Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Detta forskningsarbete fick ekonomiskt stöd från Europeiska unionen (transMed; H2020-MSCA-765441), det tyska forskningsrådet (DFG; PA1751/8-1, 10-1) och Kinas stipendieråd.

Djurprotokoll som överensstämmer med §4 i den tyska djurskyddslagen granskades och godkändes av Tübingens universitetskommitté för djurskydd (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registreringsnr AK02/19M). I denna studie erhölls näthinnedjur från vilda (WT) och rd1 möss, den senare är en väl karakteriserad modell för ärftlig retinal degeneration15. Möss var inrymda under vanlig vit cyklisk belysning, hade fri tillgång till mat och vatten och användes oavsett kön.
1. Checklista 
<ol><li>För att säkerställa sterila förhållanden och undvika föroreningar, rengör och desinficera den laminära luftflödeshuven med 70% etanol. Var noga med att låta etanolen avdunsta helt för att förhindra förgiftning av näthinnekulturerna.</li>
	<li>Autoklavverktyg (t.ex. sax, tång och oftalmisk mikroskopskrapande sked) före användning.</li>
	<li>Förbered följande media i förväg under en laminär flödeshuv, under sterila förhållanden: Basal R16 medium (BM) (kan lagras vid 4 °C i 4 veckor), BM med 20% fetalt kalvserum (FCS) (samma dag användning), BM med 20% fetalt kalvserum (FCS) (samma dag användning), BM med 0,12% proteinas K (44 mAnson U/mg) lösning (användning samma dag) och komplett R16 medium med kosttillskott (CM) enligt Romijn16 (kan förvaras vid 4 °C i 3 veckor) (se tabellerna S1, S2 och S3).</li>
	<li>Förvärm proteinas K-lösningen vid 37 °C för att aktivera den och använda den i steg 2.5.</li>
</ol>2. Förberedelse
<ol><li>Offra rd1/WT djur på postnatal dag (P) 5 genom halshuggning. För djur äldre än P11, använd CO2 och/eller livmoderhalsförskjutning enligt lokala djurskyddsbestämmelser.</li>
	<li>Beroende på djurets ålder öppnar du vid behov ögonlocken med tång och separerar noggrant ögonlocken innan du behöver enucleation, utan att röra eller skrapa ögat nedan.</li>
	<li>Förena snabbt ögonen under ett stereoskop med böjda tångar.</li>
	<li>Inkubera ögonen i BM i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Inkubera ögonen i förvärmd BM, med 0,12% proteinas K vid 37 °C i 15 min.</li>
	<li>Utför följande steg inuti en laminär luftflödeshuv för att säkerställa sterila förhållanden. För att inaktivera proteinas K, överför ögon till BM som innehåller 20% FCS och inkubera i 5 minuter på RT.</li>
	<li>Dissekera ögonen under ett stereoscope, aseptiskt, i en petriskål som innehåller färsk BM på RT. Initiera dissekeringen så snart som möjligt efter enucleationen. Ju längre den här tiden är, desto svårare är det att dissekera näthinnan, ögonen blir mycket mjuka.<ol>
<li>Håll ögat från synnerven med tång. Använd fin sax, gör ett litet snitt i hornhinnan och skapa 2 kanter från där hornhinnan, choroiden och sclera kan skalas försiktigt med 2 par fina tångar(bild 1 steg A-C). Alternativt kan du använda en smalspårig kanyl för att göra ett första snitt i hornhinnan och sedan sätta in ett av saxbladen i öppningen.</li>
		<li>Ta tag i linsen med fina tångar. Placera ett andra par tång vinkelrätt mot de första så att de första tångarna är mellan de 2 skaften i den andra. Dra för att extrahera linsen från ögonkoppen. Om glaskroppen och ciliarykroppen fortfarande är fästa vid näthinnan, ta bort dem försiktigt(bild 1 steg D). OBS: Steg 2.7.1 och 2.7.2 måste övas och se till att näthinnan inte skadas.</li>
		<li>Skär näthinnan vinkelrätt mot kanterna i fyra punkter och skapa en fyrklöverform(bild 1 steg E–F).</li>
		<li>Använd en pipett med brett skuren bas på en 1 ml spets, håll näthinnan i en hängande droppe medium och överför den till ett odlingsfilterskär placerat i en 6-brunns odlingsplatta. RPE-skiktet ska möta membranet(figur 1 steg G).</li>
		<li>Använd en pipett och ta försiktigt bort överflödigt medium från insatsen.</li>
		<li>Från brunnens sidor, tillsätt 1 ml CM per brunn och inkubera i en steril inkubator vid 37 °C med 5% CO2. Sänk inte näthinnan i mediet eftersom detta kommer att minska syresättningen och orsaka vävnadsdegeneration. Explanten bör förbli vid gränssnittet mellan vätska och luft, täckt endast av en tunn film av vätska som skapas av ytspänningen av vatten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lämna retinal explant ostört under de första 48 h för att underlätta återhämtning efter explantation förfarandet.</li>
	<li>Byt medium varannan dag (48 timmar). Kassera 700 μL medium från varje brunn och tillsätt 900 μL färsk CM till brunnen. På detta sätt återvinns mängden medium som förlorats av avdunstning och näthinnan explant håller några av de neuroprotektiva faktorer som producerats under de föregående 48 h.</li>
	<li>Inkubera det borttagna mediet i ett separat och slutet mikrocentrifugrör tillsammans med kulturerna för att kontrollera och utvärdera eventuell kontaminering (dvs. förändring i mediets färg). OBS: Retinal explanter kan hållas i kultur i minst 2 veckor12.</li>
</ol>3. Efter odling
OBS: Explanter kan användas för olika experimentella tillämpningar (western blot, histologi, hela fästen, genetisk analys, elektrofysiologi). Beroende på applikationen kan organotypiska retinal explanter snap frysas, lysas eller förberedas för kryosectioning. Stegen nedan beskriver histologiska preparat.
<ol><li>Utför en 45-minuters fixering med 4% paraformaldehyd (PFA), följt av gradvis sackaros cryoprotection (10% sackaros i 10 min, 20% i 20 min och 30% i 2 h vid rumstemperatur (RT) eller över natten (PÅ) vid 4 °C). Lägg till dessa buffertar direkt i brunnen.</li>
	<li>Skär membranet runt näthinnans explanter.</li>
	<li>Bädda in både membranet och näthinnevävnaden i mediet för frusen vävnad.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figur 1: Steg-för-steg-förfarande för beredning av organotypiska retinala explantkulturer. A)Musögonen är enucleated och överförs till en lösning av proteinas K för att möjliggöra separation av sclera och choroid från näthinnan och RPE. Ett litet snitt i sklera/ choroidskiktet introduceras. B)Två tångar används för att skala sklera/choroidskiktet. (C) Det svarta choroidskiktet kan ses under peelingen. Understrykning mörk retinal pigment epitel (RPE) förblir fäst vid ögongloben. Sclera och choroid avlägsnas tillsammans med synnerven. (D) Linsen och glaskroppen extraheras med tång.  Återstående ciliary kropp avlägsnas. ( E) Näthinnan behåller en skålliknande form. (F) För att platta näthinnan för odling i en skål görs 4 snitt på lika avstånd runt näthinnan med en sax, vilket ger den en klöverliknande form. Näthinnans kultur överförs till en membrankulturinsats i en 6-brunnsplatta med hjälp av en skuren 1 ml pipettspets. Näthinnan behåller fortfarande en del av skålformen. Men vid avlägsnande av överskottsvätskan som omger näthinnan kommer den att utvecklas till en planstruktur. (G) I odlingsmembraninställningen vilar näthinnans kultur på ett poröst polykarbonatmembran (PC) ovanpå en lösning av komplett R16-medium. För att säkerställa livskraft måste kulturen hållas i en fuktad steril inkubator vid 37 °C med 5 % CO2, och mediet bör bytas ut var 48:e <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">timme.</a>

Författarna har inget att avslöja.

Protokollet som presenteras beskriver organotypiska explant kulturer av mus näthinnan med intakt RPE i definierade R16 medium, fria från serum och antibiotika. Detta protokoll utvecklades ursprungligen från slutet av 1980-talet7,28 och sedan dess har det kontinuerligt förfinats6,11,12. Anmärkningsvärda tillämpningar inkluderar studier av mekanismerna för ärftlig retinal degeneration och identifiering av retinoprotektivaläkemedel 23,29,30.
För ett framgångsrikt experiment måste vissa viktiga överväganden beaktas. Här är några viktiga felsökningspunkter som hjälper till att förbättra kvaliteten på kulturer. För det första kan näthinnekulturerna uppvisa överdriven vikning och/eller rosettbildning31. Detta kan orsakas genom att röra näthinnan med en tång under explanteringsproceduren. Dessutom måste ciliary kroppen helt avlägsnas från explanten, eftersom detta kan öka näthinnans vikning under kulturen. För det andra, under överföringen av näthinnan till brunnsplattan i en hängande droppe, om näthinnan vetter mot membranet på fel sida ner, håll den i droppen hängande från pipettspetsen och tryck försiktigt mediet in och ut ur spetsen (utan att lossa den hängande droppen) för att vända näthinnan runt. Slutligen, om RPE förblir fäst vid sclera och lossnar från näthinnan, orsakas det sannolikt av en otillräcklig predigestion av sclera. Detta problem kan vara särskilt viktigt när man arbetar med ögon från äldre djur eller icke-gnagare (t.ex. grisar) och kan lösas genom att öka proteinas K-koncentrationen.
Att genomföra organotypiska retinala explantkulturer är ett komplext förfarande som kräver adekvat utbildning och erfarenhet. Brist på utbildning kan leda till variation i kvaliteten på retinal explanterna. Av dessa skäl är det viktigt att övervaka och verifiera livskraft och reproducerbarhet, vilket till exempel kännetecknar celldödshastigheten med TUNEL-analysen. Användningen av ett antibiotikafritt medium gör retinal explanterna sårbara för kontaminering av bakterier och svampar. För att minimera denna risk rekommenderar vi att särskild försiktighet vidtas för att arbeta under verkligt aseptiska förhållanden. En annan begränsning av in vitro retinal odling är skillnader i fysiokemisk miljö jämfört med in vivo näthinnan (t.ex. choroidal och näthinneblodtillförsel, syre och glukosnivåer, intraokulärt tryck, sammansättning av glaskroppen). Ett kontinuerligt perfusionssystem, kanske inbäddat i en dedikerad bioreaktor32, kan göra denna modell närmare in vivo-tillståndet. Dessutom kommer axotomin hos synnerven under retinal dissekering att leda till ganglioncelldöd, som kan inducerastressresponser 8. Därför rekommenderas att explanten lämnas att anpassa sig till odlingsförhållandena i minst 2 dagar in vitro innan den utsätts för en specifik manipulering eller behandling.
Den beskrivna metoden utförs vanligtvis på omogna näthinnevävnader, som kan överleva bra i 4 veckor in vitro7,33. Förfarandet är dock skräddarsytt för en mängd olika tillämpningar, inklusive odling av vuxen näthinna. Även om olika publicerade metoder beskriver isoleringen av den vuxna näthinnan utan dess RPE34,35, inkubationen med papainlösning i upp till 1 h vid 37 °C före dissekering tillåter RPE att förbli fäst vid näthinnan även när den härrör från en vuxen mus36.
Det serumfria mediet och den kemiskt definierade in vitro-miljön föreskriver en helt definierad och reproducerbar manipulering av försöksbetingelseförhållandena. Därför är organotypiska retinal explant kulturer värdefulla verktyg inom området oftalmologi och neurovetenskap, och har använts för att studera retinal sjukdomar37,näthinnan utveckling38,39,näthinnan stamcellsterapi40,genetiska modifieringar41, och farmakologisk screening. Som ett specifikt exempel på drogtester använde vi här retinala explantkulturer för att testa en cGMP-analog (CN003), känd för att minska fotoreceptorcelldöden i djurmodeller för ärftlig näthinnesjukdom23 (Figur 3B). En annan möjlig tillämpning av tekniken beskrivs i figur 3C, som illustrerar hur den exakta kontrollen av vävnadsmiljön kan utnyttjas för att efterlikna diabetesförhållanden24. På grund av bevarandet av vävnadsarkitektur under hela odlingsperioden är organotypiska retinal explant kulturer också lämpliga för elektrofysiologiska studier. Neuronal funktionalitet på retinal explanter har undersökts med patch-clamp inspelning42 och multi-electrode-array (MEA) inspelning33,43. Den senare tillåter registrering av elektrisk aktivitet av neuronala populationer samtidigt och har utnyttjats för att karakterisera fotoreceptor och ganglion cell funktionalitet i kulturförhållanden. I ett bredare perspektiv kan de organotypiska explantkultursystemen också tillämpas i preklinisk forskning, där explantkulturer användes för att testa den terapeutiska effekten av hypotermi44.
Den organotypiska explantodlingstekniken är relativt enkel att utföra och, jämfört med motsvarande in vivo-experiment, är billigare och tidskrävande och undviker de etiska problemen relaterade till levande djurstudier. Den exakta kontrollen över experimentella förhållanden och bevarandet av RPE och vävnadskomplexitet gör metoden till ett värdefullt verktyg för att förbättra vår kunskap om näthinnefysiologi och patofysiologi och möjliggöra många experimentella tillämpningar.

I oftalmisk forskning finns en mängd olika modeller tillgängliga för att studera näthinnan, inklusive primära näthinnecellkulturer, näthinnan-härledda cellinjer, näthinneorganoider och in vivo-djurmodeller 1,2,3,4,5. Men var och en av dessa modeller lider av nackdelar. Till exempel växer celler isolerat medan näthinnan är ett komplext nätverk med en mängd cell-till-cell-interaktioner. Således är beteendet hos isolerade cellkulturer sannolikt artificiellt jämfört med det som observerats i en hel vävnad. Detta problem kan delvis åtgärdas med hjälp av in vitro differentierade retinal organoider, som kan användas för att studera utveckling och grundläggandebiologi 6. Men från och med idag är retinal organoidgeneration fortfarande tidskrävande, arbetsintensiv och lider av reproducerbarhetsproblem, vilket kräver betydande ytterligare utvecklingsarbete innan organoider kan användas för translationell näthinneforskning. Slutligen är studier på levande djur, även om modellen som kommer närmast kraven på oftalmisk forskning, förknippad med starka etiska problem. En bra kompromiss mellan cellkultursystemens effektivitet och den verkliga situationen för in vivo-djurmodeller är organotypiska retinala explantkulturer. Sådana kulturer minskar också djurs lidande eftersom inga in vivo-interventioner utförs.
Flera metoder har beskrivits för odling av retinal explanter från olika arter5,7,8. Vårt protokoll beskriver en teknik för isolering av musen neuroretina tillsammans med dess retinal pigment epitel (RPE). Denna teknik kommer också att vara lämplig för rått retinal kulturer9. Neuroretinakulturen tillsammans med dess RPE är av stor betydelse för framgång. RPE utför väsentliga funktioner för näthinnan: transport av näringsämnen, joner, vatten, absorption av ljus och skydd mot fotooxidation, re-isomerisering av all-trans-retinal till 11-cis-retinal, vilket är avgörande för den visuella cykeln, faagocytos av skjulfotoreceptormembran och utsöndring av väsentliga faktorer för näthinnans strukturella integritet10. Underhåll av RPE möjliggör en framgångsrik utveckling av fotoreceptorns yttre och inre segment, vilket håller näthinnan livskraftig under en längre tid11. Förfarandet som beskrivs nedan bevarar näthinnans histotypiska och fysiologiska egenskaper under minst två veckor12. Dessutom undviker odling av organotypiska retinala explanter i serumfritt, antibiotikafritt medium förekomsten av okända ämnen och möjliggör en enkel tolkning av resultaten12.
Organotypiska retinal explant kulturer har varit avgörande för att förbättra vår kunskap om retinal utveckling och degeneration7,13,14. Vi visar här att de också är ett användbart verktyg för farmakologisk screening och att de kan användas för att modellera en mängd olika näthinnesjukdomar, inklusive diabetes retinopati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Inom oftalmisk forskning finns det ett starkt behov av in vitro-modeller av neuroretina. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för organotypisk odling av mus neuronäthinnan med intakt retinal pigment epitel (RPE). Beroende på forskningsfrågan kan näthinnedjur isoleras från vilda djur eller från sjukdomsmodeller, för att studera till exempel diabetiker retinopati eller ärftlig retinal degeneration. Ögon från tidig postnatal dag 2-9 djur är enucleated under aseptiska förhållanden. De smälts delvis i proteinas K för att möjliggöra en avlossning av choroiden från RPE. Under stereoskopet görs ett litet snitt i hornhinnan som skapar två kanter varifrån choroid och sclera försiktigt kan skalas av från RPE och neuroretina. Linsen avlägsnas sedan, och ögonkoppen skärs i fyra punkter för att ge den en fyrakilad form som liknar ett klöverblad. Vävnaden överförs slutligen i en hängande droppe i en cellkulturinsättning som håller ett polykarbonatodlingsmembran. Kulturerna upprätthålls sedan i R16 medium, utan serum eller antibiotika, under helt definierade förhållanden, med en medelförändring varannan dag.
Förfarandet beskrivs möjliggör isolering av näthinnan och bevarandet av dess normala fysiologiska och histotypiska sammanhang för odling perioder på minst 2 veckor. Dessa funktioner gör organotypiska retinal explant kulturer en utmärkt modell med högt prediktivt värde, för studier i retinal utveckling, sjukdom mekanismer och elektrofysiologi, samtidigt som möjliggör farmakologisk screening.

Efter att ha följt protokollet bevarar dissekerade och odlade retinala explanter sin normala vävnadsarkitektur, med distinkta lager, från RPE till ganglioncellskiktet (GCL), som visas i figur 2. Yttre nukleära skikt (ONL) och inre nukleära skikt (INL) storlek förblev mestadels stabil i 2-3 veckor, med en långsamt framskridande cell förlust och gradvis gallring av dessa lager blir mer och mer uppenbart om odlingsperioden förlängs till 4 veckor och därefter. I GCL, däremot, på grund av axotomy av optik nerv, observeras en markant gallring vanligtvis inom de första 4 dagarna av odling. Därefter kommer den återstående cellpopulationen i GCL (mestadels fördrivna amacrine celler) att fortsätta att vara livskraftig i ytterligare 3-4 veckor17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figur 2: Celltyper som finns i näthinnans explantkultur. Retinal explant kultur vid P11 härrör från rd1 mutant(A) och WT djur(B) visar nukleär färgning med DAPI (vänster, blå), stång fotoreceptorer (mitten, röd) och Müller celler (höger, grön). Nukleär färgning belyser alla de stora cellulära lagren av näthinnan såsom näthinnepigmentepitetel (RPE), yttre nukleärskikt (ONL), inre kärnskikt (INL) och ganglioncellskikt (GCL). Specifika celltyper i nukleära skikt, såsom stavar och Müllerceller, är immunolabeled med alfa arrestin26 och glutamin syntas27 antikroppar, respektive. (C) Visar hel längd avsnitt av en hel   rd1 mus näthinnan, med DAPI färgning som belyser konsistensen, integrationen och utvecklingen av näthinnan. Dessa näthinner odlades i 6 dagar. Förfarandebeskrivning: Näthinnan och RPE som härrör från rd1- eller WT-djur isolerades vid P5 och odlades enligt beskrivningen i protokollet, fram till P11 med en medelförändring var 48: e timme. Kulturer fixades med 4% PFA på P11 och cryosectioned. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren</a>
Serumfritt medium och den ihållande in vitro-miljön gör det möjligt att ha full kontroll över försöksförhållandena. Här ger vi två exempel på specifika tillämpningar av detta protokoll. Det första exemplet illustrerar möjligheten att använda retinala explanter för drogtestning eller screening. Organotypiska retinal explant kulturer utarbetades från vilda typ (WT) och rd1 mus modeller. Den senare är en väl karakteriserad modell för retinal degeneration15. I rd1 mus näthinnan utlöses ONL degeneration av onormalt höga nivåer av cGMP i stång fotoreceptorer6,20. Överdriven cGMP orsakar ökad aktivitet hos cyklisk nukleotid gated jonkanaler (CNGCs) och cGMP-beroende proteinkinas (PKG), vilket leder till celldöd21. Behandling av rd1 mus näthinnor med en strukturell analog till cGMP (cyklisk nukleotid #3; CN003), som riktar sig till både PKG och CNGC, testades. Efter explantation på P5 följdes behandlingsparadigmet som beskrivs i figur 3A. Explantkulturer fixades med 4% PFA på P11 och förbereddes för kryosectioning (Figur 3A). För att bedöma celldöden av histologiska avsnitt från behandlade, icke-behandlade (NT) och WT exemplar utfördes en terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) analys22. Analysen av TUNEL-märkta celler visade en hög andel döende celler i ONL för de obehandlade exemplaren rd1, medan CN003 skyddade rd1-musfotoreceptorer när de applicerades vid en koncentration av 50 μM23 (figur 3B). 
En frekvent komplikation av diabetes är diabetes retinopati, en bländande sjukdom som är svår att troget reproducera i djurmodeller5. Det andra exemplet belyser användningen av organotypiska retinala explant kulturer för att karakterisera retinal cell livskraft under förhållanden som emulerar typ-2 diabetes mellitus (T2DM)24. Här använde vi 20 mM av glykolyshämmaren 2-deoxy-glukos (2-DG)25 och administrerade den till odlingsmediet i 24 timmar från P10 till P11. Vi visar att utsätta WT näthinnan explanter för sådana in vitro simulerade diabetiker villkor leder till omfattande neuronal cell död av näthinnan (Figur 3C). Detta paradigm kan då användas för att till exempel studera degenerativa mekanismer eller testa retinoprotektiva behandlingar i diabetessammanhang.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figur 3: Två exempel på tillämpningar av organotypiska näthinneexplantakulturer. (A) Förfarandebeskrivning: Näthinnan och RPE som härrör från rd1- eller WT-djur isolerades efter nataldagen (P) 5 och odlades enligt beskrivningen ovan, med en medelstor förändring var 48: e timme. Vid P7 och P9 kasserades det använda mediet och färsk CM innehållande aktiv förening vid en koncentration av 50 μM tillsattes plattan. Kulturer fixades med 4% PFA på P11 och cryosectioned. B)Sammansatt testning på näthinnan rd1. Avsnitt erhölls från WT, behandlades (003) och icke-behandlade (NT) organotypiska retinal explant kulturer. TUNEL-analys (röd) användes som markör för celldöd. Kärnfärgning med DAPI (blå). Kvantifieringen som visas i stapeldiagrammet illustrerar procentandelarna döende celler i WT-, rd1 NT- och rd1 003-tillstånd. Behandling med förening 003 avsevärt minskade rd1 photoreceptor cell död. (C) Simulering av typ 2 diabetes mellitus (T2DM) på WT näthinnan med 2-deoxy-glukos (2-DG) behandling. TUNEL-analys utfördes på NT- och T2DM-prover. Kvantifieringen tyder på en mycket betydande ökning av celldöden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren</a>
Bord S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Klicka här för att ladda ner tabellen</a>  
Bord S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Klicka här för att ladda ner tabellen</a>  
Bord S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Klicka här för att ladda ner tabellen</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Protokollet beskriver organotypiska explanter av mus neuronäthinnan, odlas tillsammans med dess retinal pigment epitel (RPE), i R16 definierade medium, fria från serum och antibiotika. Denna metod är relativt enkel att utföra, billigare och tidskrävande jämfört med in vivo-experiment, och kan anpassas till många experimentella applikationer.

Långsiktig, serumfri odling av organotypiska musreta explanter med intakt retinalpigmentepitetel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Experimentella modeller för studier av näthinnan pigmentepitel fysiologi och patofysiologi

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Organotypic Kultur av full tjocklek vuxna svin Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

En polerad och förstärkt Gallrad-skalle Fönster för långsiktig Imaging för mus Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylär Avläsning av långsiktigt Olfactory anpassning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

En isolerad Semi-intakt Beredning av Mouse Vestibular sensoriska epitelet för elektrofysiologi och Högupplöst Två-foton mikroskopi

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Långsiktig Time Lapse avbildning av Mouse Cochlear Explantat

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers för Långsiktig Kalcium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbal Approach-subretinal Injektion av virala vektorer för genterapi hos möss retinal pigmentepitel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generering och långvarigt underhåll av nervfria<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...