Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) fra AMED under Grant Number JP20am0101077. Dette arbejde blev også delvist støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

1. Fremstilling af pEU-ekspressionsplasmid
BEMÆRK: pEU-ekspressionsplasmid skal omfatte startkodon, åben læseramme for målmembranprotein og stopkodon i fragmentet (se figur 1). Tilføj detektions-/rensningsmærkesekvens(er) på den relevante position, når det er nødvendigt. Enten restriktionsenzymfordøjelse eller sømløs kloning kan anvendes til underkloning. Her beskriver vi en protokol ved hjælp af en problemfri kloningsmetode.
<ol><li>Forbered indsæ...

Den præsenterede protokol giver en metode til fremstilling af membranproteiner med en høj succesrate. Denne protokol er enkel, meget reproducerbar og let at skalere op. Det har også potentialet til at reducere tid og omkostninger ved eksperimenter, der bruger en stor mængde membranproteiner. Dobbeltlagsdialysemetoden forbedrer produktiviteten med 4-10 gange sammenlignet med dobbeltlagsmetoden eller dialysemetoden (figur 2B)45. I ekstreme tilfælde steg udbyttet af...

Membranproteiner er et af de vigtigste lægemiddelmål inden for diagnose og terapi. Faktisk er halvdelen af små sammensatte lægemidler mål membranproteiner, såsom G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) og ionkanaler1. Gennem årene har forskere arbejdet med biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser af membranproteiner for at belyse deres struktur og funktion 2,3. Udvikling af monoklonale antistoffer mod membranproteiner udføres også aktivt for at fremskynde funktionelle og strukturelle undersøgelser og udvikle terapeutiske og diagnostiske anvendelser 4,5,6,7,8,9. Alle disse undersøgelser kræver en stor mængde membranproteiner af høj kvalitet10. For eksempel er der brug for flere milligram oprensede membranproteiner med naturlig konformation til antistofudvikling. En meget større mængde højt oprensede membranproteiner er nødvendige for røntgenkrystallografi. Masseproduktion af membranproteiner er dog fortsat en flaskehals i membranproteinforskningen11. Membranproteiner har komplicerede strukturer med en eller flere transmembranspiraler og spiller vigtige roller i cellehomeostase. Heterolog overekspression af membranproteiner fører til flere forhindringer såsom aggregering af membranproteiner, der akkumuleres ved høje lokale koncentrationer eller forstyrrelse af cellulære signalveje. Selvom udtrykket er vellykket, står efterfølgende trin i prøveforberedelsen også over for vanskeligheder. For eksempel kræver forberedelse af proteoliposom færdigheder og erhvervserfaring på højt niveau inden for opløselse, oprensning og stabilisering af membranproteiner og koster også meget indsats og tid12,13.
På den anden side er der opstået nogle avancerede teknologier i de seneste årtier til at producere proteiner uden brug af levende celler 14,15,16,17,18. Cellefri proteinsynteseteknologi rekonstituerer translationsreaktion i et reagensglas. Da der ikke er nogen begrænsninger, som det cellulære ekspressionssystem har, har cellefrie systemer potentiale til at syntetisere en række proteiner, der er vanskelige at udtrykke eller vise toksicitet i celler. Renset celleekstrakt eller rekonstitueret translationelt maskineri blandes med skabelon-mRNA'er, aminosyrer og energikilder, og rekombinante proteiner syntetiseres på kort tid. Med hensyn til membranproteinsyntesen tilsættes nogle slags stilladser sammensat af lipider eller amfifile, såsom liposomer, biceller, nanodiscs eller copolymerer til den cellefrie reaktion 19,20,21,22,23,24. Syntetiserede membranproteiner interagerer med stilladserne og kan stabiliseres i vand. Cellefri syntetiserede membranproteiner anvendes i vid udstrækning i funktionelle undersøgelser og antistofproduktion 25,26,27,28,29,30,31.
I denne protokol beskriver vi en effektiv cellefri metode til proteoliposomproduktion ved hjælp af hvedecellefrit system og liposomer. Hvedecellefrit proteinsyntesesystem er et kraftfuldt in vitro-oversættelsessystem, der bruger ekstrakt fra hvedekim 15,32,33. Hvedekim indeholder en stor mængde translationelle maskiner og få oversættelsesinhibitorer. Det translationelle maskineri i hvede, et medlem af eukaryoter, er velegnet til oversættelse af eukaryote proteiner, og dets oversættelseseffektivitet påvirkes næppe af kodonbrug af skabelonens mRNA. Ved hjælp af hvedecellefrit system har vi syntetiseret en række proteiner, herunder proteinkinaser 34,35, ubiquitinligaser36, transkriptionsfaktorer37 og membranproteiner med høje succesrater. Til membranproteinproduktion tilføjer vi lipidvesikelliposomet i oversættelsesblandingen som stillads19,38. Hydrofobe domæner af membranprotein interagerer med lipiddobbeltlag og integreres spontant med liposom. Densitetsgradientcentrifugering anvendes til strengt at adskille proteoliposom fra endogene hvedeproteiner, selvom en fælles centrifugering af translationsreaktionsblandingen er tilstrækkelig til en simpel oprensning af proteoliposom20. Mange slags integrerede membranproteiner er blevet syntetiseret ved hjælp af hvedecellefrit system og anvendt til forskellige undersøgelser og udviklinger 25,38,39,40,41,42,43,44. Desuden udviklede vi "dobbeltlagsdialysemetoden" til storskalaproduktion45,46. I denne metode nedsænkes kop-type dialyseanordning i substrattilførselsbufferen, og der dannes to lag oversættelsesreaktionsblanding og substrattilførselsbuffer i koppen som vist i figur 1. Kontinuerlig tilførsel af substrater og fjernelse af biproduktet kan effektivt udføres i både toppen og bunden af reaktionsblandingen i lang tid, hvilket fører til fremragende oversættelseseffektivitet (figur 2A og figur 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membranproteiner spiller væsentlige roller i en række cellulære processer og udfører vitale funktioner. Membranproteiner er medicinsk vigtige i lægemiddelopdagelse, fordi de er mål for mere end halvdelen af alle lægemidler. En hindring for at gennemføre biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser af membranproteiner samt antistofudvikling har været vanskeligheden ved at producere store mængder membranprotein af høj kvalitet med korrekt konformation og aktivitet. Her beskriver vi en "dobbeltlagsdialysemetode" ved hjælp af et hvedekimcellefrit system, liposomer og dialysekopper til effektivt at syntetisere membranproteiner og forberede oprensede proteoliposomer på kort tid med en høj succesrate. Membranproteiner kan produceres så meget som i flere milligram, såsom GPCR'er, ionkanaler, transportører og tetraspaniner. Denne cellefri metode bidrager til at reducere tid, omkostninger og indsats til fremstilling af proteoliposomer af høj kvalitet og giver passende midler til funktionel analyse af membranproteiner, screening af lægemiddelmål og antistofudvikling.

Ved anvendelse af denne protokol kan delvist oprensede proteoliposomer opnås på kort tid. Repræsentative resultater er vist i figur 2A. Femogtyve GPCR'er i klasse A, B og C blev syntetiseret med succes ved hjælp af dobbeltlagsdialysemetoden (lille skala) og delvist oprenset ved centrifugering og buffervask. Selvom mængden af syntetiserede proteiner varierer alt efter proteintypen, kan 50 til 400 μg membranproteiner normalt syntetiseres pr. reaktion, når der anvendes store dialysekoppe...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Denne protokol beskriver en effektiv cellefri metode til produktion af proteoliposom af høj kvalitet ved dobbeltlagsdialysemetode ved anvendelse af hvedecellefrit system og liposomer. Denne metode giver passende midler til funktionel analyse af membranproteiner, screening af lægemiddelmål og antistofudvikling.

Cellefri produktion af proteoliposomer til funktionel analyse og antistofudvikling rettet mod membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriel Inner-membran Display til screening af et bibliotek af antistof fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion og oprensning af et terapeutisk antistof

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse af histonantistofspecifikitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i E. coli og fremstilling af membran vesikler

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...