Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dette forskningsarbeidet fikk økonomisk støtte fra EU (transMed; H2020-MSCA-765441), det tyske forskningsrådet (DFG; PA1751/8-1, 10-1) og Kinas stipendråd.

Dyreprotokoller i samsvar med §4 i den tyske dyrebeskyttelsesloven ble gjennomgått og godkjent av Tübingen Universitetskomité for dyrebeskyttelse (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registreringsnr. AK02/19M). I denne studien ble netthinner hentet fra wild-type (WT) og rd1 mus, sistnevnte er en godt karakterisert modell for arvelig retinal degenerasjon15. Mus ble plassert under standard hvit syklisk belysning, hadde fri tilgang til mat og vann, og ble brukt uavhengig av kjønn.
1. Sjekkliste
<ol><li>For å sikre sterile forhold og unngå forurensninger, rengjør og desinfiser laminær luftstrømshette med 70% etanol. Pass på å la etanol fordampe helt, for å forhindre forgiftning av netthinnekulturene.</li>
	<li>Autoklavverktøy (f.eks. saks, tang og oftalmisk mikroskopskrapingsskje) før bruk.</li>
	<li>Forbered følgende medier på forhånd under en laminær strømningshette, under sterile forhold: Basal R16 medium (BM) (kan lagres ved 4 °C i 4 uker), BM med 20 % fosterkalvserum (FCS) (samme dagbruk), BM med 4 ukers proteinase K (44 mAnson U/mg) oppløsning (samme dag) og komplett R16 medium med kosttilskudd (CM) som beskrevet av Romijn16 (kan oppbevares ved 4 °C i 3 uker) (se tabell S1, S2 og S3).</li>
	<li>Forvarm proteinase K-oppløsningen ved 37 °C for å aktivere den og bruk den i trinn 2.5.</li>
</ol>2. Forberedelse
<ol><li>Ofre rd1/ WT dyr på postnatal dag (P) 5 ved halshugging. For dyr eldre enn P11, bruk CO2 og/eller cervical dislokasjon, i henhold til de lokale dyrebeskyttelsesforskriftene.</li>
	<li>Avhengig av dyrets alder, før enucleation, om nødvendig, åpne øyelokkene ved hjelp av tang og svært forsiktig skille øyelokkene, uten å berøre eller skrape øyet nedenfor.</li>
	<li>Raskt enucleate øynene under et stereoskop ved hjelp av buede tang.</li>
	<li>Inkuber øynene i BM i 5 min ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Inkuber øynene i forvarmet BM, med 0,12% proteinase K ved 37 °C i 15 minutter.</li>
	<li>Utfør følgende trinn inne i en laminær luftstrømshette for å sikre sterile forhold. For å inaktivere proteinase K, overfør øynene til BM som inneholder 20% FCS og inkubere i 5 min ved RT.</li>
	<li>Disseker øynene under et stereoskop, aseptisk, i en Petri-tallerken som inneholder fersk BM ved RT. Start avhandlingen så snart som mulig etter enucleation. Jo lenger denne gangen er, jo vanskeligere er det å dissekere netthinnen, øynene blir veldig myke.<ol>
<li>Med tang, hold øyet fra synsnerven. Bruk fin saks, lag et lite snitt i hornhinnen og lag 2 kanter hvorfra hornhinnen, choroiden og scleraen forsiktig kan skrelles ved hjelp av 2 par fine tang (Figur 1 trinn A-C). Alternativt kan du bruke en smalmålerkanyle til å lage et første snitt i hornhinnen og deretter sette inn et av saksebladene i åpningen.</li>
		<li>Ta tak i linsen med fine tang. Plasser et annet par tang vinkelrett på de første slik at de første tangene er mellom de 2 skaftene i den andre. Trekk for å trekke ut linsen fra øyekoppen. Hvis glasslegemet og ciliary kroppen fortsatt er festet til netthinnen, fjern dem forsiktig (Figur 1 trinn D). MERK: Trinn 2.7.1 og 2.7.2 trenger øvelse og sørger for forsiktighet for ikke å skade netthinnen.</li>
		<li>Klipp netthinnen vinkelrett på kantene i fire punkter, og lag en firkløverform (Figur 1 trinn E-F).</li>
		<li>Bruk en pipette med bredt kuttet base av en 1 ml spiss, hold netthinnen i en hengende dråpe medium og overfør den til en kulturfatfilterinnsats plassert i en 6-brønns kulturplate. RPE-laget skal vende mot membranen (Figur 1 trinn G).</li>
		<li>Bruk en pipette og fjern forsiktig overflødig medium fra innsatsen.</li>
		<li>Fra sidene av brønnen, tilsett 1 ml CM per brønn og inkuber i en steril inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Ikke senk netthinnen i mediet, da dette vil redusere oksygenering og forårsake vevsdegenerering. Utløpet skal forbli i grensesnittet mellom væske og luft, dekket bare av en tynn væskefilm skapt av overflatespenningen av vann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La netthinne utvise uforstyrret i de første 48 timer for å lette utvinningen etter eklantasjonsprosedyren.</li>
	<li>Endre mediet annenhver dag (48 t). Kast 700 μL medium fra hver brønn og tilsett 900 μL fersk CM til brønnen. På denne måten gjenopprettes mengden medium tapt ved fordampning, og netthinnens explant holder noen av de nevrobeskyttende faktorene produsert i de forrige 48 h.</li>
	<li>Inkuber det fjernede mediet i et separat og lukket mikrosenterrør sammen med kulturene for å kontrollere og evaluere mulig forurensning (dvs. endring i farge på mediet). MERK: Retinal explants kan holdes i kultur i minst 2 uker12.</li>
</ol>3. Etter dyrking
MERK: Explants kan brukes til forskjellige eksperimentelle applikasjoner (vestlig blot, histologi, hele mounts, genetisk analyse, elektrofysiologi). Avhengig av søknaden kan organotypiske retinal explants bli snap frosset, lysed eller forberedt på kryoging. Trinnene nedenfor beskriver histologisk forberedelse.
<ol><li>Utfør en 45-minutters fiksering med 4% paraformaldehyd (PFA), etterfulgt av gradvis sukrose kryobeskyttelse (10% sukrose i 10 min, 20% i 20 min og 30% i 2 timer ved romtemperatur (RT) eller over natten (ON) ved 4 °C). Tilsett disse bufferne direkte i brønnen.</li>
	<li>Klipp membranen rundt retinal explants.</li>
	<li>Bygg inn både membranen og netthinnen vev i mediet for frossent vev.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figur 1: Trinnvis prosedyre for fremstilling av organotypiske retinal explant-kulturer. (A) Museøyne er enucleated og overført til en løsning av proteinase K for å tillate separasjon av sclera og choroid fra netthinnen og RPE. Et lite kutt i sclera / choroid laget er introdusert. (B) To tang brukes til å skrelle sclera/choroidlaget. (C) Det svarte koroidlaget kan ses under peelingen. Det understrekende mørke retinalpigmentepitelet (RPE) forblir festet til øyebollet. Sclera og choroid fjernes sammen med synsnerven. (D) Linsen og glasslegemet ekstraheres med tang.  Gjenværende ciliary kroppen er fjernet. (E) Netthinnen beholder en bollelignende form. (F) For å flate netthinnen for dyrking i en tallerken, er 4 kutt i like avstand rundt netthinnen laget med en saks, noe som gir den en kløverlignende form. Netthinnekulturen overføres til en membrankulturinnsats i en 6-brønns plate ved bruk av en kuttet 1 ml pipettespiss. Netthinnen beholder fortsatt noe av bolleformen. Men ved fjerning av overflødig væske rundt netthinnen, vil den utfolde seg til en planarstruktur. (G) I kulturmembranoppsettet hviler netthinnekulturen på en porøs polykarbonatmembran (PC) på toppen av en løsning av komplett R16-medium. For å sikre levedyktighet må kulturen oppbevares i en fuktet steril inkubator ved 37 °C med 5 % CO2, og mediet bør skiftes ut hver 48. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Protokollen som presenteres beskriver organotypiske eklantkulturer av mus netthinne med intakt RPE i definert R16 medium, fri for serum og antibiotika. Denne protokollen ble opprinnelig utviklet fra slutten av 1980-tallet7,28 og siden da har den blitt kontinuerlig raffinert6,11,12. Bemerkelsesverdige anvendelser inkluderer studier i mekanismene for arvelig retinal degenerasjon og identifisering av retinoprotective legemidler23,29,30.
For et vellykket eksperiment må det tas hensyn til noen viktige hensyn. Her er noen viktige feilsøkingspunkter for å forbedre kvaliteten på kulturer. For det første kan netthinnekulturene vise overdreven folding og/eller rosettdannelse31. Dette kan skyldes berøring av netthinnen med tang under utvisningsprosedyren. Videre må ciliary kroppen fjernes helt fra explant, da dette kan øke retinal folding under kultur. For det andre, under overføringen av netthinnen til brønnplaten i en hengende dråpe, hvis netthinnen vender mot membranen på feil side ned, hold den i dråpen som henger fra pipettespissen og skyv forsiktig mediet inn og ut av spissen (uten å løsne hengende dråpe) for å snu netthinnen rundt. Til slutt, hvis RPE forblir festet til sclera og løsner fra netthinnen, er det mest sannsynlig forårsaket av utilstrekkelig for fordøyelsesbesvær av sclera. Dette problemet kan være spesielt viktig når du arbeider med øyne fra eldre dyr eller ikke-gnagerarter (f.eks. griser) og kan løses ved å øke proteinase K-konsentrasjonen.
Å gjennomføre organotypiske retinal explant kulturer er en kompleks prosedyre som krever tilstrekkelig trening og erfaring. Mangel på trening kan føre til variasjon i kvaliteten på retinal explants. Av disse grunnene er det viktig å overvåke og verifisere levedyktighet og reproduserbarhet, som for eksempel karakteriserer frekvensen av celledød med TUNEL-analysen. Bruken av et antibiotikafritt medium gjør retinal explants sårbare for forurensning av bakterier og sopp. For å minimere denne risikoen anbefaler vi at det tas særlig hensyn til arbeidet under virkelig aseptiske forhold. En annen begrensning av in vitro retinal culturing er forskjeller i fysiokjemisk miljø sammenlignet med in vivo netthinnen (f.eks. koroidal og retinal blodtilførsel, oksygen- og glukosenivåer, intraokulært trykk, sammensetning av glasslegemet). Et kontinuerlig perfusjonssystem, kanskje innebygd i en dedikert bioreaktor32, kan gjøre denne modellen nærmere in vivo-tilstanden. Videre vil axotomien til synsnerven under retinal disseksjon føre til ganglioncelledød, som kan indusere stressresponser8. Derfor anbefales det at utvises for å tilpasse seg til dyrkingsforhold i minst 2 dager in vitro før det blir utsatt for en bestemt manipulasjon eller behandling.
Den beskrevne metoden utføres vanligvis på umoden retinal vev, som kan overleve godt i 4 uker in vitro7,33. Prosedyren er imidlertid skreddersydd for en rekke applikasjoner, inkludert dyrking av voksen netthinne. Selv om forskjellige publiserte tilnærminger beskriver isolasjonen av den voksne netthinnen uten RPE34,35, inkubasjonen med papainoppløsning i opptil 1 time ved 37 °C før disseksjon gjør at RPE kan holde seg festet til netthinnen selv når den er avledet fra en voksen mus36.
Det serumfrie mediet og det kjemisk definerte in vitro-miljøet sørger for en helt definert og reproduserbar manipulering av de eksperimentelle forholdene. Derfor er organotypiske retinal explant kulturer verdifulle verktøy innen oftalmologi og nevrovitenskap, og har blitt brukt til å studere netthinnesykdommer37, netthinneutvikling38,39, retinal stamcellebehandling40, genetiske modifikasjoner41og farmakologisk screening. Som et spesifikt eksempel på legemiddeltesting brukte vi her netthinneutløpskulturer for å teste en cGMP-analog (CN003), kjent for å redusere fotoreseptorcelledød i dyremodeller for arvelig retinal sykdom23 (Figur 3B). En annen mulig anvendelse av teknikken er beskrevet i figur 3C, som illustrerer hvordan den nøyaktige kontrollen av vevsmiljøet kan utnyttes til å etterligne diabetikerforhold24. På grunn av bevaring av vevsarkitektur over hele modningsperioden, er organotypiske retinal explant kulturer også egnet for elektrofysiologiske studier. Neuronal funksjonalitet på retinal explants har blitt undersøkt ved hjelp av patch-clamp opptak42 og multi-elektrode-array (MEA) opptak33,43. Sistnevnte tillater registrering av elektrisk aktivitet av nevronpopulasjoner samtidig og har blitt utnyttet til å karakterisere fotoreseptor- og ganglioncellefunksjonalitet i kulturforhold. I et bredere perspektiv kan de organotypiske eklantkultursystemene også brukes i preklinisk forskning, hvor eklantkulturer ble brukt til å teste den terapeutiske effekten av hypotermi44.
Den organotypiske utvisningsteknikken er relativt enkel å utføre, og sammenlignet med tilsvarende in vivo-eksperimenter er den billigere og tidkrevende, og unngår de etiske bekymringene knyttet til levende dyrestudier. Den nøyaktige kontrollen over eksperimentelle forhold og bevaring av RPE og vevskompleksitet gjør metoden til et verdifullt verktøy for å forbedre vår kunnskap om retinal fysiologi og patofysiologi og muliggjøre mange eksperimentelle applikasjoner.

I oftalmisk forskning er en rekke modeller tilgjengelige for å studere netthinnen, inkludert primære netthinnecellekulturer, netthinneavledede cellelinjer, netthinneorganoider og in vivo dyremodeller1,2,3,4,5. Imidlertid lider hver av disse modellene av ulemper. For eksempel vokser celler isolert mens netthinnen er et komplekst nettverk med en rekke celle-til-celle interaksjoner. Dermed vil oppførselen til isolerte cellekulturer sannsynligvis være kunstig sammenlignet med det som observeres i et helt vev. Dette problemet kan delvis løses ved hjelp av in vitro differensierte retinal organoider, som kan brukes til å studere utvikling og grunnleggende biologi6. Likevel, per i dag, er retinal organoid generasjon fortsatt tidkrevende, arbeidsintensiv, og lider av reproduserbarhetsproblemer, og krever betydelig videre utviklingsarbeid før organoider kan brukes til translasjonell retinal forskning. Til slutt er studier på levende dyr, mens uten tvil modellen som kommer nærmest kravene til oftalmisk forskning, forbundet med sterke etiske bekymringer. Et godt kompromiss mellom effektiviteten til cellekultursystemer og den virkelige situasjonen til in vivo dyremodeller er organotypiske retinal explant kulturer. Slike kulturer reduserer også dyrelidelse siden ingen in vivo-intervensjoner utføres.
Flere metoder er beskrevet for å dyrke retinal explants fra forskjellige arter5,7,8. Vår protokoll beskriver en teknikk for isolering av musen neuroretina sammen med sin retinal pigment epitel (RPE). Denne teknikken vil også være egnet for rotte retinal kulturer9. Kulturen til neuroretina sammen med sin RPE er av stor betydning for suksess. RPE utfører viktige funksjoner for netthinnen: transport av næringsstoffer, ioner, vann, absorpsjon av lys og beskyttelse mot fotooksidasjon, re-isomerisering av all-trans-retinal i 11-cis-retinal, som er avgjørende for den visuelle syklusen, fagocytose av skur fotoreseptormembraner og sekresjon av essensielle faktorer for den strukturelle integriteten til netthinnen10. Vedlikehold av RPE tillater en vellykket utvikling av fotoreseptor ytre og indre segmenter, og holder netthinnen levedyktig i lengre tid11. Prosedyren beskrevet nedenfor bevarer de histotypiske og fysiologiske egenskapene til netthinnen i minst to uker12. Videre unngår culturing de organotypiske retinal explants i serumfritt, antibiotikafritt medium tilstedeværelsen av ukjente stoffer og muliggjør en enkel tolkning av resultatene12.
Organotypiske retinal explant kulturer har vært avgjørende for å forbedre vår kunnskap om retinal utvikling og degenerasjon7,13,14. Vi viser her at de også er et nyttig verktøy for farmakologisk screening og at de kan brukes til å modellere en rekke netthinnesykdommer, inkludert diabetisk retinopati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

I oftalmisk forskning er det et sterkt behov for in vitro-modeller av nevroretina. Her presenterer vi en detaljert protokoll for organotypisk dyrking av musens nevronetthinne med intakt retinal pigment epitel (RPE). Avhengig av forskningsspørsmålet kan netthinner isoleres fra ville dyr eller fra sykdomsmodeller, for å studere for eksempel diabetisk retinopati eller arvelig retinal degenerasjon. Øyne fra tidlig barseldag 2-9 dyr er utdannet under aseptiske forhold. De er delvis fordøyd i proteinase K for å tillate en løsrivelse av choroid fra RPE. Under stereoskopet er det laget et lite snitt i hornhinnen og skaper to kanter hvor choroid og sclera forsiktig kan skrelles av fra RPE og neuroretina. Linsen fjernes deretter, og øyemuslingen kuttes i fire punkter for å gi den en fire-kilet form som ligner et kløverblad. Vevet overføres til slutt i en hengende dråpe inn i en cellekulturinnsats som holder en polykarbonatkulturerende membran. Kulturene opprettholdes deretter i R16 medium, uten serum eller antibiotika, under helt definerte forhold, med en middels endring annenhver dag.
Prosedyren som er beskrevet muliggjør isolering av netthinnen og bevaring av sin normale fysiologiske og histotypiske kontekst for modningsperioder på minst 2 uker. Disse funksjonene gjør organotypiske retinal explant-kulturer til en utmerket modell med høy prediktiv verdi, for studier i retinal utvikling, sykdomsmekanismer og elektrofysiologi, samtidig som de muliggjør farmakologisk screening.

Etter å ha fulgt protokollen, bevarer dissekerte og kultiverte retinal explants sin normale vevsarkitektur, med forskjellige lag, fra RPE til ganglioncellelaget (GCL), som vist i figur 2. Ytre kjernefysisk lag (ONL) og indre kjernefysisk lag (INL) størrelse forble for det meste stabilt i 2-3 uker, med et sakte utviklende celletap og gradvis tynning av disse lagene blir mer og mer tydelig hvis modningsperioden forlenges til 4 uker og utover. I GCL, derimot, på grunn av axotomien i synsnerven, observeres en markert tynning vanligvis innen de første 4 dagene av kultivering. Etterpå vil den gjenværende cellepopulasjonen i GCL (for det meste fordrevne amacrine celler) fortsatt være levedyktig i ytterligere 3-4 uker17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figur 2: Celletyper som finnes i retinal explant kultur. Retinal explant kultur ved P11 avledet fra rd1 mutant (A) og WT dyr (B) viser kjernefysisk farging med DAPI (venstre, blå), stang fotoreseptorer (midten, rød) og Müller celler (høyre, grønn). Kjernefysisk farging fremhever alle de store cellulære lagene i netthinnen som retinal pigment epitel (RPE), ytre kjernefysisk lag (ONL), indre kjernefysisk lag (INL) og ganglion cellelag (GCL). Spesifikke celletyper i atomlagene, som stenger og Müller-celler, er immunmerket med henholdsvis alfa-arrestin26 og glutaminsyntetase27 antistoffer. (C) Viser full lengde delen av en hel   rd1 mus netthinne, med DAPI farging fremhever konsistensen, integrasjonen og utviklingen av netthinnen. Disse netthinnene ble dyrket i 6 dager. Prosedyrebeskrivelse: Retina og RPE avledet fra rd1- eller WT-dyr ble isolert ved P5 og dyrket som beskrevet i protokollen, til P11 med middels endring hver 48. Kulturer ble fikset med 4% PFA ved P11 og gråtosectioned. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren</a>
Serumfritt medium og det vedvarende in vitro-miljøet gir full kontroll over de eksperimentelle forholdene. Her gir vi to eksempler for spesifikke applikasjoner av denne protokollen. Det første eksemplet illustrerer muligheten for å bruke retinal explants for narkotikatesting eller screeningformål. Organotypiske retinal explant kulturer ble utarbeidet fra wild-type (WT) og rd1 musemodeller. Sistnevnte er en godt karakterisert modell for retinal degenerasjon15. I rd1 mus netthinnen, ONL degenerasjon utløses av unormalt høye nivåer av cGMP i stang fotoreseptorer6,20. Overdreven cGMP forårsaker økt aktivitet av syklisk nukleotid inngjerdede ionkanaler (CNGCer) og cGMP-avhengig protein kinase (PKG), noe som fører til celledød21. Behandling av rd1 mus netthinner med en strukturell analog til cGMP (syklisk nukleotid #3; CN003), som er rettet mot både PKG og CNGC, ble testet. Etter utvisning ved P5 ble behandlingsparadigmet beskrevet i figur 3A fulgt. Explant-kulturer ble fikset med 4% PFA ved P11 og forberedt på kryoseksjon (Figur 3A). For å vurdere celledød av histologiske seksjoner fra behandlede, ikke-behandlede (NT) og WT-prøver, ble det utført en terminal deoksynukleotidy transferase dUTP nick end merking (TUNEL) analyse22. Analysen av TUNEL-merkede celler viste en høy prosentandel av døende celler i ONL av rd1 ubehandlede prøver, mens CN003 beskyttet rd1 mus fotoreseptorer når de ble brukt i en konsentrasjon på 50 μM23 (Figur 3B).
En hyppig komplikasjon av diabetes er diabetisk retinopati, en blendende sykdom som er vanskelig å trofast reprodusere i dyremodeller5. Det andre eksemplet fremhever bruken av organotypiske retinal explant kulturer for å karakterisere retinal celle levedyktighet under forhold som etterligner type-2 diabetes mellitus (T2DM)24. Her brukte vi 20 mM av glykolysehemmeren 2-deoksy-glukose (2-DG)25 og administrerte den til kulturmediet i 24 timer fra P10 til P11. Vi viser at å utsette WT retinal explants til slike in vitro simulert diabetikere forhold fører til omfattende nevronal celle død av netthinnen (Figur 3C). Dette paradigmet kan da brukes for eksempel til å studere degenerative mekanismer eller for å teste retinobeskyttende behandlinger i en diabeteskontekst.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figur 3: To eksempler på anvendelser av organotypiske retinal explant kulturer. (A) Prosedyrebeskrivelse: Retina og RPE avledet fra rd1 eller WT dyr ble isolert på postnatal dag (P) 5 og dyrket som beskrevet ovenfor, med en middels endring hver 48 h. Ved P7 og P9 ble det brukte mediet kassert og fersk CM som inneholder aktiv forbindelse i en konsentrasjon på 50 μM ble tilsatt platen. Kulturer ble fikset med 4% PFA ved P11 og gråtosectioned. (B) Sammensatt testing på rd1 netthinne. Seksjoner ble innhentet fra WT, behandlet (003) og ikke-behandlede (NT) organotypiske retinal explant kulturer. TUNEL-analyse (rød) ble brukt som markør for celledød. Kjernefysisk farging med DAPI (blå). Kvantifiseringen vist i stolpediagrammet illustrerer prosentandelen av døende celler i WT-, rd1 NT- og rd1 003-tilstand. Behandling med sammensatte 003 reduserte rd1 fotoreseptorcelledød betydelig. (C) Simulering av type 2 diabetes mellitus (T2DM) på WT netthinne ved hjelp av 2-deoksy-glukose (2-DG) behandling. TUNEL-analysen ble utført på NT- og T2DM-prøver. Kvantifiseringen indikerer en svært betydelig økning i celledød. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren</a>
Tabell S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Klikk her for å laste ned tabellen</a>  
Tabell S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Klikk her for å laste ned tabellen</a>  
Tabell S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Klikk her for å laste ned tabellen</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Protokollen beskriver organotypiske utvisning av mus neuronetthinne, dyrket sammen med sin retinal pigment epitel (RPE), i R16 definert medium, fri for serum og antibiotika. Denne metoden er relativt enkel å utføre, billigere og tidkrevende sammenlignet med in vivo-eksperimenter, og kan tilpasses mange eksperimentelle applikasjoner.

Langsiktig, serumfri dyrking av organotypisk mus retina explants med intakt retinal pigment epitel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

En polert og forsterket tynnet-skalle Window for langsiktig Imaging av Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylær Avlesning av Long-term olfactory Tilpasning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

En isolert Semi-intakt Utarbeidelse av Mouse Vestibular Sensorisk Epitel for Electrophysiology og høy oppløsning To-foton mikroskopi

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsiktig Time Lapse Imaging av Mouse Cochlea eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agaroseplater Microchambers for Long-term Kalsium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbale Approach-subretinal Injeksjon av virale vektorer for genterapi i Mus retinal pigment epitelet

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generering og langvarig vedlikehold av nervefri<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...