Name: label-free imaging of lipid storage dynamics in caenorhabditis elegans using stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-05-28T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) e dall'investigatore HHMI (M.C.W.). Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) per i ceppi di C. elegans.

1. Configurazione strumentale per microscopia a dispersione Raman stimolata
NOTA: Il sistema di microscopia SRS è costruito su un laser a picosecondi con oscillatore parametrico ottico integrato della pompa e un microscopio a scansione laser confocale. L'oscillatore fornisce due treni a impulsi picosecondi, tra cui un fascio stokes a 1.064 nm e un fascio di pompaggio toniere tra 700-990 nm. La sovrapposizione temporale e spaziale dei due fasci si ottiene all'interno del laser. Un modulatore ele...

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In difesa contro l'obesità e i suoi disturbi metabolici associati, sono stati implementati importanti sforzi di ricerca per comprendere meglio i meccanismi regolatori dell'omeostasi lipidica. Per il rilevamento quantitativo di molecole lipidiche in campioni biologici, l'imaging senza etichette mediante microscopia SRS si è dimostrato un'alternativa affidabile ai saggi biochimici e ad altri metodi di colorazione. Il nostro gruppo e altri hanno rivelato nuovi meccanismi biologici nella regolazione metabolica lipidica com...

L'obesità è diventata un problema di salute globale che minaccia un terzo della popolazione in tutto il mondo e presenta una seria preoccupazione medica, data la sua associazione con la cattivasalute mentale 1 e le malattie mortali tra cui diabete2, malattiecardiovascolari 3 e alcuni tipi dicancro 4. Lo studio del metabolismo lipidico è essenziale per comprendere meglio i problemi biologici alla base dell'obesità. Una quantificazione rapida e specifica dell'immagazzinamento lipidico comporta l'individuazione degli acidi grassi e dei loro derivati, nonché dei metaboliti contenenti steroli, ad alta sensibilità e preferibilmente con informazioni spaziali. I lipidi sono obiettivi impegnativi da identificare perché mancano di fluorescenza intrinseca e non possono essere facilmente etichettati fluorescentmente. I tag fluorescenti sono spesso più grandi delle molecole lipidiche e, pertanto, possono essere chimicamente invasivi e impraticabili per applicazioni in vivo. La strategia di etichettatura senza etichette o minima è necessaria per preservare la struttura idrofobica delle molecole lipidiche5. I recenti sviluppi nelle tecnologie di imaging hanno creato interessanti opportunità per l'imaging senza etichette di lipidi in cellule viventi, tessuti e organismi.
Gli approcci tradizionali per le analisi di conservazione lipidica in campioni biologici includono saggi biochimici e protocolli di colorazione con coloranti lipofili. I test biochimici di quantificazione che coinvolgono la spettrometria di massa (SM) non hanno eguali nella loro risolvibilità molecolare, ma richiedono quantità di campioni molto grandi e la preparazione del campione di solito richiede diverse ore, limitando la loro applicazione per l'imaging in tempo reale dei sistemiviventi 5. Un'altra importante limitazione di questi saggi è la mancanza di informazioni spaziali. D'altra parte, i coloranti lipofili come Oil Red O e Sudan Black forniscono la distribuzione tissutale e cellulare degli organelli di stoccaggio lipidico e rispetto alle tecniche MS, questi metodi di colorazione sono anche a basso costo e facili da eseguire. Tuttavia, questi protocolli di colorazione richiedono una fissazione, che può influire sulla natura idrofobica delle goccioline lipidiche, generare cambiamenti artificiali nella loro struttura e causare incongruenze tra gliesperimenti 6. Le difficoltà tecniche associate alle tecniche biochimiche e di colorazione hanno portato alla ricerca di metodi senza etichette per l'immagine delle molecole lipidiche e al rapido aumento dell'uso di microscopia a dispersione Raman coerente (CRS) nell'imaging lipidico.
L'effetto Raman è stato riconosciuto per la prima volta da Raman e Krishnan, dove hanno riferito che dopo aver interagito con un fotone, una molecola può generare luce diffusa senza alcun cambiamento di lunghezza d'onda (chiamata scattering Rayleigh) o raramente con una lunghezza d'onda alterata (chiamata scattering Raman) e questo cambiamento di lunghezza d'onda è caratteristico dei gruppi chimici funzionali all'internodella molecola 7. Quando i legami chimici all'interno di una molecola si eccitano ad un livello di energia vibrazionale più elevato da un fotone incidente, chiamato fotone della pompa, l'energia del fotone sparso, chiamato fotone di Stokes, diventa più bassa. Altrimenti, i legami chimici possono raggiungere un livello di energia vibrazionale inferiore se sono originariamente ad un livello superiore, e il fotone sparso guadagna energia per essere il fotone anti-Stokes. La differenza di frequenza tra l'incidente e i fotoni sparsi è nota come spostamento di Raman. Ogni legame chimico all'interno di una molecola ha uno spostamento raman caratteristico e quantificabile. Ad esempio, il legame CH2 ha uno spostamento Raman di 2.845 cm-1, che è abbondante nelle catene di acidi grassi8. Questo segnale Raman spontaneo è generalmente molto debole, il che ha ampiamente limitato la velocità di imaging nella microscopia spontanea raman convenzionale. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati vari approcci per aumentare la velocità di imaging e la sensibilità della microscopia spontanea Raman. La microscopia a dispersione Raman coerente, inclusa la microscopia cars (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) e la microscopia SRS (Stimulated Raman Scattering), è il progresso più recente. CARS e SRS hanno principi di lavoro leggermente diversi, ma entrambi sono tecniche senza etichette che hanno capacità di imaging dal vivo, possono fornire informazioni spaziali e temporali sulla dinamica di conservazione lipidica e richiedono solo piccole dimensioni del campione. La microscopia CARS soffre di background non risonante, che proviene da vari processi non lineari, e i segnali CARS hanno anche una relazione non lineare con la concentrazione della molecola, che insieme complicano il processo diquantificazione 9. A differenza della microscopia CARS, la microscopia SRS non genera segnali di fondo non risonanti e offre una dipendenza lineare dalla concentrazione della molecola di interesse. Pertanto, attualmente la microscopia SRS è più ampiamente utilizzata per l'imaging lipidico.
Nella microscopia SRS, i deboli segnali spontanei Raman possono essere amplificati quando eccitati da due raggi laser sincronizzati con la loro differenza di frequenza corrispondente alla frequenza vibrazionale del legame chimico. La molecola sperimenterà una transizione migliorata verso uno stato eccitato a causa di un'eccitazione coerente. Di conseguenza, il tasso di generazione di fotoni Stokes viene aumentato. Di conseguenza, l'intensità del fascio "Stokes" trasmesso aumenta (guadagno raman stimolato, SRG) e l'intensità del fascio "pompa" trasmesso diminuisce (perdita raman stimolata, SRL). Il rilevamento dei segnali SRG o SRL è alla base dell'imaging della microscopia Stimulated Raman Scattering (SRS) di molecole con specifici legami chimici10. Se la differenza di frequenza tra i due raggi laser non corrisponde alla frequenza vibrazionale del legame chimico all'interno di una molecola di interesse, non verranno generati né segnali SRG né SRL. La velocità di imaging della microscopia SRS è di circa 2 μsec per pixel o 1 secondo per fotogramma, che è molto più veloce della microscopia ramanspontanea 11. La risoluzione laterale tipica per la microscopia SRS è limitata alla diffrazione e a circa 300 nm. Inoltre, i processi ottici a due fotoni della microscopia SRS consentono l'imaging 3D volumetrico di campioni di tessuto spesso relativo e la profondità di imaging potrebbe raggiungere i 300-500 μm. Nel complesso, la microscopia SRS presenta una tecnica di imaging efficiente e priva di etichette per rilevare biomolecole specifiche, in particolare lipidi.
Le goccioline lipidiche sono organelli a membrana singola, che sono il principale sito di stoccaggio cellulare per lipidi neutri, compresi i triacilgilceroli (TAGs) e gli esteri del colesterolo (CE). I legami CH2 nelle catene di acidi grassi di queste molecole lipidiche generano forti segnali SRS a 2.845 cm-1 quando eccitati8,consentendo così il rilevamento e la quantificazione dei livelli lipidici di stoccaggio in cellule intatte, sezioni tissutali e persino organismiinteri 12,13,14,15. In particolare, i C. elegans sono utili per gli studi di imaging lipidico grazie alla loro trasparenza. Come i mammiferi, anche i C. elegans immagazzinano lipidi nelle goccioline lipidiche e le vie di sintesi e degradazione delle molecole lipidiche sono altamente conservate16. In questo protocollo, forniremo il principio di funzionamento della microscopia SRS, la sua configurazione fondamentale e descriveremo i metodi per il suo utilizzo nell'imaging lipidico in C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Analog Unit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>3119</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A4</td>
			<td>For mounting the tool on scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - target</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VRC2SM1</td>
			<td>For viewing IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td>Length can vary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator (Optional)</td>
			<td>APE</td>
			<td>pulseCheck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz</td>
			<td>For signal with modulation frequency filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>For handling and picking worms for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44010</td>
			<td>Used for calibration of the SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>890/220 CARS</td>
			<td>For removing Stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose laboratory labeling tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>For covering worms for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>L1: AC254-050-B 
			L2: AC254-075-B</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowpass filter</td>
			<td>minicircuits</td>
			<td>BLP-1.9+</td>
			<td>For power supply noise suppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E03</td>
			<td>For relay and periscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>TEKPOWER</td>
			<td>TP1342U</td>
			<td>For photodiode, reversed 50V voltage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For anaesthesizing the worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm picker</td>
			<td>WormStuff</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of lipid storage dynamics in caenorhabditis elegans using stimulated raman scattering microscopy

Il metabolismo lipidico è un processo fisiologico fondamentale necessario per la salute cellulare e dell'organismo. La disregolazione del metabolismo lipidico spesso provoca obesità e molte malattie associate tra cui disturbi cardiovascolari, diabete di tipo II e cancro. Per far progredire l'attuale comprensione della regolazione metabolica lipidica, i metodi quantitativi per misurare con precisione i livelli di conservazione lipidica in vivo nel tempo e nello spazio sono diventati sempre più importanti e utili. Gli approcci tradizionali per analizzare la conservazione lipidica sono semi-quantitativi per la valutazione microscopica o mancano di informazioni spazio-temporali per la misurazione biochimica. La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico senza etichette che consente il rilevamento rapido e quantitativo dei lipidi nelle cellule vive con una risoluzione subcellulare. Poiché il contrasto è sfruttato dalle vibrazioni molecolari intrinseche, la microscopia SRS consente anche il tracciamento quadridimensionale dei lipidi negli animali vivi. Nell'ultimo decennio, la microscopia SRS è stata ampiamente utilizzata per l'imaging di piccole molecole nella ricerca biomedica e ha superato i principali limiti dei metodi convenzionali di colorazione fluorescente e di estrazione lipidica. In laboratorio, abbiamo combinato la microscopia SRS con gli strumenti genetici e biochimici a disposizione del potente organismo modello, Caenorhabditis elegans, per indagare la distribuzione e l'eterogeneità delle goccioline lipidiche tra diverse cellule e tessuti e, in ultima analisi, per scoprire nuove vie di segnalazione conservate che modulano il metabolismo lipidico. Qui, presentiamo i principi di lavoro e la configurazione dettagliata del microscopio SRS e forniamo metodi per il suo utilizzo nella quantificazione della conservazione lipidica in distinti punti di tempo di sviluppo di tipo selvaggio e insulina segnalando c. elegansmutanti carenti.

La segnalazione dell'insulina è un'importante via endocrina che influisce sullo sviluppo, la riproduzione, la durata della vita e il metabolismo. Nei vermi, la segnalazione dell'insulina consiste di circa 40 ligandi peptidici insulino-simili, ortologo del recettore del fattore di crescita insulino-simile DAF-2, cascata pi3K / AKT chinasi a valle e ortologo del fattore di trascrizione FoxO, DAF-1620. I mutanti daf-2, che mancano del recettore dell'insulina, hanno più goccioline lipidiche...

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Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) consente l'imaging selettivo e privo di etichette di specifiche moieties chimiche ed è stata efficacemente utilizzata per l'immagine di molecole lipidiche in vivo. Qui, forniamo una breve introduzione al principio della microscopia SRS e descriviamo i metodi per il suo uso nella conservazione lipidica di imaging in Caenorhabditis elegans.

Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

La microscopia a dispersione Raman stimolata è una tecnologia di imaging chimico che consente il rilevamento rapido e quantitativo dei lipidi e consente il tracciamento dei lipidi negli animali vivi in modo privo di etichette. Il vantaggio più importante della microscopia SRS rispetto alle tradizionali tecniche di rilevamento lipidico è che è privo di etichette e quindi non è sostenibile per lo sbiancamento fotografico come altre questioni di fluorescenza e colorazione. L'uso della microscopia SRS in combinazione con gli strumenti genetici e biochimici disponibili per gli organismi modello, in particolare Caenorhabditis elegans fornisce un potente quadro per lo studio dei normali regolatori della biologia lipidica e del metabolismo.Per alimentare i raggi laser nel microscopio SRS, in primo luogo, impostare il periscopio per sollevare il fascio da un'uscita sorgente luminosa picoseconda alla porta di ingresso laser a infrarossi sullo scanner del microscopio e aprire il software di controllo laser per avviare i laser. Abbassare la potenza laser della pompa a 50 milliwatt e impostare il segnale della pompa su 750 nanometri. Utilizzare un espansore di travi per regolare il diametro del fascio per adattarsi all'apertura posteriore degli obiettivi del microscopio.Utilizzare due specchi a relè, M1 e M2, per guidare il raggio laser verso il periscopio e impostare i cenni del periscopio al centro della gamma di sintonizzazione. Selezionare la posizione iniziale e l'angolo di ogni specchio in modo che il raggio laser colpisca approssimativamente il centro dello specchio per lanciare il fascio al microscopio e utilizzare una porta vuota sulla torretta oggettiva del microscopio per eseguire l'allineamento del percorso. Posizionare la sonda del misuratore di potenza sulla porta obiettivo per misurare la potenza della luce trasmessa e impostare lo scanner del microscopio allo zoom più alto, 50X.Misurare la potenza della luce trasmessa con il punto del raggio laser focalizzato e ottimizzare le manopole degli specchi M1 e M2 in modo iterativo per ottenere la massima potenza laser trasmessa. Utilizzare lo strumento di allineamento per eseguire l'allineamento fine della luce trasmessa per assicurarsi che la luce passi attraverso il centro dell'obiettivo e posizionare il tappo di allineamento del bersaglio a fluorescenza sul sedile obiettivo vuoto. Regolare le manopole del primo specchio sterzante, M1, per centrare il punto del raggio laser e introdurre il tubo di estensione con il tappo di allineamento sull'altra estremità a un sedile obiettivo vuoto per il monitoraggio del punto del raggio laser.Quindi, sintonizzare le manopole del secondo specchio sterzante, M2, per centrare nuovamente il punto del raggio laser sull'altra estremità del tubo di estensione. Per impostare il modulo di rilevamento SRS, posizionare un cubo di splitter del fascio dopo il condensatore per dirigere il laser trasmesso al modulo diodo fotografico. Per impostare la connessione elettronica, utilizzare un modulatore elettroottico integrato a 20 megahertz all'interno del laser sintonizzabile picosecondo per modulare l'intensità del fascio Stokes e alimentare il segnale di uscita del diodo fotografico nell'amplificatore lock-in per la demodulazione della perdita raman stimolata.Quindi, alimentare l'uscita dell'amplificatore lock-in nella scatola analogica del microscopio per convertire il segnale analogico elettrico in un segnale digitale. Per ottimizzare le condizioni di imaging, aggiungere cinque microlitri di acido oleico a una camera scorrevole mini microscopio e coprire il campione con uno slittamento di copertura. Posizionare il campione sullo stadio del microscopio e utilizzare il bordo del pad per individuare e mettere a fuoco la goccia.Regolare il condensatore per l'illuminazione Kohler e utilizzare una scheda sensore a infrarossi e un visualizzatore a infrarossi per verificare se il percorso del fascio della pompa è ancora corretto. Verificare che lo stadio di ritardo sia impostato su zero femtosecondi e impostare la lunghezza d'onda del fascio della pompa su 795,8 nanometri. Impostare la potenza del fascio della pompa su 50 milliwatt e impostare il fascio stoke su 100 milliwatt.Aprire l'otturatore sia per le travi, sia per l'otturatore principale del laser. Scansiona l'esempio e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Modificare la modalità di visualizzazione su alta bassa e regolare l'intervallo per visualizzare una saturazione di circa il 50%.Verificare se la saturazione è centrata nell'immagine, regolando attentamente gli specchietti retrovisori all'interno del sistema laser sintonizzabile picosecondi per una sovrapposizione ottimizzata della pompa e dello Stokes per massimizzare l'intensità dell'immagine e centrare l'intensità di picco se necessario. Prima di ogni sessione di imaging, aggiungere 100 microlitri di agarosio caldo al 2% a uno scivolo di vetro pulito posizionato tra diapositive di supporto con due strati di nastro da laboratorio e posizionare rapidamente una seconda diapositiva sopra la prima diapositiva. Pressato delicatamente per creare un tampone di agarosio sottile, uniforme e lasciare raffreddare l'agarosio.Per montare i vermi per l'imaging, posizionare una goccia da quattro a cinque microliter di agente anestetico per 10-20 vermi su uno slittamento di copertura e utilizzare un microscopio a dissezione per raccogliere i vermi da immaginare, posizionando i vermi sulla goccia di anestesia mentre vengono raccolti. Quando tutti i vermi sono stati raccolti, coprire i vermi con lo scivolo di vetro con il tampone di agarosio. Per l'imaging, montare il campione di verme con lo slittamento di copertura rivolto verso l'obiettivo e dirigere la sorgente luminosa di luce sul campo verso l'oculare per individuare i vermi.Portare i vermi a fuoco e regolare la posizione del condensatore di conseguenza. Regola i poteri laser impostando la potenza laser della pompa su 200 milliwatt e la potenza IR a 400 milliwatt. Impostare l'amplificatore lock-in per la demodulazione del segnale SRS del worm.Inizia a scansionare il primo worm a una velocità di scansione rapida, regolando la messa a fuoco fine per trovare l'area di interesse. Quando il segnale è stato ottimizzato, passare a una velocità di scansione più lenta e a una risoluzione dei pixel più elevata per ottenere l'immagine SRS e salvare l'immagine in un formato che consente un'alta risoluzione. Una volta che tutti i campioni sono stati vengono vengonoPer analizzare le immagini, aprite i file in ImageJ e selezionate analizza e impostate le misure per selezionare le proprietà da analizzare. Utilizzare lo strumento di selezione poligonale per delineare la regione dell'intestino verme da quantificare e fare clic su analizza e misura di nuovo. Le misurazioni appariranno nella finestra dei risultati.Una volta delineati tutti i worm, copiare e incollare le misure per ciascuno dei worm in un determinato genotipo in un foglio di calcolo. Per il valore di misurazione dello sfondo, selezionare un'area in prossimità del worm che non dispone di alcun segnale SRS e sottrarre il valore grigio medio di sfondo dalla misurazione per ogni singolo worm per calcolare la deviazione media e standard dello sfondo sottratto valori grigi medi da tutti i worm in un determinato genotipo o gruppo di test. Questi valori possono quindi essere normalizzati alla media del gruppo di controllo.In questa analisi rappresentativa, i livelli lipidici intestinali nei vermi di tipo selvatico sincronizzati con l'età e nei mutanti daf-2 privi del recettore dell'insulina sono stati quantificati durante l'età adulta. Come previsto, si osserva un calo dei livelli lipidici nei vermi di tipo selvatico, a partire dal primo giorno e continuando fino al primo giorno di età adulta. I livelli lipidici nei mutanti daf-2, tuttavia, aumentano fino a quando non hanno cinque giorni, a quel punto rimangono costanti a circa 2,5-tre volte più alti del tipo selvatico.L'inattivazione daf-16 sopprime l'aumento dei livelli lipidici dei mutanti daf-2. Espressione dell'isoforma daf-16a a o daf-16b nei daf-2, i doppi mutanti daf-16 non ripristinano i livelli lipidici. L'espressione dell'isoforma daf-16d/f/h, tuttavia, è sufficiente per ripristinare i livelli lipidici nei singoli mutanti daf-2, daf-16 ai livelli osservati nei singoli mutanti daf-2.Questi risultati indicano che l'isoforma daf-16d/f/h modula specificamente il metabolismo lipidico nei vermi mutanti daf-2. È importante utilizzare la stessa potenza laser per i raggi pompa e Stokes durante la sessione di imaging e includere un gruppo di controllo ogni sei e quattro quantificazione coerente. Oltre a quantificare lo stoccaggio lipidico, la microscopia SRS può essere accoppiata con tag bioorthogonali, come il deuterio, e implementata per visualizzare la dinamica dell'incorporazione lipidica, della sintesi e della degradazione.La microscopia SRS consente il multiplexing e può essere implementata per l'immagine di più biomolecole in diversi compartimenti subcellulari. La cosiddetta microscopia iperspettrale SRS ha un grande futuro nell'esplorazione delle dinamiche metaboliche.

Research

JoVE Journal

Biology

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

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