Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Это исследование было поддержано Проектом платформы для поддержки открытия лекарств и исследований в области наук о жизни (Основа для поддержки инновационных исследований в области лекарств и наук о жизни (BINDS)) от AMED под номером гранта JP20am0101077. Эта работа также была частично поддержана грантом JSPS KAKENHI No 20K05709.

1. Получение плазмиды экспрессии pEU
ПРИМЕЧАНИЕ: плазмида экспрессии pEU должна включать стартовый кодон, открытую рамку считывания белка целевой мембраны и стоп-кодон в фрагменте (см. Рисунок 1). При необходимости добавьте последовательность (последовательн?...

Представленный протокол обеспечивает способ получения мембранных белков с высокой успешностью. Этот протокол прост, хорошо воспроизводим и легко масштабируется. Он также имеет потенциал для сокращения времени и стоимости экспериментов, которые потребляют большое количество мембран...

Мембранные белки являются одной из наиболее важных лекарственных мишеней в диагностике и терапии. Действительно, половина мелких составных лекарств-мишеней являются мембранными белками, такими как рецепторы, связанные с G-белком (GPCR) и ионные каналы1. На протяжении многих лет исследователи работали над биохимическими, биофизическими и структурными исследованиями мембранных белков, чтобы выяснить их структуру и функцию 2,3. Разработка моноклональных антител против мембранных белков также активно осуществляется с целью ускорения функциональных и структурных исследований и разработки лечебно-диагностических приложений 4,5,6,7,8,9. Все эти исследования требуют большого количества высококачественных мембранных белков10. Например, для выработки антител необходимо несколько миллиграммов очищенных мембранных белков с естественной конформацией. Для рентгеновской кристаллографии требуется гораздо большее количество высокоочищенных мембранных белков. Тем не менее, массовое производство мембранных белков остается узким местом в исследовании мембранных белков11. Мембранные белки имеют сложные структуры с одной или несколькими трансмембранными спиралями и играют важную роль в клеточном гомеостазе. Гетерологичная сверхэкспрессия мембранных белков приводит к множественным препятствиям, таким как агрегация мембранных белков, которые накапливаются при высоких локальных концентрациях или нарушении клеточных сигнальных путей. Даже если выражение лица будет успешным, последующие этапы пробоподготовки также столкнутся с трудностями. Например, приготовление протеолипосом требует высоких навыков и профессионального опыта в солюбилизации, очистке и стабилизации мембранных белков, а также требует больших усилий и времени, а также12,13.
С другой стороны, в последние десятилетия появились некоторые передовые технологии для производства белков без использования живых клеток 14,15,16,17,18. Технология бесклеточного синтеза белка воссоздает реакцию трансляции в пробирке. Поскольку нет никаких ограничений, которые имеет система клеточной экспрессии, бесклеточные системы имеют потенциал для синтеза различных белков, которые трудно экспрессировать или проявлять токсичность в клетках. Очищенный клеточный экстракт или восстановленный поступательный механизм смешивают с шаблонными мРНК, аминокислотами и источниками энергии, а рекомбинантные белки синтезируются за короткое время. Что касается синтеза мембранного белка, некоторые виды каркасов, состоящих из липидов или амфифилов, такие как липосомы, бицеллы, нанодиски или сополимеры, добавляются к бесклеточной реакции 19,20,21,22,23,24. Синтезированные мембранные белки взаимодействуют с каркасами и могут стабилизироваться в воде. Бесклеточные синтезированные мембранные белки широко используются в функциональных исследованиях и выработке антител 25,26,27,28,29,30,31.
В этом протоколе мы описываем эффективный бесклеточный метод получения протеолипосом с использованием бесклеточной системы пшеницы и липосом. Бесклеточная система синтеза белка пшеницы представляет собой мощную систему трансляции in vitro с использованием экстракта из зародышей пшеницы 15,32,33. Зародыши пшеницы содержат большое количество трансляционных механизмов и мало ингибиторов трансляции. Трансляционный механизм в пшенице, входящей в состав эукариот, подходит для трансляции эукариотических белков, и на его эффективность трансляции практически не влияет использование кодона шаблонной мРНК. Используя бесклеточную систему пшеницы, мы синтезировали различные белки, включая протеинкиназы34,35, убиквитиновые лигазы36, факторы транскрипции37 и мембранные белки с высокими показателями успеха. Для производства мембранного белка мы добавляем липидные везикулярные липосомы в трансляционную смесь в виде каркаса19,38. Гидрофобные домены мембранного белка взаимодействуют с липидным бислоем и спонтанно интегрируются с липосомами. Центрифугирование градиента плотности используется для строгого отделения протеолипосом от эндогенных белков пшеницы, хотя обычной центрифугации реакционной смеси трансляции достаточно для простой очистки протеолипосомы20. Многие виды интегральных мембранных белков были синтезированы с использованием бесклеточной системы пшеницы и применены для различных исследований и разработок 25,38,39,40,41,42,43,44. Кроме того, мы разработали «двухслойно-диализный метод» для крупносерийного производства45,46. В этом способе устройство для диализа чашечного типа погружают в буфер подачи субстрата, и в чашке образуются два слоя реакционной смеси трансляции и буфер подачи субстрата, как показано на рисунке 1. Непрерывная подача подложек и удаление побочного продукта могут эффективно проводиться как в верхней, так и в нижней части реакционной смеси в течение длительного времени, что приводит к превосходной эффективности трансляции (фиг.2А и фиг.2В)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Мембранные белки играют важную роль в различных клеточных процессах и выполняют жизненно важные функции. Мембранные белки важны с медицинской точки зрения при открытии лекарств, потому что они являются мишенями более половины всех лекарств. Препятствием для проведения биохимических, биофизических и структурных исследований мембранных белков, а также развития антител была трудность в получении большого количества высококачественного мембранного белка с правильной конформацией и активностью. Здесь мы описываем «двухслойный метод диализа» с использованием системы без клеток зародышей пшеницы, липосом и диализных чашек для эффективного синтеза мембранных белков и получения очищенных протеолипосом за короткое время с высокой успешностью. Мембранные белки могут продуцироваться столько же, сколько в нескольких миллиграммах, таких как GPCR, ионные каналы, транспортеры и тетраспанины. Этот бесклеточный метод способствует сокращению времени, затрат и усилий на приготовление высококачественных протеолипосом и обеспечивает подходящие средства для функционального анализа мембранных белков, скрининга лекарственных мишеней и разработки антител.

Используя этот протокол, частично очищенные протеолипосомы могут быть получены за короткое время. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 2А. Двадцать пять GPCR классов A, B и C были успешно синтезированы с использованием метода двухслойного диализа (мелкомасштаб?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Данный протокол описывает эффективный бесклеточный метод получения высококачественной протеолипосомы двухслойно-диализным методом с использованием бесклеточной системы пшеницы и липосом. Этот метод обеспечивает подходящие средства для функционального анализа мембранных белков, скрининга лекарственных мишеней и выработки антител.

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Анализ специфичности гистонового антитела с пептидными микрочипами

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Моющее бесплатно сверхскоростной воссоздание мембранных белков в липидных бислоев с помощью дополнительных заряженные Proteoliposomes Fusogenic.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Определение функциональных белков регионов путем строительства химерных белка

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Активированный перекрестный связаны Агароуз для быстрого развития аффинити Хроматография resins - Захват антител как пример

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...