Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Questo lavoro di ricerca ha ricevuto un sostegno finanziario dall'Unione europea (transMed; H2020-MSCA-765441), il Consiglio tedesco delle ricerche (DFG; PA1751/8-1, 10-1) e il Consiglio delle borse di studio per la Cina.

I protocolli sugli animali conformi al §4 della legge tedesca sulla protezione degli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato dell'Università di Tubinga per la protezione degli animali(Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; N. registrazione AK02/19M). In questo studio, le retine sono state ottenute da topi di tipo selvatico (WT) e rd1, quest'ultimo è un modello ben caratterizzato per la degenerazione retinicaereditaria 15. I topi erano alloggiati sotto l'illuminazione ciclica bianca standard, avevano libero accesso al cibo e all'acqua e venivano utilizzati indipendentemente dal sesso.
1. Lista di controllo
<ol><li>Per garantire condizioni sterili ed evitare contaminazioni, pulire e disinfettare la cappa di flusso d'aria laminare con il 70% di etanolo. Assicurati di lasciare evaporare completamente l'etanolo, per prevenire l'intossicazione delle colture retiniche.</li>
	<li>Strumenti autoclave (ad esempio forbici, forcette e cucchiaio raschiante al microscopio oftalmico) prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare in anticipo i seguenti supporti sotto una cappa a flusso laminare, in condizioni sterili: Basal R16 medium (BM) (può essere conservato a 4 °C per 4 settimane), BM con siero fetale al polpaccio 20% (FCS) (uso stesso giorno), BM con 0,12% proteinasi K (44 mAnson U/mg) soluzione (stesso uso quotidiano) e mezzo R16 completo con integratori (CM) come descritto da Romijn16 (può essere conservato a 4 °C per 3 settimane) (vedi tabelle S1, S2 e S3).</li>
	<li>Preriscaldare la soluzione di proteinasi K a 37 °C per attivarla e utilizzarla nel passaggio 2.5.</li>
</ol>2. Preparazione
<ol><li>Sacrificio rd1/WT animale nel giorno post-natale (P) 5 per decapitazione. Per gli animali di età superiore a P11, utilizzare CO2 e/o lussazione cervicale, secondo le normative locali sulla protezione degli animali.</li>
	<li>A seconda dell'età dell'animale, prima dell'enucleazione, se necessario, aprire i coperchi degli occhi usando le forcep e separare con molta attenzione i coperchi degli occhi, senza toccare o graffiare l'occhio sottostante.</li>
	<li>Enucleare rapidamente gli occhi sotto uno stereoscopio usando forcep curve.</li>
	<li>Incubare gli occhi in BM per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incubare gli occhi in BM preriscaldato, con 0,12% proteinasi K a 37 °C per 15 min.</li>
	<li>Eseguire i seguenti passaggi all'interno di una cappa di flusso d'aria laminare per garantire condizioni sterili. Per inattivare la proteinasi K, trasferire gli occhi su BM contenente il 20% di FCS e incubare per 5 minuti presso RT.</li>
	<li>Sezionare gli occhi sotto uno stereoscopio, a livello aettico, in una piastra di Petri contenente BM fresco a RT. Avviare la dissezione il prima possibile dopo l'enucleazione. Più a lungo questa volta è, più difficile è sezionare la retina, gli occhi diventano molto morbidi.<ol>
<li>Con le forcep, tenere l'occhio dal nervo ottico. Usando forbici fini, fare una piccola incisione nella cornea creando 2 bordi da cui la cornea, il coroide e la sclera possono essere delicatamente sbucciati usando 2 paia di forcep fini(Figura 1 passi A-C). In alternativa, utilizzare una cannula a scartamento ridotto per fare una prima incisione nella cornea e quindi inserire una delle lame a forbice nell'apertura.</li>
		<li>Afferrare l'obiettivo con forcep fini. Posizionare una seconda coppia di forcep perpendicolarmente alle prime in modo che le prime forcep siano tra i 2 gambo del secondo. Tirare per estrarre l'obiettivo dalla tazza degli occhi. Se il corpo vitreo e il corpo ciliario sono ancora attaccati alla retina, rimuoverli con attenzione(Figura 1 fase D). NOTA: I passaggi 2.7.1 e 2.7.2 necessitano di pratica e garantiscono cautela per non danneggiare la retina.</li>
		<li>Tagliare la retina perpendicolarmente ai bordi in quattro punti, creando una forma a quadrifoglio(Figura 1 passaggi E-F).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta con base ampiamente tagliata di una punta da 1 mL, tenere la retina in una goccia appesa di mezzo e trasferirla in un inserto filtrante per piatti di coltura posto in una piastra di coltura a 6 po porsi. Lo strato RPE deve essere fronte alla membrana(Figura 1 fase G).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere con cura il mezzo in eccesso dall'inserto.</li>
		<li>Dai lati del pozzo, aggiungere 1 mL di CM per pozzo e incubare in un incubatore sterile a 37 °C con 5% CO2. Non immergere la retina nel mezzo in quanto ciò ridurrà l'ossigenazione e causerà la degenerazione tissutale. L'espianto deve rimanere all'interfaccia tra liquido e aria, coperto solo da un sottile film di liquido creato dalla tensione superficiale dell'acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare indisturbato l'espianto retinale per le prime 48 ore per facilitare il recupero dopo la procedura di espianto.</li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni secondo giorno (48 h). Scartare 700 μL di mezzo da ogni pozzo e aggiungere 900 μL di CM fresco al pozzo. In questo modo, la quantità di mezzo persa per evaporazione viene recuperata e l'espianto retinale mantiene alcuni dei fattori neuroprotettivi prodotti nelle precedenti 48 ore.</li>
	<li>Incubare il mezzo rimosso in un tubo di microcentrifugo separato e chiuso insieme alle colture per controllare e valutare la possibile contaminazione (cioè il cambiamento di colore del mezzo). NOTA: Le espianto retiniche possono essere conservate in coltura per almeno 2 settimane12.</li>
</ol>3. Dopo la ristrutturazione
NOTA: Gli espianto possono essere utilizzati per diverse applicazioni sperimentali (western blot, istologia, supporti interi, analisi genetica, elettrofisiologia). A seconda dell'applicazione, le espianto retiniche organotipiche possono essere congelate, litolate o preparate per la criosezione. I passaggi seguenti descrivono la preparazione istologica.
<ol><li>Eseguire una fissazione di 45 minuti con paraformaldeide al 4% (PFA), seguita da una crioprotezione graduale del saccarosio (10% di saccarosio per 10 minuti, 20% per 20 minuti e 30% per 2 ore a temperatura ambiente (RT) o durante la notte (ON) a 4 °C). Aggiungere questi buffer direttamente nel pozzo.</li>
	<li>Tagliare la membrana intorno alle espianto retiniche.</li>
	<li>Incorporare sia la membrana che il tessuto retinale nel mezzo per il tessuto congelato.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figura 1: Procedura passo-passo per la preparazione di colture organotipiche di espianto retino. (A) Gli occhi del topo vengono enucleati e trasferiti in una soluzione di proteinasi K per consentire la separazione di sclera e coroide dalla retina e dall'RPE. Viene introdotto un piccolo taglio nello strato sclera / coroide. (B) Per sbucciare lo strato sclera/coroide vengono utilizzate due forcep. (C) Lo strato di coroide nero può essere visto durante il peeling. L'epitelio pigmentato retinico scuro (RPE) che sottolinea rimane attaccato al bulbo oculare. La sclera e la coroide vengono rimosse insieme al nervo ottico. (D) La lente e il vitreo vengono estratti con forcep.  Il corpo ciliario rimanente viene rimosso. (E) La retina mantiene una forma simile a una ciotola. (F) Per appiattire la retina per la coltivazione in un piatto, 4 tagli a uguale distanza intorno alla retina sono fatti con una forbice, dandogli una forma simile a un trifoglio. La coltura della retina viene trasferita in un inserto di coltura a membrana in una piastra a 6 po porsi con l'uso di una punta di pipetta da 1 mL tagliata. La retina conserva ancora parte della forma a ciotola. Tuttavia, dopo la rimozione del liquido in eccesso che circonda la retina, si svilupperà in una struttura planare. (G) Nella configurazione della membrana di coltura, la coltura della retina è appoggiata su una membrana porosa in policarbonato (PC) sopra una soluzione di mezzo R16 completo. Per garantire la vitalità, la coltura deve essere mantenuta in un incubatore sterile umidificato a 37 °C con 5% CO2e il mezzo deve essere sostituito ogni 48 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra</a>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato descrive colture organotipiche di estipe di retina di topo con RPE intatto in mezzo R16 definito, privo di siero e antibiotici. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato a partire dalla fine degli anni '807,28 e da allora è stato continuamenteperfezionato 6,11,12. Tra le applicazioni degne di nota figurano studi sui meccanismi della degenerazione retinica ereditaria e l'identificazione dei farmaci retinoprotettivi23,29,30.
Per un esperimento riuscito, è necessario prendere in considerazione alcune considerazioni importanti. Ecco alcuni importanti punti di risoluzione dei problemi per migliorare la qualità delle culture. In primo luogo, le colture retiniche possono mostrare un'eccessiva piegatura e/o formazione di rosetta31. Ciò può essere causato toccando la retina con una forza durante la procedura di espianto. Inoltre, il corpo ciliario deve essere completamente rimosso dall'espianto, in quanto ciò può aumentare la piegatura retinica durante la coltura. In secondo luogo, durante il trasferimento della retina alla piastra del pozzo in una goccia sospesa, se la retina si affaccia sulla membrana il lato sbagliato verso il basso, tienila nella goccia appesa alla punta della pipetta e spingi molto delicatamente il mezzo in uscita dalla punta (senza staccare la goccia appesa) per capovolgere la retina. Infine, se l'RPE rimane attaccato alla sclera e si stacca dalla retina, è molto probabilmente causato da una predigestione insufficiente della sclera. Questo problema potrebbe essere particolarmente importante quando si lavora con gli occhi di animali più anziani o specie non roditori (ad esempio suini) e può essere risolto aumentando la concentrazione di proteinasi K.
Condurre colture organotipiche di espianto retiniche è una procedura complessa che richiede un'adeguata formazione ed esperienza. La mancanza di formazione può portare alla variabilità nella qualità delle espianto retiniche. Per questi motivi, è importante monitorare e verificare la fattibilità e la riproducibilità, caratterizzando, ad esempio, il tasso di morte cellulare con il saggio TUNEL. L'uso di un mezzo privo di antibiotici rende gli espianto retiniche vulnerabili alla contaminazione da batteri e funghi. Per ridurre al minimo questo rischio, si consiglia di prestare particolare attenzione a lavorare in condizioni veramente asettiche. Un'altra limitazione della coltura retinica in vitro sono le differenze nell'ambiente fisiochimico rispetto alla retina in vivo (ad esempio, apporto di sangue coroio e retinico, livelli di ossigeno e glucosio, pressione intraoculare, composizione del vitreo). Un sistema di perfusione continua, forse incorporato in un bioreattorededicato 32, potrebbe rendere questo modello più vicino alla condizione in vivo. Inoltre, l'assotomia del nervo ottico durante la dissezione retinica porterà alla morte delle cellule gangliari, che può indurre risposte allo stress8. Pertanto, è consigliabile lasciare che l'espianto sia lasciato ad adattarsi alle condizioni di coltura per almeno 2 giorni in vitro prima di essere sottoposto a una manipolazione o a un trattamento specifico.
Il metodo descritto viene solitamente eseguito su tessuti retinali immaturi, che possono sopravvivere bene per 4 settimane in vitro7,33. Tuttavia, la procedura è adattabile a una varietà di applicazioni, tra cui la ristrutturazione della retina adulta. Sebbene diversi approcci pubblicati descrivano l'isolamento della retina adulta senza il suo RPE34,35, l'incubazione con soluzione di papaina per un massimo di 1 h a 37 °C prima della dissezione consente all'RPE di rimanere attaccato alla retina anche se derivato da un topo adulto36.
Il mezzo privo di siero e l'ambiente in vitro definito chimicamente prevedono una manipolazione completamente definita e riproducibile delle condizioni sperimentali. Pertanto, le colture organotipiche di espianto retiniche sono strumenti preziosi nel campo dell'oftalmologia e delle neuroscienze e sono state utilizzate per lo studio delle malattie retiniche37,lo sviluppo della retina38,39,la terapia delle cellule staminali retiniche40,le modifichegenetiche 41e lo screening farmacologico. Come esempio specifico di test farmacologici, qui abbiamo usato colture di espianto retinale per testare un analogo cGMP (CN003), noto per ridurre la morte cellulare del fotorecettore nei modelli animali per la malattia retinicaereditaria 23 (Figura 3B). Un'altra possibile applicazione della tecnica è descritta nella figura 3C, che illustra come il controllo preciso dell'ambiente tissutale possa essere sfruttato per emulare le condizioni diabetiche24. A causa della conservazione dell'architettura tissutale durante l'intero periodo di coltura, le colture organotipiche di espianto retinico sono adatte anche per studi elettrofisiologici. La funzionalità neuronale sulle espianto retiniche è stata studiata utilizzando la registrazione patch-clamp42 e la registrazione multi-elettrodo-array (MEA)33,43. Quest'ultimo consente la registrazione dell'attività elettrica delle popolazioni neuronali allo stesso tempo ed è stato sfruttato per caratterizzare la funzionalità del fotorecettore e della cellula ganglionaria in condizioni di coltura. In una prospettiva più ampia, i sistemi di coltura organotipica delle espianto possono essere applicati anche nella ricerca pre-clinica, dove le colture di espianto sono state utilizzate per testare l'efficacia terapeutica dell'ipotermia44.
La tecnica di coltivazione organotipico delle espianto è relativamente semplice da eseguire e, rispetto ai corrispondenti esperimenti in vivo, è meno costosa e dispendiosa in termini di tempo ed evita le preoccupazioni etiche legate agli studi sugli animali vivi. Il controllo preciso sulle condizioni sperimentali e la conservazione della complessità dell'RPE e dei tessuti rendono il metodo uno strumento prezioso per migliorare le nostre conoscenze sulla fisiologia retinica e la fisiopatologia e consentire numerose applicazioni sperimentali.

Nella ricerca oftalmica, sono disponibili una varietà di modelli per studiare la retina, tra cui colture primarie di cellule retiniche, linee cellulari derivate dalla retina, organoidi retinali e modelli animali in vivo1,2,3,4,5. Tuttavia, ognuno di questi modelli soffre di svantaggi. Ad esempio, le cellule crescono in isolamento mentre la retina è una rete complessa con una moltitudine di interazioni cellula-cellula. Pertanto, è probabile che il comportamento delle colture cellulari isolate sia artificiale rispetto a quello osservato in un intero tessuto. Questo problema può essere in parte risolto utilizzando organoidi retinali differenziati in vitro, che possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo e la biologia di base6. Tuttavia, ad oggi, la generazione organoide retinica richiede ancora molto tempo, richiede molto lavoro e soffre di problemi di riproducibilità, richiedendo un ulteriore lavoro di sviluppo sostanziale prima che gli organoidi possano essere utilizzati per la ricerca retinica traslizionale. Infine, gli studi sugli animali vivi, mentre probabilmente il modello più vicino alle esigenze della ricerca oftalmica, sono associati a forti preoccupazioni etiche. Un buon compromesso tra l'efficienza dei sistemi di coltura cellulare e la situazione reale dei modelli animali in vivo sono colture organotipiche di espianto retino. Tali colture riducono anche la sofferenza degli animali poiché non vengono eseguiti interventi in vivo.
Sono stati descritti diversi metodi per coltivare espianto retinale di diverse specie5,7,8. Il nostro protocollo descrive una tecnica per l'isolamento della neuroretina del topo insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa tecnica sarà adatta anche per colture retiniche di ratto9. La cultura della neuroretina insieme al suo RPE è di grande importanza per il successo. L'RPE svolge funzioni essenziali per la retina: trasporto di nutrienti, ioni, acqua, assorbimento della luce e protezione contro la fotoossidazione, reisomerazione dell'all-trans-retinica in 11-cis-retinica, che è fondamentale per il ciclo visivo, fagocitosi delle membrane fotorecettori a spargimento e secrezione di fattori essenziali per l'integrità strutturale della retina10. Il mantenimento dell'RPE consente uno sviluppo riuscito dei segmenti esterni ed interni del fotorecettore, mantenendo la retina vitale per un tempo più lungo11. La procedura descritta di seguito conserva le caratteristiche istotipiche e fisiologiche della retina per almeno due settimane12. Inoltre, coltivare le espianto retiniche organotipiche in mezzo privo di siero e privo di antibiotici evita la presenza di sostanze sconosciute e consente una semplice interpretazione dei risultati12.
Le colture organotipiche di espianto retino sono state essenziali per migliorare le nostre conoscenze sullo sviluppo retinale e sulla degenerazione7,13,14. Mostriamo qui che sono anche uno strumento utile per lo screening farmacologico e che possono essere utilizzati per modellare una varietà di malattie retiniche, compresa la retinopatia diabetica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Nella ricerca oftalmica, c'è un forte bisogno di modelli in vitro della neuroretina. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la 150% organotipico della neuro retina deltopo con epitelio pigmentato retinico intatto (RPE). A seconda della domanda di ricerca, le retine possono essere isolate da animali di tipo selvatico o da modelli di malattia, per studiare, ad esempio, la retinopatia diabetica o la degenerazione retinica ereditaria. Gli occhi dei primi giorni postnatali 2-9 animali vengono enucleati in condizioni asettiche. Sono parzialmente digeriti nella proteinasi K per consentire un distacco del coroide dall'RPE. Sotto lo stereoscopio, una piccola incisione viene fatta nella cornea creando due bordi da cui la coroide e la sclera possono essere delicatamente staccate dall'RPE e dalla neuroretina. L'obiettivo viene quindi rimosso e l'oculare viene tagliato in quattro punti per dargli una forma a quattro spicchi simile a una foglia di trifoglio. Il tessuto viene infine trasferito in una goccia appesa in un inserto di coltura cellulare che tiene una membrana di coltura in policarbonato. Le colture vengono poi mantenute in mezzo R16, senza siero o antibiotici, in condizioni completamente definite, con un cambio medio ogni secondo giorno.
La procedura descritta consente l'isolamento della retina e la conservazione del suo normale contesto fisiologico e istotipico per periodi di coltivazione di almeno 2 settimane. Queste caratteristiche rendono le colture organotipiche di espianto retino un modello eccellente ad alto valore predittivo, per studi sullo sviluppo retinale, sui meccanismi delle malattie e sull'elettrofisiologia, consentendo allo stesso tempo lo screening farmacologico.

Dopo aver seguito il protocollo, le espianto retiniche sezionate e coltivate preservano la loro normale architettura tissutale, con strati distinti, dall'RPE allo strato cellulare ganglio (GCL), come mostrato nella figura 2. Le dimensioni dello strato nucleare esterno (ONL) e dello strato nucleare interno (INL) rimasero per lo più stabili per 2-3 settimane, con una perdita cellulare che progredisce lentamente e un graduale assottigliamento di questi strati che diventava sempre più evidente se il periodo di culto è prolungato a 4 settimane e oltre. Nel GCL, al contrario, a causa dell'assotomia del nervo ottico, un marcato assottigliamento si osserva di solito entro i primi 4 giorni dalla ristrutturazione. Successivamente, la popolazione di cellule rimanenti nel GCL (cellule di amacrina per lo più spostate) continuerà ad essere vitale per altre 3-4 settimane17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figura 2: Tipi di cellule presenti nelle impostazioni cultura delle piante esplant retiniche. Coltura di espianto retinale in P11 derivata da animali mutanti rd1 (A) e WT (B) che mostrano colorazione nucleare con cellule DAPI (sinistra, blu), fotorecettori di aste (al centro, rosso) e celle Müller (destra, verde). La colorazione nucleare evidenzia tutti i principali strati cellulari della retina come l'epitelio pigmentato retinico (RPE), lo strato nucleare esterno (ONL), lo strato nucleare interno (INL) e lo strato di cellule gangliari (GCL). Tipi di cellule specifiche negli strati nucleari, come aste e cellule di Müller, sono immunoetichettati rispettivamente con anticorpi alfa arrestin26 e glutammina synthetasi27. (C) Mostra la sezione a lunghezza intera di   un'intera retina del mouse rd1, con colorazione DAPI che evidenzia la coerenza, l'integrazione e lo sviluppo della retina. Queste retine sono state coltivate per 6 giorni. Descrizione della procedura: Retina e RPE derivati da animali rd1 o WT sono stati isolati a P5 e coltivati come descritto nel protocollo, fino a P11 con un cambiamento medio ogni 48 h. Le colture sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e criosezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>
Il mezzo privo di siero e l'ambiente in vitro sostenuto consentono di avere il pieno controllo sulle condizioni sperimentali. Qui, forniamo due esempi per applicazioni specifiche di questo protocollo. Il primo esempio illustra la possibilità di utilizzare espianto retinale per test antidroga o screening. Le colture organotipiche di espianto retiniche sono state preparate con modelli di mouse di tipo selvaggio (WT) e rd1. Quest'ultimo è un modello ben caratterizzato per la degenerazione retinica15. Nella retina del mouse rd1, la degenerazione ONL è innescata da livelli anormalmente elevati di cGMP nei fotorecettoridell'asta 6,20. L'eccessivo cGMP causa una maggiore attività dei canali ionici gated nucleotidici ciclici (CNGC) e della protein chinasi cGMP-dipendente (PKG), portando alla morte cellulare21. Il trattamento delle retine del topo rd1 con un analogo strutturale a cGMP (nucleotide ciclico #3; CN003), che si rivolge sia al PKG che al CNGC, è stato testato. Dopo l'espianto in P5, è stato seguito il paradigma di trattamento descritto nella figura 3A. Le colture di espianto sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e preparate per la criosezione(figura 3A). Per valutare la morte cellulare di sezioni istologiche da campioni trattati, non trattati (NT) e WT, è stato eseguito un saggio terminale di deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labeling (TUNEL)22. L'analisi delle cellule etichettate TUNEL ha mostrato un'alta percentuale di cellule morenti nell'ONL dei campioni non trattati rd1, mentre i fotorecettori del topo rd1 protetti cn003 se applicati a una concentrazione di 50 μM23 (Figura 3B).
Una frequente complicanza del diabete è la retinopatia diabetica, una malattia accecante che è difficile da riprodurre fedelmente nei modelli animali5. Il secondo esempio evidenzia l'uso di colture organotipiche di espianto retiniche per caratterizzare la vitalità cellulare retinica in condizioni che emulano il diabete mellito di tipo 2 (T2DM)24. Qui, abbiamo usato 20 mM dell'inibitore della glicolisi 2-deossi-glucosio (2-DG)25 e lo abbiamo somministrato al mezzo di coltura per 24 ore da P10 a P11. Mostriamo che sottosopporsi di espianto retiniche WT a tali condizioni diabetiche simulate in vitro porta a un'estesa morte cellulare neuronale della retina ( Figura3C). Questo paradigma a sua volta può quindi essere utilizzato, ad esempio, per studiare meccanismi degenerativi o per testare trattamenti retinoprotettivi in un contesto di diabete.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figura 3: Due esempi per applicazioni dicolture organotipiche di escrezione retinica. (A) Descrizione della procedura: Retina e RPE derivati da animali rd1 o WT sono stati isolati nel giorno postnatale (P) 5 e coltivati come descritto sopra, con un cambiamento medio ogni 48 ore. A P7 e P9, il mezzo speso è stato scartato e alla piastra è stato aggiunto cm fresco contenente composto attivo ad una concentrazione di 50 μM. Le colture sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e criosezione. (B) Prove composte sulla retina rd1. Le sezioni sono state ottenute da colture di escrezione retinica organotipiche WT, trattate (003) e non trattate (NT). Il saggio TUNEL (rosso) è stato usato come marcatore per la morte cellulare. Colorazione nucleare con DAPI (blu). La quantificazione mostrata nel grafico a barre illustra le percentuali di cellule morenti in condizioni WT, rd1 NT e rd1 003. Il trattamento con composto 003 ha ridotto significativamente la morte cellulare del fotorecettore rd1. (C) Simulazione del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) sulla retina WT mediante trattamento con 2-deossic glucosio (2-DG). Il test TUNEL è stato eseguito su campioni NT e T2DM. La quantificazione indica un aumento molto significativo della morte cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>
Tabella S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>  
Tabella S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>  
Tabella S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

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JoVE Journal

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

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