Name: label-free imaging of lipid storage dynamics in caenorhabditis elegans using stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-05-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) и исследователем HHMI (M.C.W.). Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis (CGC) за штаммы C. elegans.

1. Инструментальная установка для стимулированной рамановой рассеянной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Система микроскопии SRS построена на пикосекундном лазере со встроенным оптическим параметрическим осциллятором и конфокальным лазерным сканируемым микроскопом. Генератор о...

<ol>
	<li>Luppino, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity,+and+depression:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+longitudinal+studies.">Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies.</a> Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).</li><li>Eckel, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+type+2+diabetes:+what+can+be+unified+and+what+needs+to+be+individualized.">Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).</li><li>Poirier, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+cardiovascular+disease:+pathophysiology,+evaluation,+and+effect+of+weight+loss.">Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).</li><li>Bhaskaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-mass+index+and+risk+of+22+specific+cancers:+a+population-based+cohort+study+of+5.24+million+UK+adults.">Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults.</a> Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).</li><li>Shen, Y., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+imaging+of+small+biomolecules.">Raman imaging of small biomolecules.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).</li><li>Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+tools+for+the+investigation+of+intracellular+lipid+storage+and+dynamics.">Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics.</a> Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).</li><li>Syed, A., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+imaging+in+cell+membranes,+lipid-rich+organelles,+and+lipid+bilayers.">Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).</li><li>Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+protein+and+nucleic+acid+assemblies.">Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).</li><li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy:+chemical+imaging+for+biology+and+medicine.">Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li><li>Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+for+fat+regulatory+genes+with+SRS+microscopy.">RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.</a> Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).</li><li>Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+imaging+of+newly+synthesized+proteins+in+live+cells+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+alkyne-tagged+small+biomolecules+by+stimulated+Raman+scattering.">Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering.</a> Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).</li><li>Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+of+lipids+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).</li><li>Srinivasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+body+fat+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans.</a> Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).</li><li>Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+proteomic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+lipid+droplets+and+identification+of+ACS-4+as+a+lipid+droplet-associated+protein.">Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein.</a> Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).</li><li>Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+using+photo-highlighting+discover+BMP+signaling+in+mitochondrial+lipid+oxidation.">High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation.</a> Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).</li><li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+confocal+microscopy+and+quantitative+4D+image+analysis+of+anchor-cell+invasion+through+the+basement+membrane+in+Caenorhabditis+elegans.">Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).</li><li>Murphy, C. T., Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/insulin-like+growth+factor+signaling+in+C.+elegans.">Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-43 (2013).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+droplet+size+and+phospholipid+composition+by+stearoyl-CoA+desaturase.">Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase.</a> Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).</li><li>Watts, J. L., Ristow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+carbohydrate+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).</li><li>Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-2,+an+insulin+receptor-like+gene+that+regulates+longevity+and+diapause+in+Caenorhabditis+elegans.">daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 277 (5328), 942-946 (1997).</li><li>Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+DAF-16+isoform+regulates+longevity.">A new DAF-16 isoform regulates longevity.</a> Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).</li><li>Chen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+genes+revealed+by+integrative+analysis+of+isoform-specific+daf-16/FoxO+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).</li><li>Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+C.+elegans+DAF-16+and+its+human+ortholog+FKHRL1+by+the+daf-2+insulin-like+signaling+pathway.">Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway.</a> Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).</li><li>Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+specificity+regulates+lipid+metabolism+through+neuroendocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).</li><li>Chen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fingerprint+Stimulated+Raman+Scattering+imaging+reveals+retinoid+coupling+lipid+metabolism+and+survival.">Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+synthesis+and+lipolysis+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans+by+Stimulated+Raman+Scattering+microscopy.">Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).</li><li>Lin, C. J., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metabolites+regulate+host+lipid+metabolism+through+NR5A-Hedgehog+signalling.">Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+metabolic+fingerprinting+of+neutral+lipids+with+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).</li><li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+isotope+labeling+strategy+reveals+the+influence+of+insulin+signaling+on+lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).</li><li>Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+measuring+fatty+acid+oxidation+in+C.+elegans.">A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans.</a> Worm. 1 (1), 26-30 (2012).</li><li>Ezcurra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+eats+its+own+intestine+to+make+yolk+leading+to+multiple+senescent+pathologies.">elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies.</a> Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Long, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+vibrational+imaging+of+glucose+metabolism+using+stimulated+Raman+scattering.">Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering.</a> Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).</li><li>Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+vibrational+tags+in+biological+imaging+by+Raman+microscopy.">Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy.</a> Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).</li><li>Liao, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+situ+spectroscopic+imaging+by+a+handheld+Stimulated+Raman+Scattering+Microscope.">In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope.</a> ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).</li><li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cholesterol+storage+in+live+cells+and+C.+elegans+by+stimulated+Raman+scattering+imaging+of+phenyl-Diyne+cholesterol.">Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol.</a> Scientific Reports. 5, 7930 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations.">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).</li><li>Chen, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+coherent+Raman+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+reveals+lipid+particle+diversity.">Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity.</a> Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+Scattering+microscopy+with+a+robust+fibre+laser+source.">Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source.</a> Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).</li><li>Brinkmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+all-fiber+dual-output+widely+tunable+light+source+for+coherent+Raman+imaging.">Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging.</a> Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).</li></ol>

В защиту от ожирения и связанных с ним метаболических нарушений были предприняты важные исследовательские усилия для лучшего понимания регуляторных механизмов липидного гомеостаза. Для количественного обнаружения молекул липидов в биологических образцах было доказано, что визуали?...

Ожирение стало глобальной проблемой здравоохранения, угрожающей одной трети населения во всем мире, и оно представляет собой серьезную медицинскую проблему, учитывая его связь с плохим психическим здоровьем1 и смертельными заболеваниями, включая диабет2,сердечно-сосудистые заболевания3 и некоторые виды рака4. Изучение липидного обмена имеет важное значение для лучшего понимания биологических проблем, стоящих за ожирением. Быстрая и специфическая количественная оценка накопления липидов влечет за собой обнаружение жирных кислот и их производных, а также стеролсодержащих метаболитов, с высокой чувствительностью и предпочтительно с пространственной информацией. Липиды являются сложными целями для изображения, потому что им не хватает внутренней флуоресценции и их нельзя легко пометить флуоресцентно. Флуоресцентные метки часто больше, чем молекулы липидов, и, следовательно, могут быть химически инвазивными и непрактичными для применения in vivo. Стратегия маркировки без меток или минимальная необходима для сохранения гидрофобной структуры липидных молекул5. Последние разработки в области технологий визуализации создали захватывающие возможности для визуализации липидов без маркировки в живых клетках, тканях и организмах.
Традиционные подходы к анализу хранения липидов в биологических образцах включают биохимические анализы и протоколы окрашивания липофильными красителями. Биохимические количественные анализы, включающие масс-спектрометрию (МС), не имеют себе равных по своей молекулярной рассасывляемости, но они требуют очень больших количеств образцов, и подготовка образцов обычно занимает несколько часов, ограничивая их применение для визуализации живых систем в режиме реальноговремени 5. Другим серьезным ограничением этих анализов является отсутствие пространственной информации. С другой стороны, липофильные красители, такие как Oil Red O и Sudan Black, обеспечивают тканевое и клеточное распределение органелл хранения липидов, и по сравнению с методами MS, эти методы окрашивания также являются недорогими и простыми в выполнении. Однако эти протоколы окрашивания требуют фиксации, которая может повлиять на гидрофобную природу липидных капель, вызвать искусственные изменения в их структуре и привести к несоответствиям между экспериментами6. Технические трудности, связанные с биохимическими методами и методами окрашивания, привели к поиску безмеклеточных методов для изображения липидных молекул и к быстрому увеличению использования когерентной рамановской рассеянной (CRS) микроскопии в липидной визуализации.
Эффект Рамана был впервые признан Раманом и Кришнаном, где они сообщили, что при взаимодействии с фотоном молекула может генерировать рассеянный свет без изменения длины волны (так называемое рэлеевское рассеяние) или редко с измененной длиной волны (называемой рамановским рассеянием), и это изменение длины волны характерно для функциональных химических групп внутри молекулы7. Когда химические связи внутри молекулы возбуждаются до более высокого вибрационного энергетического уровня падежаящим фотоном, называемым фотоном насоса, энергия рассеянного фотона, называемого фотоном Стокса, становится ниже. В противном случае химические связи могут достичь более низкого уровня вибрационной энергии, если они изначально находятся на более высоком уровне, а рассеянный фотон получает энергию, чтобы быть фотоном против Стокса. Разница частот между падающе и рассеянными фотонами известна как рамановский сдвиг. Каждая химическая связь внутри молекулы имеет характерный и поддающиеся количественной оценке рамановский сдвиг. Например, связь CH2 имеет рамановский сдвиг 2,845 см-1,который в изобилии присутствует в цепях жирных кислот8. Этот спонтанный рамановский сигнал, как правило, очень слаб, что значительно ограничивает скорость визуализации в обычной спонтанной рамановской микроскопии. На протяжении многих лет были разработаны различные подходы для повышения скорости изображения и чувствительности спонтанной рамановской микроскопии. Когерентная комбинационные рассеянные микроскопии, включая когерентную рамановское рассеяние против Стокса (CARS) и микроскопию стимулированного рамановского рассеяния (SRS), является самым последним прогрессом. CARS и SRS имеют несколько разные принципы работы, но оба являются методами без меток, которые имеют возможность визуализации в реальном времени, могут давать пространственную и временную информацию о динамике хранения липидов и требуют только небольшого размера выборки. Микроскопия CARS страдает от нереконсервного фона, который исходит от различных нелинейных процессов, а сигналы CARS также имеют нелинейную связь с концентрацией молекулы, что в совокупности усложняет процесс количественной оценки9. В отличие от микроскопии CARS, микроскопия SRS не генерирует невозвествующих фоновых сигналов и предлагает линейную зависимость от концентрации интересуемой молекулы. Таким образом, в настоящее время микроскопия SRS более широко используется для липидной визуализации.
В микроскопии SRS слабые спонтанные рамановские сигналы могут быть усилены при возбуждении двумя синхронизированными лазерными лучами, причем их разность частот соответствует частоте колебаний химической связи. Молекула будет испытывать усиленный переход в возбужденное состояние за счет когерентного возбуждения. В результате скорость генерации фотонов Стокса увеличивается. Следовательно, интенсивность передаваемого «стоксового» пучка увеличивается (стимулируется рамановский усиление, SRG) и уменьшается интенсивность передаваемого «насосного» пучка (стимулируются рамановские потери, SRL). Обнаружение сигналов SRG или SRL лежит в основе микроскопии стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) микроскопии молекул со специфическими химическими связями10. Если разность частот между двумя лазерными лучами не соответствует колебательной частоте химической связи внутри интересующей молекулы, то ни SRG, ни SRL сигналы не будут генерироваться. Скорость визуализации SRS-микроскопии составляет около 2 мксек на пиксель или 1 секунду на кадр, что намного быстрее, чем спонтанная рамановская микроскопия11. Типичное боковое разрешение для SRS-микроскопии ограничено дифракцией и составляет около 300 нм. Кроме того, двухфотонные оптические процессы SRS-микроскопии позволяют проводить объемную 3D-визуализацию относительно толстых образцов тканей, а глубина изображения может достигать 300–500 мкм. В целом, микроскопия SRS представляет собой эффективный, без маркировки метод визуализации для обнаружения конкретных биомолекул, особенно липидов.
Липидные капли представляют собой одномембранные органеллы, которые являются основным клеточным местом хранения нейтральных липидов, включая триацилглицеролы (TAGs) и сложные эфиры холестерина (CEs). Связи CH2 в цепях жирных кислот этих липидных молекул генерируют сильные сигналы SRS при 2,845см-1 при возбуждении8,что позволяет обнаруживать и количественно определять уровни хранения липидов в интактных клетках, участках тканей и даже целых организмах12,13,14,15. В частности, C. elegans полезны для исследований липидной визуализации благодаря своей прозрачности. Как и млекопитающие, C. elegans также хранят липиды в липидных каплях, а пути синтеза и деградации молекул липидов высоко сохраняются16. В этом протоколе мы предоставим принцип работы SRS-микроскопии, ее фундаментальную настройку и опишем методы ее использования в липидной визуализации у C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Analog Unit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>3119</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A4</td>
			<td>For mounting the tool on scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - target</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VRC2SM1</td>
			<td>For viewing IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td>Length can vary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator (Optional)</td>
			<td>APE</td>
			<td>pulseCheck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz</td>
			<td>For signal with modulation frequency filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>For handling and picking worms for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44010</td>
			<td>Used for calibration of the SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>890/220 CARS</td>
			<td>For removing Stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose laboratory labeling tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>For covering worms for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>L1: AC254-050-B 
			L2: AC254-075-B</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowpass filter</td>
			<td>minicircuits</td>
			<td>BLP-1.9+</td>
			<td>For power supply noise suppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E03</td>
			<td>For relay and periscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>TEKPOWER</td>
			<td>TP1342U</td>
			<td>For photodiode, reversed 50V voltage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For anaesthesizing the worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm picker</td>
			<td>WormStuff</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of lipid storage dynamics in caenorhabditis elegans using stimulated raman scattering microscopy

Липидный обмен является фундаментальным физиологическим процессом, необходимым для здоровья клеток и организма. Нарушение регуляции липидного обмена часто вызывает ожирение и многие связанные с ним заболевания, включая сердечно-сосудистые расстройства, диабет II типа и рак. Чтобы продвинуть современное понимание липидной метаболической регуляции, количественные методы точного измерения уровней хранения липидов in vivo во времени и пространстве становятся все более важными и полезными. Традиционные подходы к анализу накопления липидов являются полукоципными для микроскопической оценки или не имеют пространственно-временной информации для биохимического измерения. Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) представляет собой технологию химической визуализации без меток, которая позволяет быстро и количественно обнаруживать липиды в живых клетках с субклеточным разрешением. Поскольку контраст используется от внутренних молекулярных колебаний, микроскопия SRS также позволяет четырехмерное отслеживание липидов у живых животных. В последнее десятилетие микроскопия SRS широко используется для визуализации малых молекул в биомедицинских исследованиях и преодолевает основные ограничения обычных методов флуоресцентного окрашивания и экстракции липидов. В лаборатории мы объединили микроскопию SRS с генетическими и биохимическими инструментами, доступными мощному модельному организму Caenorhabditis elegans, чтобы исследовать распределение и неоднородность липидных капель в разных клетках и тканях и, в конечном счете, обнаружить новые сохраненные сигнальные пути, которые модулируют метаболизм липидов. Здесь мы представляем принципы работы и подробную настройку микроскопа SRS и предоставляем методы его использования для количественной оценки накопления липидов в различных временных точках развития мутанта C. elegans дикого типа и инсулина, сигнализирующих с дефицитом мутанта C. elegans.

Передача сигналов инсулина является важным эндокринным путем, который влияет на развитие, размножение, продолжительность жизни и метаболизм. У червей передача сигналов инсулина состоит из около 40 инсулиноподобных пептидных лигандов, инсулиноподобного рецептора фактора роста ортоло?...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Микроскопия с стимулированным рамановской рассеянием (SRS) позволяет селективно, без маркировки визуализировать конкретные химические части и эффективно используется для изображения липидных молекул in vivo. Здесь мы предоставляем краткое введение в принцип SRS-микроскопии и описываем методы его использования в визуализации хранения липидов у Caenorhabditis elegans.

Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Стимулированная рамановская рассеянная микроскопия - это технология химической визуализации, которая позволяет быстро и количественно обнаруживать липиды и позволяет отслеживать липиды у живых животных без маркировки. Наиболее важным преимуществом микроскопии SRS перед традиционными методами обнаружения липидов является то, что она не содержит этикеток и, следовательно, не так устойчива к фотоотбеливанию, как другие флуоресцентные и окрашивающие вещества. Использование микроскопии SRS в сочетании с генетическими и биохимическими инструментами, доступными для модельных организмов, в частности Caenorhabditis elegans, обеспечивает мощную основу для изучения нормальных регуляторов липидной биологии и метаболизма.Чтобы подать лазерные лучи в микроскоп SRS, сначала установите перископ на подъем луча от пикосекундного выхода источника света к входному порту инфракрасного лазера на сканере микроскопа и откройте программное обеспечение для управления лазером для запуска лазеров. Уменьшите мощность лазера накачки до 50 милливатт и установите сигнал накачки на 750 нанометров. Используйте расширитель луча для регулировки диаметра луча в соответствии с задней диафрагмой объективов микроскопа.Используйте два релейных зеркала, M1 и M2, чтобы направить лазерный луч к перископу и установить кивки перископа в центре диапазона настройки. Выберите начальное положение и угол каждого зеркала таким образом, чтобы лазерный луч примерно ударял по центру зеркала, чтобы запустить луч в микроскоп и использовать пустой порт на целевой башне микроскопа для выполнения выравнивания курса. Поместите датчик мощности на объективный порт для измерения мощности проходящего света и установите сканер микроскопа на самый высокий зум, 50X.Измерьте мощность проходящего света с помощью сфокусированного лазерного луча и оптимизируйте ручки зеркал M1 и M2 итеративно для достижения максимальной мощности передаваемого лазера. Используйте инструмент выравнивания для выполнения точного выравнивания проходящего света, чтобы убедиться, что свет проходит через центр объектива, и поместите колпачок выравнивания флуоресцентной цели на пустое целевое сиденье. Отрегулируйте ручки первого рулевого зеркала, M1, чтобы центрировать пятно лазерного луча и ввести удлинительную трубку с колпачком выравнивания на другом конце на пустое целевое сиденье для мониторинга пятна лазерного луча.Затем настройте ручки второго рулевого зеркала, M2, чтобы снова центрировать точку лазерного луча на другом конце удлинительной трубки. Чтобы настроить модуль обнаружения SRS, поместите куб светоотвода после конденсатора, чтобы направить передаваемый лазер на фотодиодный модуль. Чтобы настроить электронное соединение, используйте встроенный электрооптический модулятор на 20 мегагерц внутри пикосекундного настраиваемого лазера для модуляции интенсивности луча Стокса и подачи выходного сигнала фотодиода в блокирующий усилитель для демодуляции стимулированных рамановских потерь.Затем подать выход с фиксацией усилителя в аналоговую коробку микроскопа для преобразования электрического аналогового сигнала в цифровой. Чтобы оптимизировать условия визуализации, добавьте пять микролитров олеиновой кислоты в слайдовую камеру мини-микроскопа и накройте образец крышкой. Поместите образец на ступень микроскопа и используйте край прокладки, чтобы найти и сфокусироваться на капле.Отрегулируйте конденсатор для освещения Kohler и используйте инфракрасную сенсорную карту и инфракрасный просмотрщик, чтобы проверить, является ли траектория луча насоса все еще правильной. Убедитесь, что стадия задержки установлена на ноль фемтосекунд и установите длину волны пучка насоса на 795,8 нанометра. Установите мощность пучка насоса на 50 милливатт, а пучка Стока на 100 милливатт.Откройте затвор как для лучей, так и для основного затвора лазера. Отсканируйте образец и проверьте изображение на экране компьютера. Измените режим отображения на высокий низкий и отрегулируйте диапазон, чтобы увидеть насыщенность примерно на 50%.Проверьте, центрирована ли насыщенность изображения, тщательно регулируя рулевые зеркала внутри пикосекундной настраиваемой лазерной системы для оптимизации перекрытия накачки и Стокса, чтобы максимизировать интенсивность изображения и при необходимости центрировать пиковую интенсивность. Перед каждым сеансом визуализации добавляйте 100 микролитров теплой 2%-агарозы на чистый стеклянный слайд, размещенный между опорными слайдами с помощью двух слоев лабораторной ленты, и быстро поместите второй слайд поверх первого слайда. Осторожно нажимают, чтобы создать тонкую, ровную, агарозную прокладку и дать агарозе остыть.Чтобы установить червей для визуализации, поместите от четырех до пяти микролитров капли анестетика на 10-20 червей на крышку и используйте микроскоп рассечения, чтобы выбрать червей для изображения, помещая червей на капельку анестезии по мере их сбора. Когда все черви будут собраны, накройте червей стеклянной горкой с агарозной подушечкой. Для получения изображения установите образец червя с крышкой, обращенной к объективу, и направляйте источник света яркого поля на окуляр, чтобы найти червей.Поместите червей в фокус и отрегулируйте положение конденсатора соответствующим образом. Отрегулируйте мощность лазера, установив мощность лазера накачки на 200 милливатт, а мощность ИК на 400 милливатт. Установите блокирующий усилитель для демодуляции червячного сигнала SRS.Начните сканирование первого червя с высокой скоростью сканирования, регулируя тонкий фокус, чтобы найти интересующую область. Когда сигнал будет оптимизирован, переключитесь на более медленную скорость сканирования и более высокое разрешение пикселей, чтобы получить изображение SRS и сохранить изображение в формате, обеспечивающем высокое разрешение. Когда все образцы будут получены, поместите лазерный источник в режим ожидания и выключите все соответствующее оборудование.Чтобы проанализировать изображения, откройте файлы в ImageJ и выберите «Анализировать и устанавливать измерения», чтобы выбрать свойства для анализа. Используйте инструмент выделения полигонов, чтобы очертить область кишечника червя, которая должна быть количественно определена, и снова щелкните анализ и измерение. Измерения появятся в окне результатов.Когда все черви будут описаны, скопируйте и вставьте измерения для каждого из червей в данном генотипе в электронную таблицу. Для значения фонового измерения выберите область в непосредственной близости от червя, которая не имеет сигнала SRS, и вычтите фоновое среднее значение серого цвета из измерения для каждого отдельного червя, чтобы рассчитать среднее и стандартное отклонение фона, вычитаемого среднего серого значения из всех червей в данном генотипе или тестовой группе. Затем эти значения могут быть нормализованы до среднего значения контрольной группы.В этом репрезентативном анализе уровни липидов кишечника у синхронизированных по возрасту червей дикого типа и мутантов daf-2, не имеющих рецептора инсулина, были количественно определены во взрослом возрасте. Как и ожидалось, снижение уровня липидов наблюдается у диких червей, начиная с первого дня и продолжаясь до девятого дня взрослой жизни. Однако уровни липидов у мутантов daf-2 увеличиваются до тех пор, пока им не исполнится пять дней, и в этот момент они остаются постоянными примерно в 2,5-три раза выше, чем у дикого типа.Инактивация Daf-16 подавляет повышение уровня липидов мутантов daf-2. Экспрессия изоформы daf-16a a или daf-16b в двойных мутантах daf-2, daf-16 не восстанавливает уровни липидов. Однако экспрессия изоформы daf-16d/f/h достаточна для восстановления уровней липидов у двойных мутантов daf-2, daf-16 до уровней, наблюдаемых у одиночных мутантов daf-2.Эти результаты показывают, что изоформа daf-16d/f/h специфически модулирует липидный обмен у мутантных червей daf-2. Важно использовать одну и ту же мощность лазера для пучков и лучей Стокса на протяжении всего сеанса визуализации и включать контрольную группу в каждые шесть и четыре последовательных количественных оценки. В дополнение к количественной оценке хранения липидов, микроскопия SRS может быть соединена с биоортогональными метками, такими как дейтерий, и реализована для визуализации динамики включения, синтеза и деградации липидов.Микроскопия SRS позволяет мультиплексировать и может быть реализована для изображения нескольких биомолекул в разных субклеточных компартментах. Так называемая гиперспектральная микроскопия SRS имеет большое будущее в изучении метаболической динамики.

Research

JoVE Journal

Biology

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Этикетка без На месте Изображений одревеснения в стенах растительной клетки

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Дифференциальная изображений биологических структур с Вдвойне-резонансной когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Динамика олигомеризации рецепторов поверхности клеток в живых клетках с помощью общей внутренней флуоресценции в сочетании с анализом числа и яркости

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...