmel kalitesini gösteren düşük bir G0 ila G1 ve G2'den M DNA zirvelerine kadar düşük bir değişim katsayısı sağladı.Antijene özgü CD8 hücrelerini tanımlamak için beş aşamalı bir gating stratejisi kullanıldı. Tedavi edilmeyen farelerde boyama arka planını artırmadan aşılanmış farelerde gag spesifik CD8 T hücre tespitinin hassasiyetini artırmak için iki multimer kullanıldı. Drenaja bağlı lenf düğümlerindeki ve dalaktaki gag spesifik CD8 T hücreleri, üçüncü gün destek sonrası S-G2/M fazlarında yüksek oranda hücre içerir.Ayrıca, S-G2/M fazlarındaki gag spesifik CD8 T hücreleri, aynı organdan toplam CD8 T hücrelerine bindirildiğinde yüksek FSC-A ve SSC-A'ya sahipti. Ofset histogramları, lenf düğümlerindeki G0'daki birkaç hücre dışında, aktif T hücreleri için beklendiği gibi, gag spesifik CD8 T hücreleri tarafından CD62L ekspresyonun düşük olduğunu gösterdi. Bu yöntem, T hücrelerinin membran ve Ki67 boyama ile birlikte mükemmel bir DNA boyama kalitesi elde etmesi için tasarlanmıştır.Akış sitometrisi veri analizi önemli bir noktadır. Kapı konumlandırması için uygun denetimi kullandığınızdan emin olun. Bu yöntemi kullanarak fare ve insan periferik kanında hücre döngüsünün S-G2/M evrelerinde T hücreleri keşfettik.Bu teknik tip 1 diyabet, enfeksiyöz mononükleoz ve COVID-19'da immün izleme çalışmalarında yararlı oldu.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...