Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door Platform Project for Supporting Drug Discovery en Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) van AMED onder Grant Number JP20am0101077. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

1. Bereiding van pEU-expressieplasmide
OPMERKING: pEU-expressieplasmide moet startcodon, open leesframe van doelmembraaneiwit en stopcodon in het fragment omvatten (zie figuur 1). Voeg indien nodig detectie-/zuiveringstagreeks(en) toe op de juiste positie. Restrictie-enzymvertering of naadloos klonen is van toepassing voor subcloning. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een naadloze kloonmethode.
<ol><li>Bereid dna-fragment in.<ol><li>Versterk het ge...

Het gepresenteerde protocol biedt een methode om membraaneiwitten te produceren met een hoog slagingspercentage. Dit protocol is eenvoudig, zeer reproduceerbaar en gemakkelijk op te schalen. Het heeft ook het potentieel om de tijd en kosten van experimenten die een grote hoeveelheid membraaneiwitten verbruiken te verminderen. De bilayer-dialysemethode verbetert de productiviteit met 4-10 keer in vergelijking met de bilayer-methode of dialysemethode (figuur 2B)45. In e...

Membraaneiwitten zijn een van de belangrijkste medicijndoelen bij diagnose en therapieën. Inderdaad, de helft van de kleine samengestelde geneesmiddelen zijn membraaneiwitten, zoals G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) en ionkanalen1. In de loop der jaren hebben onderzoekers gewerkt aan biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten om hun structuur en functie op te helderen 2,3. De ontwikkeling van monoklonale antilichamen tegen membraaneiwitten wordt ook actief uitgevoerd om functionele en structurele studies te versnellen en therapeutische en diagnostische toepassingen te ontwikkelen 4,5,6,7,8,9. Al deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige membraaneiwitten10. Er zijn bijvoorbeeld enkele milligrammen gezuiverde membraaneiwitten met natuurlijke conformatie nodig voor de ontwikkeling van antilichamen. Een veel grotere hoeveelheid sterk gezuiverde membraaneiwitten is nodig voor röntgenkristallografie. Massaproductie van membraaneiwitten blijft echter een knelpunt in membraaneiwitonderzoek11. Membraaneiwitten hebben gecompliceerde structuren met een of meer transmembraan helices en spelen een belangrijke rol bij celhomeostase. Heterologe overexpressie van membraaneiwitten leidt tot meerdere obstakels, zoals aggregatie van membraaneiwitten die zich ophopen bij hoge lokale concentraties of verstoring van cellulaire signaalroutes. Zelfs als de expressie succesvol is, ondervinden volgende stappen van monstervoorbereiding ook problemen. Bijvoorbeeld, de bereiding van proteoliposoom, vereist vaardigheden op hoog niveau en professionele ervaringen in oplosbaarheid, zuivering en stabilisatie van membraaneiwitten, en kost ook veel moeite en tijd12,13.
Aan de andere kant zijn er de afgelopen decennia enkele geavanceerde technologieën ontstaan om eiwitten te produceren zonder het gebruik van levende cellen 14,15,16,17,18. Celvrije eiwitsynthesetechnologie reconstitueert de translatiereactie in een reageerbuis. Omdat er geen beperkingen zijn die het cellulaire expressiesysteem heeft, hebben celvrije systemen het potentieel om een verscheidenheid aan eiwitten te synthetiseren die moeilijk tot expressie te brengen zijn of toxiciteit in cellen vertonen. Gezuiverd celextract of gereconstitueerde translationele machines worden gemengd met sjabloon mRNA's, aminozuren en energiebronnen, en recombinante eiwitten worden in korte tijd gesynthetiseerd. Wat de membraaneiwitsynthese betreft, worden sommige soorten steigers bestaande uit lipiden of amfifielen, zoals liposomen, bicellen, nanodiscs of copolymeren toegevoegd aan de celvrije reactie 19,20,21,22,23,24. Gesynthetiseerde membraaneiwitten interageren met de steigers en kunnen worden gestabiliseerd in water. Celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten worden veel gebruikt in functionele studies en antilichaamproductie 25,26,27,28,29,30,31.
In dit protocol beschrijven we een efficiënte celvrije methode van proteoliposoomproductie met behulp van tarwecelvrij systeem en liposomen. Tarwecelvrij eiwitsynthesesysteem is een krachtig in vitro vertaalsysteem met behulp van extract uit tarwekiemen 15,32,33. Tarwekiemen bevatten een grote hoeveelheid translationele machines en weinig vertaalremmers. De translationele machinerie in tarwe, een lid van eukaryoten, is geschikt voor het vertalen van eukaryote eiwitten en de translatie-efficiëntie ervan wordt nauwelijks beïnvloed door codongebruik van het sjabloon-mRNA. Met behulp van een tarwecelvrij systeem hebben we een verscheidenheid aan eiwitten gesynthetiseerd, waaronder eiwitkinasen34,35, ubiquitine-ligases36, transcriptiefactoren37 en membraaneiwitten met hoge slagingspercentages. Voor de productie van membraaneiwitten voegen we lipideblaaslipoom toe aan het translatiemengsel als steiger19,38. Hydrofobe domeinen van membraaneiwit interageren met lipide bilayer en worden spontaan geïntegreerd met liposoom. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt gebruikt om proteoliposoom strikt te scheiden van endogene tarwe-eiwitten, hoewel een gemeenschappelijke centrifugatie van het translatiereactiemengsel voldoende is voor een eenvoudige zuivering van proteoliposoom20. Vele soorten integrale membraaneiwitten zijn gesynthetiseerd met behulp van tarwecelvrij systeem en toegepast voor verschillende onderzoeken en ontwikkelingen 25,38,39,40,41,42,43,44. Bovendien ontwikkelden we de "bilayer-dialysemethode" voor grootschalige productie45,46. Bij deze methode wordt het dialyseapparaat van het cuptype ondergedompeld in de substraatvoedingsbuffer en worden twee lagen translatiereactiemengsel en substraatvoedingsbuffer in de beker gevormd, zoals weergegeven in figuur 1. Continue toevoer van substraten en verwijdering van het bijproduct kunnen gedurende lange tijd efficiënt worden uitgevoerd aan zowel de boven- als de onderkant van het reactiemengsel, wat leidt tot een uitstekende vertaaleffectiviteit (figuur 2A en figuur 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membraaneiwitten spelen een essentiële rol in verschillende cellulaire processen en vervullen vitale functies. Membraaneiwitten zijn medisch belangrijk bij het ontdekken van geneesmiddelen omdat ze het doelwit zijn van meer dan de helft van alle geneesmiddelen. Een obstakel voor het uitvoeren van biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten en de ontwikkeling van antilichamen is de moeilijkheid om grote hoeveelheden hoogwaardig membraaneiwit te produceren met de juiste conformatie en activiteit. Hier beschrijven we een "bilayer-dialysemethode" met behulp van een tarwekiemcelvrij systeem, liposomen en dialysebekers om efficiënt membraaneiwitten te synthetiseren en gezuiverde proteolisomen in korte tijd te bereiden met een hoog slagingspercentage. Membraaneiwitten kunnen zoveel worden geproduceerd als in enkele milligrammen, zoals GPCR's, ionkanalen, transporters en tetraspaninen. Deze celvrije methode draagt bij aan het verminderen van de tijd, kosten en moeite voor het bereiden van hoogwaardige proteoliposomen en biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en de ontwikkeling van antilichamen.

Met behulp van dit protocol kunnen gedeeltelijk gezuiverde proteoliposomen in korte tijd worden verkregen. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 2A. Vijfentwintig GPCR's van klasse A, B en C werden met succes gesynthetiseerd met behulp van de bilayer-dialysemethode (kleinschalig) en gedeeltelijk gezuiverd door centrifugatie en bufferwas. Hoewel de hoeveelheid gesynthetiseerde eiwitten varieert afhankelijk van het type eiwit, kan meestal 50 tot 400 μg membraaneiwitten per ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...