Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
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Diese Forschung wurde vom Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) von AMED unter der Fördernummer JP20am0101077 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709 unterstützt.

1. Herstellung von pEU-Expressionsplasmid
HINWEIS: Das pEU-Expressionsplasmid sollte Startcodon, offenen Leserahmen des Zielmembranproteins und Stopcodon im Fragment enthalten (siehe Abbildung 1). Fügen Sie bei Bedarf Erkennungs-/Reinigungs-Tag-Sequenz(en) an der entsprechenden Position hinzu. Für das Subklonen ist entweder die Restriktionsenzymverdauung oder das nahtlose Klonen anwendbar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine nahtlose Klonmethode verwendet...

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Membranproteinen mit einer hohen Erfolgsrate. Dieses Protokoll ist einfach, hochgradig reproduzierbar und leicht zu skalieren. Es hat auch das Potenzial, den Zeit- und Kostenaufwand für Experimente zu reduzieren, die eine große Menge an Membranproteinen verbrauchen. Die Zweischichtdialysemethode verbessert die Produktivität um das 4- bis 10-fache im Vergleich zur Doppelschichtmethode oder Dialysemethode (Abbildung 2B)<sup ...

Membranproteine sind eines der wichtigsten Wirkstoffziele in Diagnose und Therapie. Tatsächlich sind die Hälfte der kleinen Wirkstoffe Membranproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und Ionenkanäle1. Im Laufe der Jahre haben Forscher an biochemischen, biophysikalischen und strukturellen Studien von Membranproteinen gearbeitet, um ihre Struktur und Funktion aufzuklären 2,3. Die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Membranproteine wird ebenfalls aktiv durchgeführt, um funktionelle und strukturelle Studien zu beschleunigen und therapeutische und diagnostische Anwendungen zu entwickeln 4,5,6,7,8,9. Alle diese Studien erfordern eine große Menge an hochwertigen Membranproteinen10. So werden beispielsweise mehrere Milligramm gereinigte Membranproteine mit natürlicher Konformation für die Antikörperentwicklung benötigt. Für die Röntgenkristallographie wird eine viel größere Menge an hochgereinigten Membranproteinen benötigt. Die Massenproduktion von Membranproteinen bleibt jedoch ein Engpass in der Membranproteinforschung11. Membranproteine haben komplizierte Strukturen mit einer oder mehreren Transmembranhelices und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellhomöostase. Die heterologe Überexpression von Membranproteinen führt zu mehreren Hindernissen wie der Aggregation von Membranproteinen, die sich in hohen lokalen Konzentrationen ansammeln, oder der Störung zellulärer Signalwege. Selbst wenn die Expression erfolgreich ist, stoßen auch nachfolgende Schritte der Probenvorbereitung auf Schwierigkeiten. Zum Beispiel erfordert die Herstellung von Proteoliposom hohe Fähigkeiten und Berufserfahrung in der Solubilisierung, Reinigung und Stabilisierung von Membranproteinen und kostet viel Aufwand und Zeit12,13.
Auf der anderen Seite sind in den letzten Jahrzehnten einige fortschrittliche Technologien entstanden, um Proteine ohne die Verwendung lebender Zellen herzustellen 14,15,16,17,18. Die zellfreie Proteinsynthesetechnologie rekonstruiert die Translationsreaktion in einem Reagenzglas. Da es keine Einschränkungen gibt, die das zelluläre Expressionssystem hat, haben zellfreie Systeme das Potenzial, eine Vielzahl von Proteinen zu synthetisieren, die schwer zu exprimieren sind oder Toxizität in Zellen zeigen. Gereinigter Zellextrakt oder rekonstituierte translationale Maschinerie wird mit Template-mRNAs, Aminosäuren und Energiequellen gemischt, und rekombinante Proteine werden in kurzer Zeit synthetisiert. In Bezug auf die Membranproteinsynthese werden einige Arten von Gerüsten, die aus Lipiden oder Amphiphilen bestehen, wie Liposomen, Bizellen, Nanoscheiben oder Copolymere, zur zellfreien Reaktion 19,20,21,22,23,24 hinzugefügt. Synthetisierte Membranproteine interagieren mit den Gerüsten und können in Wasser stabilisiert werden. Zellfreie synthetisierte Membranproteine werden häufig in funktionellen Studien und der Antikörperproduktion verwendet 25,26,27,28,29,30,31.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine effiziente zellfreie Methode der Proteoliposomenproduktion unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Weizenzellfreies Proteinsynthesesystem ist ein leistungsfähiges In-vitro-Translationssystem mit Extrakt aus Weizenkeimen 15,32,33. Weizenkeime enthalten eine große Menge an translationalen Maschinen und wenige Translationshemmer. Die translationale Maschinerie in Weizen, einem Mitglied der Eukaryoten, eignet sich für die Translation eukaryotischer Proteine, und seine Translationseffizienz wird durch die Codonverwendung der Template-mRNA kaum beeinflusst. Unter Verwendung des weizenzellfreien Systems haben wir eine Vielzahl von Proteinen synthetisiert, darunter Proteinkinasen34,35, Ubiquitin-Ligasen36, Transkriptionsfaktoren37 und Membranproteine mit hohen Erfolgsraten. Für die Membranproteinproduktion fügen wir Lipidvesikelliposom als Gerüst19,38 in die Translationsmischung ein. Hydrophobe Domänen des Membranproteins interagieren mit der Lipiddoppelschicht und sind spontan in das Liposom integriert. Die Dichtegradientenzentrifugation wird verwendet, um Proteoliposom von endogenen Weizenproteinen strikt zu trennen, obwohl eine gemeinsame Zentrifugation des Translationsreaktionsgemisches für eine einfache Reinigung von Proteoliposom20 ausreicht. Viele Arten von integralen Membranproteinen wurden mit einem weizenzellenfreien System synthetisiert und für verschiedene Forschungen und Entwicklungen 25,38,39,40,41,42,43,44 angewendet. Darüber hinaus haben wir das "Bilayer-Dialyse-Verfahren" für die Großserienproduktion45,46 entwickelt. Bei diesem Verfahren wird ein Becherdialysegerät in den Substratzufuhrpuffer eingetaucht, und es werden zwei Schichten Translationsreaktionsgemisch und Substratzuführpuffer im Becher gebildet, wie in Abbildung 1 gezeigt. Die kontinuierliche Zuführung von Substraten und die Entfernung des Nebenprodukts kann sowohl oben als auch unten des Reaktionsgemisches über einen langen Zeitraum effizient durchgeführt werden, was zu einer hervorragenden Translationseffizienz führt (Abbildung 2A und Abbildung 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membranproteine spielen eine wesentliche Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und erfüllen lebenswichtige Funktionen. Membranproteine sind in der Wirkstoffforschung von medizinischer Bedeutung, da sie das Ziel von mehr als der Hälfte aller Medikamente sind. Ein Hindernis für die Durchführung biochemischer, biophysikalischer und struktureller Studien von Membranproteinen sowie für die Antikörperentwicklung war die Schwierigkeit, große Mengen an hochwertigem Membranprotein mit korrekter Konformation und Aktivität herzustellen. Hier beschreiben wir eine "Bilayer-Dialysemethode" mit einem weizenkeimzellfreien System, Liposomen und Dialysebechern, um Membranproteine effizient zu synthetisieren und gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit mit einer hohen Erfolgsrate herzustellen. Membranproteine können ebenso hergestellt werden wie in mehreren Milligramm, wie GPCRs, Ionenkanälen, Transportern und Tetraspaninen. Diese zellfreie Methode trägt dazu bei, Zeit, Kosten und Aufwand für die Herstellung hochwertiger Proteoliposomen zu reduzieren und bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Antikörperentwicklung.

Mit diesem Protokoll können teilweise gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit erhalten werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt. Fünfundzwanzig GPCRs der Klassen A, B und C wurden erfolgreich mit der Doppelschichtdialysemethode (kleiner Maßstab) synthetisiert und teilweise durch Zentrifugation und Pufferwäsche gereinigt. Obwohl die Menge der synthetisierten Proteine je nach Proteintyp variiert, können bei Verwendung großer Dialysebecher in der Regel 50 bis ...

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Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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