Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) fra AMED under Grant Number JP20am0101077. Dette arbeidet ble også delvis støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

1. Fremstilling av pEU-ekspresjonsplasmid
MERK: pEU-ekspresjonsplasmid bør inkludere startkodon, åpen leseramme for målmembranprotein og stoppkodon i fragmentet (se figur 1). Legg til deteksjons-/rensingskodesekvens(er) i riktig posisjon når det er nødvendig. Enten restriksjonsenzymfordøyelse eller sømløs kloning gjelder for subkloning. Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av en sømløs kloningsmetode.
<ol><li>Forbered sett inn DNA-fragment.<ol><li>F...

Den presenterte protokollen gir en metode for å produsere membranproteiner med høy suksessrate. Denne protokollen er enkel, svært reproduserbar og lett å skalere opp. Det har også potensial til å redusere tid og kostnader for eksperimenter som bruker en stor mengde membranproteiner. Tolagsdialysemetoden forbedrer produktiviteten med 4–10 ganger sammenlignet med dobbeltlagsmetode eller dialysemetode (figur 2B)45. I ekstreme tilfeller økte utbyttet av en ionkan...

Membranproteiner er et av de viktigste stoffmålene i diagnose og terapi. Faktisk er halvparten av små sammensatte legemidler rettet mot membranproteiner, slik som G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) og ionkanaler1. Gjennom årene har forskere jobbet med biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier av membranproteiner for å belyse deres struktur og funksjon 2,3. Utvikling av monoklonale antistoffer mot membranproteiner utføres også aktivt for å akselerere funksjonelle og strukturelle studier og for å utvikle terapeutiske og diagnostiske applikasjoner 4,5,6,7,8,9. Alle disse studiene krever en stor mengde membranproteiner av høy kvalitet10. For eksempel er det nødvendig med flere milligram rensede membranproteiner med naturlig konformasjon for antistoffutvikling. En mye større mengde høyt rensede membranproteiner er nødvendig for røntgenkrystallografi. Imidlertid er masseproduksjon av membranproteiner fortsatt en flaskehals i membranproteinforskning11. Membranproteiner har kompliserte strukturer med en eller flere transmembrane helices og spiller viktige roller i cellehomeostase. Heterolog overekspresjon av membranproteiner fører til flere hindringer som aggregering av membranproteiner som akkumuleres ved høye lokale konsentrasjoner eller forstyrrelse av cellulære signalveier. Selv om uttrykket er vellykket, står etterfølgende trinn for prøvepreparering også overfor vanskeligheter. For eksempel, forberedelse av proteoliposom, krever høyt nivå ferdigheter og yrkeserfaring i oppløseliggjøring, rensing og stabilisering av membranproteiner, og koster mye krefter og tid også12,13.
På den annen side har noen avanserte teknologier dukket opp de siste tiårene for å produsere proteiner uten bruk av levende celler 14,15,16,17,18. Cellefri proteinsynteseteknologi rekonstituerer translasjonsreaksjon i et reagensrør. Siden det ikke er noen begrensninger som det cellulære ekspresjonssystemet har, har cellefrie systemer potensial til å syntetisere en rekke proteiner som er vanskelige å uttrykke eller vise toksisitet i celler. Renset celleekstrakt eller rekonstituert translasjonsmaskineri blandes med mal-mRNA, aminosyrer og energikilder, og rekombinante proteiner syntetiseres på kort tid. Når det gjelder membranproteinsyntesen, tilsettes noen typer stillas sammensatt av lipider eller amfifiler, som liposomer, biceller, nanodiscs eller kopolymerer til den cellefrie reaksjonen 19,20,21,22,23,24. Syntetiserte membranproteiner interagerer med stillasene og kan stabiliseres i vann. Cellefrie syntetiserte membranproteiner brukes mye i funksjonelle studier og antistoffproduksjon 25,26,27,28,29,30,31.
I denne protokollen beskriver vi en effektiv cellefri metode for proteoliposomproduksjon ved bruk av hvetecellefritt system og liposomer. Hvetecellefritt proteinsyntesesystem er et kraftig in vitro-oversettelsessystem som bruker ekstrakt fra hvetekim 15,32,33. Hvetekim inneholder en stor mengde translasjonsmaskiner og få oversettelseshemmere. Translasjonsmaskineriet i hvete, et medlem av eukaryoter, er egnet for å oversette eukaryote proteiner, og oversettelseseffektiviteten påvirkes knapt av kodonbruk av malen mRNA. Ved hjelp av hvetecellefritt system har vi syntetisert en rekke proteiner, inkludert proteinkinaser 34,35, ubiquitin ligaser36, transkripsjonsfaktorer37 og membranproteiner med høye suksessrater. For membranproteinproduksjon tilsetter vi lipidvesikkelliposom i translasjonsblandingen som stillas19,38. Hydrofobe domener av membranprotein interagerer med lipid dobbeltlag og er spontant integrert med liposom. Tetthetsgradient sentrifugering brukes til å strengt skille proteoliposom fra endogene hveteproteiner, selv om en vanlig sentrifugering av translasjonsreaksjonsblandingen er tilstrekkelig for en enkel rensing av proteoliposom20. Mange typer integrerte membranproteiner har blitt syntetisert ved hjelp av hvetecellefritt system og anvendt for ulike undersøkelser og utviklinger 25,38,39,40,41,42,43,44. Videre utviklet vi "tolags-dialysemetoden" for storskala produksjon45,46. I denne metoden er kopp-type dialyseanordning nedsenket i substratfôringsbufferen, og to lag med translasjonsreaksjonsblanding og substratfôringsbuffer dannes i koppen som vist i figur 1. Kontinuerlig tilførsel av substrater og fjerning av biproduktet kan utføres effektivt både på toppen og bunnen av reaksjonsblandingen i lang tid, noe som fører til utmerket oversettelseseffektivitet (figur 2A og figur 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membranproteiner spiller viktige roller i en rekke cellulære prosesser og utfører vitale funksjoner. Membranproteiner er medisinsk viktige i narkotikaforskning fordi de er mål for mer enn halvparten av alle legemidler. Et hinder for å gjennomføre biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier av membranproteiner samt antistoffutvikling har vært vanskeligheten med å produsere store mengder høykvalitets membranprotein med riktig konformasjon og aktivitet. Her beskriver vi en "dobbeltlagsdialysemetode" ved hjelp av et hvetekimcellefritt system, liposomer og dialysekopper for effektivt å syntetisere membranproteiner og tilberede rensede proteoliposomer på kort tid med høy suksessrate. Membranproteiner kan produseres så mye som i flere milligram, for eksempel GPCR, ionkanaler, transportører og tetraspaniner. Denne cellefrie metoden bidrar til å redusere tid, kostnader og krefter for å forberede proteoliposomer av høy kvalitet, og gir egnede midler for funksjonell analyse av membranproteiner, screening av legemiddelmål og antistoffutvikling.

Ved hjelp av denne protokollen kan delvis rensede proteoliposomer oppnås på kort tid. Representative resultater er vist i figur 2A. Tjuefem GPCR-er i klasse A, B og C ble vellykket syntetisert ved hjelp av tolagsdialysemetoden (liten skala) og delvis renset ved sentrifugering og buffervask. Selv om mengden syntetiserte proteiner varierer i henhold til typen protein, kan 50 til 400 μg membranproteiner vanligvis syntetiseres per reaksjon når store dialysekopper brukes. Flere milligram memb...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Denne protokollen beskriver en effektiv cellefri metode for produksjon av proteoliposom av høy kvalitet ved dobbeltlagsdialysemetode ved bruk av hvetecellefritt system og liposomer. Denne metoden gir egnede midler for funksjonell analyse av membranproteiner, screening av legemiddelmål og antistoffutvikling.

Cellefri produksjon av proteoliposomer for funksjonell analyse og antistoffutvikling rettet mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriell Inner-membran Display for Screening et bibliotek av antistoff-fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produksjon og rensing av et terapeutisk antistoff

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktivert tverrbundet Agarose for den raske utviklingen av affinitet kromatografi harpikser-antistoff fangst som en Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...