Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dette forskningsarbejde modtog finansiel støttefra Den Europæiske Union(trans m.m.; H2020-MSCA-765441), det tyske forskningsråd (DFG; PA1751/8-1, 10-1) og Kina stipendium rådet.

Dyreprotokoller, der er i overensstemmelse med § 4 i den tyske dyrebeskyttelseslov, er blevet revideret og godkendt af Tübingen-universitetskomiteen for dyrebeskyttelse(Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registreringsnr. AK02/19M). I denne undersøgelse blev nethinder opnået fra vilde (WT) og rd1 mus, sidstnævnte er en godt karakteriseret model for arvelig retinale degeneration15. Mus blev opstaldet under standard hvid cyklisk belysning, havde fri adgang til mad og vand og blev brugt uanset køn.
1. Tjekliste
<ol><li>For at sikre sterile forhold og undgå kontaminering, rengøre og desinficere laminar luftstrømshætten med 70% ethanol. Sørg for at lade ethanolen fordampe helt for at forhindre forgiftning af nethindekulturerne.</li>
	<li>Autoklaveværktøj (f.eks. saks, tang og oftalmisk mikroskopskrabningsske) før brug.</li>
	<li>Forbered følgende medier på forhånd under en laminar-flow hætte, under sterile forhold: Basal R16 medium (BM) (kan opbevares ved 4 °C i 4 uger), BM med 20% føtal kalv serum (FCS) (samme dag brug), BM med 4 uger), BM med 20% føtal kalv serum (FCS) (samme dag brug), BM med 4 uger 0,12% proteinase K (44 mAnson U/mg) opløsning (samme dagbrug) og komplet R16 medium med kosttilskud (CM) som beskrevet i Romijn16 (kan opbevares ved 4 °C i 3 uger) (se tabel S1, S2 og S3).</li>
	<li>Forvarm proteinase K-opløsningen ved 37 °C for at aktivere den og bruge den i trin 2.5.</li>
</ol>2. Forberedelse
<ol><li>Offer rd1/ WT dyr på postnatal dag (P) 5 ved halshugning. For dyr, der er ældre end P11, skal du bruge CO2 og/eller cervikal dislokation i henhold til de lokale dyrebeskyttelsesbestemmelser.</li>
	<li>Afhængigt af dyrets alder åbner øjenlågene om nødvendigt øjenlågene ved hjælp af pincet og adskiller meget omhyggeligt øjenlågene uden at røre eller ridse øjet nedenfor.</li>
	<li>Hurtigt belyse øjnene under et stereoskop ved hjælp af buede pincet.</li>
	<li>Inkuber øjnene i BM i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Inkuber øjnene i forvarmet BM med 0,12% proteinase K ved 37 °C i 15 min.</li>
	<li>Udfør følgende trin i en laminar luftstrømshætte for at sikre sterile forhold. For at inaktivere proteinase K overføres øjnene til BM, der indeholder 20% FCS, og inkuberes i 5 minutter ved RT.</li>
	<li>Disseker øjnene under et stereoskop, aseptisk, i en petriskål indeholdende frisk BM på RT. Start dissektionen så hurtigt som muligt efter enucleationen. Jo længere denne gang er, jo sværere er det at dissekere nethinden, øjnene bliver meget bløde.<ol>
<li>Med pincet, hold øjet fra synsnerven. Brug fin saks, lav et lille snit i hornhinden, der skaber 2 kanter, hvorfra hornhinden, choroiden og scleraen forsigtigt kan skrælles ved hjælp af 2 par fine pincet(Figur 1 trin A-C). Alternativt kan du bruge en smalsporet kanyle til at lave et første snit i hornhinden og derefter indsætte en af saksbladene i åbningen.</li>
		<li>Tag fat i linsen med fine pincet. Placer et andet par pincet vinkelret på de første, så de første pincet er mellem de 2 shanks af den anden. Træk for at udtrække linsen fra øjenkoppen. Hvis glasagtige og ciliary kroppen stadig er fastgjort til nethinden, fjern dem forsigtigt(Figur 1 trin D). BEMÆRK: Trin 2.7.1 og 2.7.2 har brug for øvelse og sørg for forsigtighed for ikke at beskadige nethinden.</li>
		<li>Skær nethinden vinkelret på kanterne i fire punkter, hvilket skaber en firkløverform(Figur 1 trin E-F).</li>
		<li>Brug en pipette med bredt skåret base af en 1 mL spids, hold nethinden i en hængende dråbe medium og overfør den til en kultur parabol filter indsætte placeret i en 6-brønd kultur plade. RPE-laget skal vende mod membranen(Figur 1 trin G).</li>
		<li>Ved hjælp af en pipette skal du forsigtigt fjerne det overskydende medium fra indsatsen.</li>
		<li>Fra siderne af brønden tilsættes 1 mL CM pr. brønd og inkuberes i en steril inkubator ved 37 °C med 5% CO2. Må ikke nedsænke nethinden i mediet, da dette vil reducere iltning og forårsage væv degeneration. Explanten skal forblive på grænsefladen mellem væske og luft, der kun er dækket af en tynd film af væske skabt af vandets overfladespænding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lad nethinde explant uforstyrret for de første 48 timer for at lette inddrivelsen efter explantation procedure.</li>
	<li>Skift mediet hver anden dag (48 timer). 700 μL medium kasseres fra hver brønd, og der tilsættes 900 μL frisk CM til brønden. På denne måde genvindes mængden af medium tabt ved fordampning, og nethinde explant holder nogle af de neurobeskyttende faktorer, der er produceret i de foregående 48 timer.</li>
	<li>Inkuber det fjernede medium i et separat og lukket mikrocentrifugerør sammen med kulturerne for at kontrollere og evaluere mulig forurening (dvs. ændring i mediumets farve). BEMÆRK: Nethinde explants kan opbevares i kultur i mindst 2 uger12.</li>
</ol>3. Efter dyrkning
BEMÆRK: Explants kan bruges til forskellige eksperimentelle anvendelser (vestlige blot, histologi, hele mounts, genetisk analyse, elektrofysiologi). Afhængigt af applikationen kan organotypiske nethinde explants snap fryses, lyses eller forberedes til cryosectioning. Nedenstående trin beskriver histologiske forberedelser.
<ol><li>Der udføres en 45-minutters fiksering med 4% paraformaldehyd (PFA), efterfulgt af gradvis saccharose kryoprotektion (10% saccharose i 10 min., 20% i 20 min. og 30% i 2 timer ved stuetemperatur (RT) eller natten over (ON) ved 4 °C). Tilføj disse buffere direkte i brønden.</li>
	<li>Skær membranen omkring nethinde explants.</li>
	<li>Integrer både membranen og nethindevævet i mediet til frosset væv.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figur 1:Trinvis procedure for forberedelse af organotypiske nethinde explantkulturer. (A) Museøjnene inducles og overføres til en opløsning af proteinase K for at muliggøre adskillelse af sclera og choroid fra nethinden og RPE. Et lille snit i sclera / choroid lag introduceres. (B) Der anvendes to tang til at skrælle sclera/choroidlaget. (C) Det sorte choroidlag kan ses under peeling. Det understregning mørke nethinde pigment epitel (RPE) forbliver knyttet til øjeæblet. Sclera og choroid fjernes sammen med synsnerven. (D) Linsen og glasagtige ekstraheres med pincet.  Resterende ciliary krop fjernes. (E) Nethinden bevarer en skål-lignende form. (F)For at flade nethinden til dyrkning i en skål, 4 nedskæringer i lige stor afstand omkring nethinden er lavet med en saks, hvilket giver det en kløver-lignende form. Nethinden kultur overføres til en membran kultur indsætte i en 6-brønds plade med brug af en skåret 1 mL pipette spids. Nethinden stadig bevarer nogle af skålen-form. Men ved fjernelse af den overskydende væske omkring nethinden, vil det udfolde sig til en planar struktur. (G) I dyrkningsmembranopsætningen hviler nethinden på en porøs polycarbonatmembran oven på en opløsning af komplet R16-medium. For at sikre levedygtigheden skal kulturen opbevares i en befugtet steril inkubator ved 37 °C med 5% CO2, og mediet skal udskiftes hver 48. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">her for at se en større version af dette tal</a>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den fremlagte protokol beskriver organotypiske explant kulturer mus nethinden med intakt RPE i defineret R16 medium, fri for serum og antibiotika. Denne protokol blev oprindeligt udviklet fra slutningen af 1980'erne7,28 og siden da er den løbende blevet raffineret6,11,12. Bemærkelsesværdige anvendelser omfatter undersøgelser af mekanismerne for arvelig retinale degeneration og identifikation af retinobeskyttende lægemidler23,29,30.
For et vellykket eksperiment skal der tages hensyn til nogle vigtige overvejelser. Her er nogle vigtige fejlfindingspunkter, der kan hjælpe med at forbedre kvaliteten af kulturer. For det første kan nethindekulturerne udvise overdreven foldning og/eller rosetdannelse31. Dette kan skyldes at røre nethinden med en pincet under explantationsproceduren. Desuden skal ciliary kroppen fjernes helt fra explant, da dette kan øge nethindefoldning under kulturen. For det andet, under overførslen af nethinden til brøndpladen i en hængende dråbe, hvis nethinden vender membranen den forkerte side ned, skal du holde den i dråben hængende fra pipettespidsen og meget forsigtigt skubbe mediet ind og ud af spidsen (uden at løsne den hængende dråbe) for at vende nethinden rundt. Endelig, hvis RPE forbliver knyttet til sclera og løsner sig fra nethinden, er det sandsynligvis forårsaget af en utilstrækkelig forindning af sclera. Dette problem kan være særlig vigtigt, når man arbejder med øjne fra ældre dyr eller ikke-gnaverarter (f.eks. svin) og kan løses ved at øge proteinase K-koncentrationen.
Gennemførelse af organotypiske nethinde explant kulturer er en kompleks procedure, der kræver tilstrækkelig uddannelse og erfaring. Manglende uddannelse kan føre til variation i kvaliteten af nethinde explants. Af disse grunde er det vigtigt at overvåge og kontrollere levedygtighed og reproducerbarhed, der for eksempel karakteriserer celledødshastigheden med TUNEL-analysen. Brugen af et antibiotisk-fri medium gør nethinde explants sårbare over for forurening af bakterier og svampe. For at minimere denne risiko anbefaler vi, at der udvises særlig omhu for at arbejde under virkelig aseptiske forhold. En anden begrænsning af in vitro retinale dyrkning er forskelle i fysiokemiske miljø sammenlignet med in vivo nethinden (f.eks choroidal og nethinde blodforsyning, ilt og glukose niveauer, intraokulært tryk, sammensætning af glasagtige). Et kontinuerligt perfusionssystem, måske indlejret i en dedikeret bioreaktor32, kunne gøre denne model tættere på in vivo-tilstanden. Desuden vil axotomi af synsnerven under nethindedissektion føre til ganglion celledød, der kan fremkalde stressrespons8. Det anbefales derfor, at explanten overlades til at tilpasse sig dyrkningsbetingelserne i mindst 2 dage in vitro, før den udsættes for en bestemt manipulation eller behandling.
Den beskrevne metode udføres normalt på umodne nethindevæv, som kan overleve godt i 4 uger in vitro7,33. Proceduren kan dog skræddersys til en række applikationer, herunder dyrkning af voksen nethinden. Selv om forskellige offentliggjorte metoder beskriver isoleringen af den voksne nethinde uden sin RPE34,35, gør inkubationen med papainopløsning i op til 1 time ved 37 °C før dissektion det muligt for RPE at forblive fastgjort til nethinden, selv når den stammer fra en voksen mus36.
Det serumfrie medium og det kemisk definerede in vitro-miljø giver mulighed for en helt defineret og reproducerbar manipulation af forsøgsbetingelserne. Derfor er organotypiske nethinde explant kulturer værdifulde værktøjer inden for oftalmologi og neurovidenskab, og er blevet brugt til at studere nethindesygdomme37, nethinden udvikling38,39, nethinde stamcelleterapi40, genetiske modifikationer41, og farmakologisk screening. Som et specifikt eksempel på lægemiddeltest brugte vi her nethindeeksulære explantkulturer til at teste en cGMP analog (CN003), kendt for at reducere fotoreceptorcelledød i dyremodeller for arvelig nethindesygdom23 (Figur 3B). En anden mulig anvendelse af teknikken er beskrevet i figur 3C, som illustrerer , hvordan den præcise kontrol af vævsmiljøet kan udnyttes til at efterligne diabetiske tilstande24. På grund af bevarelsen af vævsarkitekturen i hele dyrkningsperioden er organotypiske nethinde explantkulturer også velegnede til elektrofysiologiske undersøgelser. Neuronal funktionalitet på nethinde explants er blevet undersøgt ved hjælp af patch-clamp optagelse42 og multi-elektrode-array (MEA) optagelse33,43. Sidstnævnte gør det muligt at registrere elektrisk aktivitet af neuronale populationer på samme tid og er blevet udnyttet til at karakterisere fotoreceptor og ganglion cellefunktionalitet under kulturforhold. I et bredere perspektiv kan de organotypiske explantkultursystemer også anvendes i præklinisk forskning, hvor explantkulturer blev brugt til at teste hypotermiens terapeutiske effekt44.
Den organotypiske eksplantkulationsteknik er relativt enkel at udføre og sammenlignes med tilsvarende in vivo-forsøg billigere og tidskrævende og undgår de etiske bekymringer i forbindelse med levende dyreforsøg. Den præcise kontrol over eksperimentelle tilstande og bevarelsen af RPE og vævskompleksitet gør metoden til et værdifuldt værktøj til at forbedre vores viden om nethindefysiologi og patofysiologi og muliggøre adskillige eksperimentelle applikationer.

I oftalmisk forskning er der en række modeller til rådighed til at studere nethinden, herunder primære nethindecellekulturer, nethinde-afledte cellelinjer, nethindeorganoider og in vivo dyremodeller1,2,3,4,5. Hver af disse modeller lider dog af ulemper. For eksempel vokser celler isoleret, mens nethinden er et komplekst netværk med et væld af celle-til-celle-interaktioner. Således vil adfærden af isolerede cellekulturer sandsynligvis være kunstig sammenlignet med den, der observeres i et helt væv. Dette problem kan til dels afhjælpes ved hjælp af in vitro differentierede nethindeorganoider, som kan bruges til at studere udvikling og grundlæggende biologi6. Men fra i dag, nethinde organoid generation stadig er tidskrævende, arbejdskrævende, og lider af reproducerbarhed spørgsmål, der kræver betydelige yderligere udviklingsarbejde, før organoider kan bruges til translationel nethinde forskning. Endelig er undersøgelser af levende dyr, selv om de velsagtens er den model, der kommer tættest på kravene til oftalmisk forskning, forbundet med stærke etiske bekymringer. Et godt kompromis mellem effektiviteten af cellekultursystemer og den virkelige situation med in vivo dyremodeller er organotypiske nethinde explant kulturer. Sådanne kulturer reducerer også dyrenes lidelser, da der ikke udføres in vivo-interventioner.
Flere metoder er blevet beskrevet til dyrkning af nethinde explants fra forskellige arter5,7,8. Vores protokol beskriver en teknik til isolering af musen neuroretina sammen med sin nethinde pigment epitel (RPE). Denne teknik vil også være egnet til rotte nethindekulturer9. Kulturen i neuroretina sammen med sin RPE er af stor betydning for succes. RPE udfører væsentlige funktioner til nethinden: transport af næringsstoffer, ioner, vand, absorption af lys og beskyttelse mod fotooxidation, re-isomerisering af alt-trans-nethinde til 11-cis-retinal, hvilket er afgørende for den visuelle cyklus, fagagocytose af kaste fotoreceptormembraner og udskillelse af væsentlige faktorer for nethindens strukturelle integritet10. Vedligeholdelse af RPE giver mulighed for en vellykket udvikling af fotoreceptor ydre og indre segmenter, holde nethinden levedygtig i længere tid11. Den nedenfor beskrevne procedure bevarer nethindens histotypiske og fysiologiske egenskaber i mindst to uger12. Desuden undgår dyrkning af de organotypiske nethinde explants i serumfri, antibiotikafri medium tilstedeværelsen af ukendte stoffer og muliggør en enkel fortolkning af resultaterne12.
Organotypiske nethinde explant kulturer har været afgørende for at forbedre vores viden om nethindeudvikling og degeneration7,13,14. Vi viser her, at de også er et nyttigt redskab til farmakologisk screening, og at de kan anvendes til at modellere en række nethindesygdomme, herunder diabetisk retinopati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

I oftalmisk forskning er der et stærkt behov for in vitro-modeller af neuroretinaen. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for organotypisk dyrkning af musens neuronethinde med intakt nethinde pigment epitel (RPE). Afhængigt af forskningsspørgsmålet kan nethinder isoleres fra vilde dyr eller fra sygdomsmodeller for at studere for eksempel diabetisk retinopati eller arvelig nethindedegeneration. Øjne fra tidlige postnatale dag 2-9 dyr er belyst under aseptiske forhold. De fordøjes delvist i proteinase K for at give mulighed for en løsrivelse af choroiden fra RPE. Under stereoskopet laves et lille snit i hornhinden, hvilket skaber to kanter, hvorfra choroid og sclera forsigtigt kan skrælles af fra RPE og neuroretina. Linsen fjernes derefter, og øjestykket skæres i fire punkter for at give det en fire-kilet form, der ligner et kløverblad. Vævet er endelig overført i en hængende dråbe i en celle kultur indsætte i besiddelse af en polycarbonat dyrkning membran. Kulturerne opretholdes derefter i R16 medium, uden serum eller antibiotika, under helt definerede forhold, med en medium ændring hver anden dag.
Den beskrevne procedure gør det muligt at isolere nethinden og bevare dens normale fysiologiske og histotypiske kontekst til dyrkning af perioder på mindst 2 uger. Disse funktioner gør organotypiske retinale explantkulturer til en fremragende model med høj prædiktiv værdi til undersøgelser af nethindeudvikling, sygdomsmekanismer og elektrofysiologi, samtidig med at farmakologisk screening muliggøres.

Efter at have fulgt protokollen bevarer dissekerede og kultiverede nethinde explants deres normale vævsarkitektur, med forskellige lag, fra RPE til ganglion cellelaget (GCL), som vist i figur 2. Ydre nukleare lag (ONL) og indre nukleare lag (INL) størrelse forblev for det meste stabil i 2-3 uger, med en langsomt fremad celletab og gradvis udtynding af disse lag bliver mere og mere synlige, hvis dyrkningsperioden forlænges til 4 uger og derefter. I GCL, derimod, på grund af axotomy af synsnerven, en markant udtynding er normalt observeret inden for de første 4 dage af dyrkning. Bagefter vil den resterende cellepopulation i GCL (for det meste fordrevne amacrinceller) fortsat være levedygtig i yderligere 3-4 uger17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figur 2: Celletyper fundet i nethinde explant kultur. Nethinde explant kultur på P11 stammer fra rd1 mutant (A) og WT dyr (B) viser nukleare farvning med DAPI (venstre, blå), stang fotoreceptorer (center, rød) og Müller celler (højre, grøn). Nuklear farvning fremhæver alle de store cellulære lag af nethinden, såsom nethindepigmentepitelet (RPE), ydre atomlag (ONL), indre atomlag (INL) og ganglioncellelag (GCL). Specifikke celletyper i de nukleare lag, såsom stænger og Müller celler, er immunolabeled med alfa arrestin26 og glutamin synthetase27 antistoffer, hhv. (C) Viser hele længden del af en hel   rd1 mus nethinden, med DAPI farvning fremhæve konsistens, integration og udvikling af nethinden. Disse nethinder blev dyrket i 6 dage. Procedurebeskrivelse: Nethinden og RPE afledt af rd1- eller WT-dyr blev isoleret ved P5 og dyrket som beskrevet i protokollen, indtil P11 med en medium ændring hver 48. time. Kulturer blev fastsat med 4% PFA på P11 og cryosectioned. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal</a>
Serumfrit medium og det vedvarende in vitro-miljø giver fuld kontrol over forsøgsbetingelserne. Her giver vi to eksempler til specifikke anvendelser af denne protokol. Det første eksempel illustrerer muligheden for at anvende nethinde explants til test af lægemidler eller screening formål. Organotypiske nethinde explant kulturer blev fremstillet af vilde-type (WT) og rd1 mus modeller. Sidstnævnte er en godt karakteriseret model til nethindedegeneration15. I rd1-musehinden udløses ONL-degeneration af unormalt høje niveauer af cGMP i stangfotoreceptorer6,20. Overdreven cGMP forårsager øget aktivitet af cykliske nukleotidporterede ionkanaler (CNGCs) og cGMP-afhængige proteinkinase (PKG), hvilket fører til celledød21. Behandling af rd1 muse nethinder med en strukturel analog til cGMP (cyklisk nukleotid #3; CN003), som er rettet mod både PKG og CNGC, blev testet. Efter eksplantation på P5 blev behandlingsparadigmet beskrevet i figur 3A fulgt. Explant kulturer blev fastsat med 4% PFA på P11 og forberedt til cryosectioning (Figur 3A). For at vurdere celledøden af histologiske sektioner fra behandlede, ikke-behandlede (NT) og WT-prøver blev der udført en terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay22. Analysen af TUNEL-mærkede celler viste en høj procentdel af døende celler i ONL i de ikke-bearbejdede prøver af uønsket type, mens CN003 beskyttede rd1-musefotoreceptorer, når de blev anvendt i en koncentration på 50 μM 23 ( Figur3B).
En hyppig komplikation af diabetes er diabetisk retinopati, en blændende sygdom, som er vanskelig at gengive trofast i dyremodeller5. Det andet eksempel fremhæver brugen af organotypiske retinale explant kulturer til at karakterisere nethindecelle levedygtighed under forhold efterligne type-2 diabetes mellitus (T2DM)24. Her brugte vi 20 mM af glykolysehæmmeren 2-deoxy-glukose (2-DG)25 og administrerede den til kulturmediet i 24 timer fra P10 til P11. Vi viser, at underkastelse af WT nethinde explants til sådanne in vitro simulerede diabetiske tilstande fører til omfattende neuronal celledød af nethinden (Figur 3C). Dette paradigme igen kan derefter bruges, for eksempel, at studere degenerative mekanismer eller til at teste retinobeskyttende behandlinger i en diabetes sammenhæng.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figur 3: To eksempler på anvendelse af organotypiske nethinde explantkulturer. Ved P7 og P9 blev det brugte medium kasseret, og der blev tilsat frisk CM indeholdende aktiv forbindelse i en koncentration på 50 μM til pladen. Kulturer blev fastsat med 4% PFA på P11 og cryosectioned. (B) Sammensat test på rd1 nethinden. Afsnittene er fremstillet af WT, behandlet (003) og ikke-behandlede (NT) organotypiske nethinde explantkulturer. TUNEL assay (rød) blev brugt som en markør for celledød. Nuklear farvning med DAPI (blå). Kvantificeringen i søjlediagrammet illustrerer procentdelen af døende celler i tilstanden WT, rd1 NT og rd1 003. Behandling med sammensatte 003 reduceret rd1 fotoreceptor celledød. (C) Simulering af type-2 diabetes mellitus (T2DM) på WT nethinden ved hjælp af 2-deoxy-glukose (2-DG) behandling. TUNEL assay blev udført på NT- og T2DM-prøver. Kvantificeringen indikerer en meget betydelig stigning i celledød. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal</a>
Tabel S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Klik her for at downloade tabellen</a>  
Tabel S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Klik her for at downloade tabellen</a>  
Tabel S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Klik her for at downloade tabellen</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Protokollen beskriver organotypiske explants af mus neuronethinden, dyrket sammen med sin nethinde pigment epitel (RPE), i R16 defineret medium, fri for serum og antibiotika. Denne metode er relativt enkel at udføre, billigere og tidskrævende sammenlignet med in vivo-eksperimenter og kan tilpasses til adskillige eksperimentelle applikationer.

Langsigtet, Serumfri Dyrkning af organotypiske musehindeplanter med intakt retinale pigmentepitelet

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

En poleret og forstærket tyndt befolket kranie Window for langsigtet Imaging af Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En Molekylær Udlæsning af Langsigtet olfaktorisk Adaptation in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

En Isoleret Semi-intakt Forberedelse af Mouse vestibulære Sensory epitel for Elektrofysiologi og høj opløsning To-foton mikroskopi

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsigtet Time Lapse Imaging af Mouse Cochlear Eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Langsigtet Calcium Imaging af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbal Approach-subretinal Injektion af virale vektorer til genterapi i mus retinale pigmentepitel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generering og langvarig vedligeholdelse af nervefri<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...