Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dit onderzoek kreeg financiële steun van de Europese Unie (transMed; H2020-MSCA-765441), de Duitse onderzoeksraad (DFG; PA1751/8-1, 10-1) en de China scholarship council.

Dierprotocollen die in overeenstemming zijn met §4 van de Duitse wet op de dierenbescherming werden herzien en goedgekeurd door de commissie dierenbescherming van de Universiteit van Tübingen (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registratienr. AK02/19M). In deze studie werden netvliezen verkregen van wilde (WT) en rd1 muizen, de laatste is een goed gekarakteriseerd model voor erfelijke retinale degeneratie15. Muizen werden gehuisvest onder standaard witte cyclische verlichting, hadden vrije toegang tot voedsel en water en werden gebruikt ongeacht geslacht.
1. Controlelijst
<ol><li>Om steriele omstandigheden te garanderen en verontreinigingen te voorkomen, reinigt en desinfecteert u de laminaire luchtstroomkap met 70% ethanol. Zorg ervoor dat de ethanol volledig verdampt, om intoxicatie van de netvliesculturen te voorkomen.</li>
	<li>Autoclaafgereedschappen (bijv. schaar, tang en oftalmische microscoopschraaplepel) voor gebruik.</li>
	<li>Bereid de volgende media van tevoren onder een laminaire-flow kap, onder steriele omstandigheden: Basaal R16 medium (BM) (kan worden bewaard bij 4 °C gedurende 4 weken), BM met 20% foetale kalfsserum (FCS) (dezelfde dag gebruik), BM met 0,12% proteïnase K (44 mAnson U/mg) oplossing (dezelfde dag gebruik) encompleteR16 medium met supplementen (CM) zoals beschreven door Romijn 16 </li>
	<li>Verwarm de proteinase K-oplossing voor op 37 °C om deze te activeren en gebruik deze in stap 2.5.</li>
</ol>2. Voorbereiding
<ol><li>Offer rd1/WT dier op postnatale dag (P) 5 door onthoofding. Gebruik voor dieren ouder dan P11 CO2 en/of cervicale dislocatie, volgens de lokale voorschriften voor dierenbescherming.</li>
	<li>Afhankelijk van de leeftijd van het dier, open indien nodig vóór de enucleatie de oogleden met een tang en scheid de oogleden zeer voorzichtig, zonder het oog eronder aan te raken of te krabben.</li>
	<li>Verleid de ogen snel onder een stereoscoop met behulp van gebogen tangen.</li>
	<li>Incubeer de ogen in BM gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Incubeer de ogen in voorverwarmde BM, met 0,12% proteïnase K bij 37 °C gedurende 15 min.</li>
	<li>Voer de volgende stappen uit in een laminaire luchtstroomkap om steriele omstandigheden te garanderen. Om proteïnase K te inactiveren, breng je de ogen over naar BM met 20% FCS en incubeer je gedurende 5 minuten bij RT.</li>
	<li>Ontleed de ogen onder een stereoscope, aseptisch, in een Petrischaal met verse BM bij RT. Start de dissectie zo snel mogelijk na de enucleatie. Hoe langer deze tijd is, hoe moeilijker het is om het netvlies te ontleden, de ogen worden erg zacht.<ol>
<li>Houd met een tang het oog van de oogzenuw vast. Maak met een fijne schaar een kleine incisie in het hoornvlies waardoor 2 randen ontstaan van waaruit het hoornvlies, de choroïde en de sclera voorzichtig kunnen worden geschild met 2 paar fijne tangen(figuur 1 stap A–C). U kunt ook een smalspoor canule gebruiken om een eerste incisie in het hoornvlies te maken en vervolgens een van de schaarbladen in de opening steken.</li>
		<li>Pak de lens vast met een fijne tang. Plaats een tweede paar tangen loodrecht op de eerste, zodat de eerste tang zich tussen de 2 schachten van de tweede bevindt. Trek om de lens uit de oogbeker te halen. Als het glasvocht en het ciliaire lichaam nog steeds aan het netvlies zijn bevestigd, verwijder ze dan voorzichtig(figuur 1 stap D). OPMERKING: Stap 2.7.1 en 2.7.2 moeten worden geoefend en moeten ervoor zorgen dat het netvlies niet wordt beschadigd.</li>
		<li>Snijd het netvlies loodrecht op de randen in vier punten, waardoor een klavertje vier ontstaat(figuur 1 stap E–F).</li>
		<li>Met behulp van een pipet met breed gesneden basis van een 1 ml tip, houd het netvlies in een hangende druppel medium en breng het over naar een kweekschaalfilterinzetstuk geplaatst in een 6-put kweekplaat. De RPE-laag moet naar het membraan kijken(figuur 1 stap G).</li>
		<li>Verwijder met behulp van een pipet voorzichtig het overtollige medium van het inzetstuk.</li>
		<li>Voeg vanaf de zijkanten van de put 1 ml CM per put toe en incubeer in een steriele incubator bij 37 °C met 5% CO2. Dompel het netvlies niet onder in het medium, omdat dit de oxygenatie vermindert en weefseldegeneratie veroorzaakt. De explant mag op het raakvlak tussen vloeistof en lucht blijven, alleen bedekt met een dunne film vloeistof die ontstaat door de oppervlaktespanning van water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de retinale explant de eerste 48 uur ongestoord om het herstel na de explantatieprocedure te vergemakkelijken.</li>
	<li>Verander het medium elke tweede dag (48 uur). Gooi 700 μL medium uit elke put en voeg 900 μL verse CM toe aan de put. Op deze manier wordt de hoeveelheid medium die verloren gaat door verdamping teruggewonnen en houdt de retinale explant enkele van de neuroprotectieve factoren die in de vorige 48 uur zijn geproduceerd.</li>
	<li>Incubeer het verwijderde medium in een aparte en gesloten microcentrifugebuis samen met de culturen om mogelijke verontreiniging (d.w.z. verandering in kleur van het medium) te beheersen en te evalueren. OPMERKING: Retinale explants kunnen ten minste 2 weken in cultuur worden gehouden12.</li>
</ol>3. Na het cultiveren
OPMERKING: Explants kunnen worden gebruikt voor verschillende experimentele toepassingen (western blot, histology, whole mounts, genetische analyse, elektrofysiologie). Afhankelijk van de toepassing kunnen organotypische retinale explants bevroren, gelyseerd of voorbereid zijn op cryosectioning. De onderstaande stappen beschrijven histologische voorbereiding.
<ol><li>Voer een fixatie van 45 minuten uit met 4% paraformaldehyde (PFA), gevolgd door geleidelijke sucrose cryoprotectie (10% sucrose gedurende 10 min, 20% gedurende 20 min en 30% gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) of 's nachts (ON) bij 4 °C). Voeg deze buffers direct in de put toe.</li>
	<li>Snijd het membraan rond de retinale explants.</li>
	<li>Integreer zowel het membraan als het netvliesweefsel in het medium voor bevroren weefsel.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figuur 1: Stapsgewijze procedure voor de bereiding van organotypische retinale explantculturen. (A) Muisogen worden ingekapseld en overgebracht naar een oplossing van proteïnase K om sclera en choroïde van het netvlies en RPE te scheiden. Een kleine snede in de sclera/choroïde laag wordt geïntroduceerd. (B) Twee tangen worden gebruikt om de sclera/choroïde laag te schillen. (C) De zwarte choroïde laag is te zien tijdens het schillen. Het onderstrepende donkere retinale pigmentepitheel (RPE) blijft aan de oogbol gehecht. De sclera en choroïde worden samen met de oogzenuw verwijderd. (D) De lens en het glasvocht worden geëxtraheerd met een tang.  Het resterende ciliaire lichaam wordt verwijderd. (E) Het netvlies behoudt een komachtige vorm. (F) Om het netvlies plat te maken voor het cultiveren in een schaal, worden 4 sneden op gelijke afstand rond het netvlies gemaakt met een schaar, waardoor het een klaverachtige vorm krijgt. De netvliescultuur wordt overgebracht naar een membraancultuurinzetstuk in een 6-putplaat met behulp van een gesneden pipetpunt van 1 ml. Het netvlies behoudt nog steeds een deel van de komvorm. Bij verwijdering van de overtollige vloeistof rond het netvlies zal het zich echter ontvouwen tot een planaire structuur. (G) In de kweekmembraanopstelling rust de netvliescultuur op een poreus polycarbonaat (PC) membraan bovenop een oplossing van compleet R16-medium. Om de levensvatbaarheid te garanderen, moet de cultuur worden bewaard in een bevochtigde steriele incubator bij 37 °C met 5% CO2, en het medium moet elke 48 uur worden vervangen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken</a>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het gepresenteerde protocol beschrijft organotypische explantculturen van het netvlies van muizen met intacte RPE in gedefinieerd R16-medium, vrij van serum en antibiotica. Dit protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld vanaf eind jaren tachtig7,28 en is sindsdien voortdurend verfijnd6,11,12. Opmerkelijke toepassingen zijn studies naar de mechanismen van erfelijke retinale degeneratie en de identificatie van retinoprotectieve geneesmiddelen23,29,30.
Voor een succesvol experiment moet rekening worden gehouden met enkele belangrijke overwegingen. Hier zijn enkele belangrijke probleemoplossingspunten om de kwaliteit van culturen te helpen verbeteren. Ten eerste kunnen de netvliesculturen overmatige vouw- en/of rozetvorming vertonen31. Dit kan worden veroorzaakt door het aanraken van het netvlies met een tang tijdens de explantatieprocedure. Bovendien moet het ciliaire lichaam volledig van de explant worden verwijderd, omdat dit het vouwen van het netvlies tijdens de cultuur kan vergroten. Ten tweede, tijdens de overdracht van het netvlies naar de putplaat in een hangende druppel, als het netvlies met de verkeerde kant naar beneden naar beneden kijkt, houd het dan in de druppel die aan de pipetpunt hangt en duw het medium heel voorzichtig in en uit de punt (zonder de hangende druppel los te maken) om het netvlies om te draaien. Ten slotte, als de RPE aan de sclera blijft gehecht en loskomt van het netvlies, wordt deze hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door een onvoldoende predigestie van de sclera. Dit probleem kan vooral belangrijk zijn bij het werken met ogen van oudere dieren of niet-knaagdiersoorten (bijv. varkens) en kan worden opgelost door de proteinase K-concentratie te verhogen.
Het uitvoeren van organotypische retinale explantculturen is een complexe procedure die voldoende training en ervaring vereist. Gebrek aan training kan leiden tot variabiliteit in de kwaliteit van de retinale explants. Om deze redenen is het belangrijk om de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid te controleren en te verifiëren, waarbij bijvoorbeeld het percentage celdood wordt gekenmerkt met de TUNEL-test. Het gebruik van een antibioticavrij medium maakt de retinale explants kwetsbaar voor besmetting door bacteriën en schimmels. Om dit risico te minimaliseren, raden we aan dat bijzondere zorg wordt besteed aan het werken onder echt aseptische omstandigheden. Een andere beperking van in vitro retinale cultivering zijn verschillen in fysiochemische omgeving in vergelijking met het in vivo netvlies (bijv. choroïdale en retinale bloedtoevoer, zuurstof- en glucosespiegels, intraoculaire druk, samenstelling van het glasvocht). Een continu perfusiesysteem, misschien ingebed in een speciale bioreactor32, zou dit model dichter bij de in vivo conditie kunnen brengen. Bovendien zal de axotomie van de oogzenuw tijdens netvliesdissectie leiden tot ganglionceldood, die stressreacties kan veroorzaken8. Daarom wordt aanbevolen dat de explant zich ten minste 2 dagen in vitro aan de kweekomstandigheden aanpast voordat hij aan een specifieke manipulatie of behandeling wordt onderworpen.
De beschreven methode wordt meestal uitgevoerd op onrijpe netvliesweefsels, die in vitro4 weken goed kunnen overleven7,33. De procedure is echter aanpasbaar aan een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder het cultiveren van het netvlies van volwassenen. Hoewel verschillende gepubliceerde benaderingen de isolatie van het volwassen netvlies beschrijven zonder zijn RPE34,35, kan de incubatie met papaïneoplossing tot 1 uur bij 37 °C vóór dissectie de RPE aan het netvlies blijven bevestigen , zelfs wanneer afgeleid van een volwassen muis36.
Het serumvrije medium en de chemisch gedefinieerde in vitro omgeving zorgen voor een volledig gedefinieerde en reproduceerbare manipulatie van de experimentele omstandigheden. Daarom zijn organotypische retinale explantculturen waardevolle hulpmiddelen op het gebied van oogheelkunde en neurowetenschappen, en zijn gebruikt voor het bestuderen van netvliesaandoeningen37,netvliesontwikkeling38,39, retinale stamceltherapie40, genetische modificaties41en farmacologische screening. Als een specifiek voorbeeld van geneesmiddelentests gebruikten we hier retinale explantculturen om een cGMP-analoog (CN003) te testen, waarvan bekend is dat het de dood van fotoreceptorcellen in diermodellen voor erfelijke netvliesaandoeningen vermindert23 (Figuur 3B). Een andere mogelijke toepassing van de techniek wordt beschreven in figuur 3C, die illustreert hoe de precieze controle van de weefselomgeving kan worden benut om diabetische aandoeningen na te bootsen24. Vanwege het behoud van weefselarchitectuur gedurende de gehele cultiveringsperiode zijn organotypische retinale explantculturen ook geschikt voor elektrofysiologische studies. Neuronale functionaliteit op retinale explants is onderzocht met behulp van patch-clamp recording42 en multi-electrode-array (MEA) recording33,43. Dit laatste maakt het mogelijk om tegelijkertijd de elektrische activiteit van neuronale populaties te registreren en is misbruikt om de functionaliteit van fotoreceptoren en ganglioncellen in cultuuromstandigheden te karakteriseren. In een breder perspectief kunnen de organotypische explantcultuursystemen ook worden toegepast in preklinisch onderzoek, waar explantculturen werden gebruikt om de therapeutische werkzaamheid van onderkoeling te testen44.
De organotypische explantkurentechniek is relatief eenvoudig uit te voeren en is, in vergelijking met overeenkomstige in vivo experimenten, goedkoper en tijdrovend, en vermijdt de ethische zorgen met betrekking tot levende dierstudies. De nauwkeurige controle over experimentele omstandigheden en het behoud van RPE en weefselcomplexiteit maken de methode een waardevol hulpmiddel om onze kennis over netvliesfysiologie en pathofysiologie te verbeteren en tal van experimentele toepassingen mogelijk te maken.

In oftalmisch onderzoek zijn verschillende modellen beschikbaar om het netvlies te bestuderen, waaronder primaire retinale celculturen, retina-afgeleide cellijnen, retinale organoïden en in vivo diermodellen1,2,3,4,5. Elk van deze modellen heeft echter last van nadelen. Cellen groeien bijvoorbeeld geïsoleerd terwijl het netvlies een complex netwerk is met een veelheid aan cel-tot-cel interacties. Het gedrag van geïsoleerde celculturen is dus waarschijnlijk kunstmatig in vergelijking met dat waargenomen in een heel weefsel. Dit probleem kan gedeeltelijk worden verholpen met behulp van in vitro gedifferentieerde retinale organoïden, die kunnen worden gebruikt om ontwikkeling en basisbiologie te bestuderen6. Toch is de retinale organoïdegeneratie vanaf vandaag nog steeds tijdrovend, arbeidsintensief en lijdt het aan reproduceerbaarheidsproblemen, wat aanzienlijk verder ontwikkelingswerk vereist voordat organoïden kunnen worden gebruikt voor translationeel retinaal onderzoek. Ten slotte worden studies over levende dieren, hoewel aantoonbaar het model dat het dichtst bij de vereisten van oogheelkundig onderzoek komt, geassocieerd met sterke ethische zorgen. Een goed compromis tussen de efficiëntie van celkweeksystemen en de reële situatie van in vivo diermodellen zijn organotypische retinale explantculturen. Dergelijke culturen verminderen ook het lijden van dieren, omdat er geen in vivo interventies worden uitgevoerd.
Er zijn verschillende methoden beschreven voor het cultiveren van retinale explants van verschillende soorten5,7,8. Ons protocol beschrijft een techniek voor de isolatie van de muis neuroretina samen met zijn retinale pigmentepitheel (RPE). Deze techniek zal ook geschikt zijn voor rat retinale culturen9. De cultuur van neuroretina samen met haar RPE is van groot belang voor succes. De RPE vervult essentiële functies voor het netvlies: transport van voedingsstoffen, ionen, water, absorptie van licht en bescherming tegen fotooxidatie, re-isomerisatie van all-trans-retinal in 11-cis-retinal, wat cruciaal is voor de visuele cyclus, fagocytose van afgeworpen fotoreceptormembranen en afscheiding van essentiële factoren voor de structurele integriteit van het netvlies10. Het onderhouden van de RPE maakt een succesvolle ontwikkeling van fotoreceptor buiten- en binnensegmenten mogelijk, waardoor het netvlies langer levensvatbaar blijft11. De hieronder beschreven procedure behoudt de histotypische en fysiologische kenmerken van het netvlies gedurende ten minste twee weken12. Bovendien voorkomt het cultiveren van de organotypische retinale explants in serumvrij, antibioticavrij medium de aanwezigheid van onbekende stoffen en maakt een eenvoudige interpretatie van de resultatenmogelijk 12.
Organotypische retinale explantculturen zijn essentieel geweest voor het verbeteren van onze kennis over retinale ontwikkeling en degeneratie7,13,14. We laten hier zien dat ze ook een nuttig hulpmiddel zijn voor farmacologische screening en dat ze kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan netvliesaandoeningen te modelleren, waaronder diabetische retinopathie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

In oftalmisch onderzoek is er een sterke behoefte aan in vitro modellen van de neuroretina. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor organotypische cultivering van het neuro-netvlies van de muis met intact retinaal pigmentepitheel (RPE). Afhankelijk van de onderzoeksvraag kan het netvlies worden geïsoleerd van wilde dieren of van ziektemodellen, om bijvoorbeeld diabetische retinopathie of erfelijke netvliesdegeneratie te bestuderen. Ogen van vroege postnatale dag 2-9 dieren worden geïnsticeerd onder aseptische omstandigheden. Ze worden gedeeltelijk verteerd in proteïnase K om een ontkoppeling van de choroïde van de RPE mogelijk te maken. Onder de stereoscope wordt een kleine incisie gemaakt in het hoornvlies waardoor twee randen ontstaan van waaruit de choroïde en sclera voorzichtig kunnen worden afgepeld van de RPE en neuroretina. De lens wordt vervolgens verwijderd en de oogschelp wordt in vier punten gesneden om hem een vierwigige vorm te geven die lijkt op een klaverblad. Het weefsel wordt uiteindelijk in een hangende druppel overgebracht naar een celkweekinzetstuk met een polycarbonaatkweekmembraan. De culturen worden vervolgens onderhouden in R16-medium, zonder serum of antibiotica, onder volledig gedefinieerde omstandigheden, met elke tweede dag een gemiddelde verandering.
De beschreven procedure maakt de isolatie van het netvlies en het behoud van zijn normale fysiologische en histotypische context mogelijk voor cultiveringsperioden van ten minste 2 weken. Deze kenmerken maken organotypische retinale explantculturen een uitstekend model met een hoge voorspellende waarde, voor studies naar retinale ontwikkeling, ziektemechanismen en elektrofysiologie, terwijl ze ook farmacologische screening mogelijk maken.

Na het volgen van het protocol behouden ontlede en gekweekte retinale explants hun normale weefselarchitectuur, met verschillende lagen, van de RPE tot de ganglioncellaag (GCL), zoals weergegeven in figuur 2. De grootte van de buitenste nucleaire laag (ONL) en de binnenste nucleaire laag (INL) bleef meestal stabiel gedurende 2-3 weken, met een langzaam vorderend celverlies en geleidelijke dunner worden van deze lagen die steeds duidelijker werden als de aangroeiperiode wordt verlengd tot 4 weken en daarna. In de GCL daarentegen wordt vanwege de axotomie van de oogzenuw meestal een duidelijke verdunning waargenomen binnen de eerste 4 dagen na het cultiveren. Daarna zal de resterende celpopulatie in de GCL (meestal verplaatste amacrinecellen) nog 3-4 weken levensvatbaar blijven17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figuur 2: Celtypen gevonden in retinale explantcultuur. Retinale explantcultuur bij P11 afgeleid van rd1 mutant (A) en WT dieren (B) met nucleaire kleuring met DAPI (links, blauw), staaffotoreceptoren (midden, rood) en Müller cellen (rechts, groen). Nucleaire kleuring benadrukt alle belangrijke cellulaire lagen van het netvlies, zoals retinale pigmentepitheel (RPE), buitenste nucleaire laag (ONL), binnenste nucleaire laag (INL) en ganglioncellaag (GCL). Specifieke celtypen in de nucleaire lagen, zoals staven en Müller-cellen, zijn immunoactief gelabeld met respectievelijk alfa-arrestine26 en glutaminesynthetase27 antilichamen. (C) Toont een volledige lengte van een hele   rd1 muis retina, met DAPI kleuring die de consistentie, integratie en ontwikkeling van het netvlies benadrukt. Deze netvliezen werden gedurende 6 dagen gekweekt. Procedurebeschrijving: Retina en RPE afgeleid van rd1- of WT-dieren werden geïsoleerd op P5 en gekweekt zoals beschreven in het protocol, tot P11 met een gemiddelde verandering om de 48 uur. Culturen werden vastgesteld met 4% PFA op P11 en cryosectioned. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken</a>
Serumvrij medium en de aanhoudende in vitro omgeving maken het mogelijk om volledige controle te hebben over de experimentele omstandigheden. Hier geven we twee voorbeelden voor specifieke toepassingen van dit protocol. Het eerste voorbeeld illustreert de mogelijkheid om retinale explants te gebruiken voor drugstests of screeningsdoeleinden. Organotypische retinale explantculturen werden bereid uit wild-type (WT) en rd1 muismodellen. Dit laatste is een goed gekarakteriseerd model voor retinale degeneratie15. In het rd1-netvlies van de muis wordt ONL-degeneratie veroorzaakt door abnormaal hoge niveaus van cGMP in staaffotoreceptoren6,20. Overmatige cGMP veroorzaakt verhoogde activiteit van cyclische nucleotide gated ion kanalen (CNGCs) en cGMP-afhankelijke eiwitkinase (PKG), wat leidt tot celdood21. De behandeling van rd1-muis retinas met een structureel analoog aan cGMP (cyclisch nucleotide #3; CN003), dat zich richt op zowel PKG als CNGC, werd getest. Na explantatie bij P5 werd het behandelingsparadigma beschreven in figuur 3A gevolgd. Explantculturen werden vastgesteld met 4% PFA bij P11 en voorbereid op cryosectioning (figuur 3A). Om de celdood van histologische secties van behandelde, niet-behandelde (NT) en WT-monsters te beoordelen, werd een terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay22 uitgevoerd. De analyse van TUNEL-gelabelde cellen toonde een hoog percentage stervende cellen in de ONL van de rd1 onbehandelde specimens, terwijl CN003 rd1-muisfotoreceptoren beschermde bij toepassing bij een concentratie van 50 μM23 (figuur 3B). 
Een frequente complicatie van diabetes is diabetische retinopathie, een verblindende ziekte die moeilijk getrouw te reproduceren is in diermodellen5. Het tweede voorbeeld benadrukt het gebruik van organotypische retinale explantculturen om de levensvatbaarheid van netvliescellen te karakteriseren onder omstandigheden die type 2 diabetes mellitus (T2DM) nabootsen24. Hier gebruikten we 20 mM van de glycolyseremmer 2-deoxy-glucose (2-DG)25 en gaven we het gedurende 24 uur toe aan het kweekmedium van P10 tot P11. We laten zien dat het onderwerpen van WT retinale explants aan dergelijke in vitro gesimuleerde diabetische aandoeningen leidt tot uitgebreide neuronale celdood van het netvlies (Figuur 3C). Dit paradigma kan dan op zijn beurt worden gebruikt om bijvoorbeeld degeneratieve mechanismen te bestuderen of om retinoprotectieve behandelingen in een diabetescontext te testen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figuur 3: Twee voorbeelden voor toepassingen van organotypische retinale explantculturen. (A) Procedurebeschrijving: Retina en RPE afgeleid van rd1- of WT-dieren werden geïsoleerd op postnatale dag (P) 5 en gekweekt zoals hierboven beschreven, met een gemiddelde verandering om de 48 uur. Bij P7 en P9 werd het verbruikte medium weggegooid en werd verse CM met actieve verbinding met een concentratie van 50 μM aan de plaat toegevoegd. Culturen werden vastgesteld met 4% PFA op P11 en cryosectioned. (B) Samengestelde testen op rd1 retina. Secties werden verkregen uit WT, behandelde (003) en niet-behandelde (NT) organotypische retinale explantculturen. TUNEL-test (rood) werd gebruikt als marker voor celdood. Nucleaire kleuring met DAPI (blauw). De kwantificering in staafdiagram illustreert de percentages stervende cellen in WT, rd1 NT en rd1 003 conditie. Behandeling met samengestelde 003 aanzienlijk verminderd rd1 fotoreceptor celdood. (C) Simulatie van type-2 diabetes mellitus (T2DM) op het WT-netvlies met behulp van een behandeling met 2-deoxy-glucose (2-DG). Tunel-test werd uitgevoerd op NT- en T2DM-exemplaren. De kwantificering duidt op een zeer significante toename van celdood. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken</a>
Tabel S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Klik hier om de tabel te downloaden</a>  
Tabel S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Klik hier om de tabel te downloaden</a>  
Tabel S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Klik hier om de tabel te downloaden</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Het protocol beschrijft organotypische explants van het neuro-netvliesvan muizen , gekweekt samen met het retinale pigmentepitheel (RPE), in R16 gedefinieerd medium, vrij van serum en antibiotica. Deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren, goedkoper en tijdrovend in vergelijking met in vivo experimenten en kan worden aangepast aan tal van experimentele toepassingen.

Langdurige, serumvrije teelt van organotypische muis retina explants met intact retinale pigmentepitheel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Organotypische Cultuur van Full-dikte van volwassen varkens Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generatie en langdurig onderhoud van zenuwvrije<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...