Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
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Esta investigación fue apoyada por Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de AMED bajo el número de subvención JP20am0101077. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI Número de subvención 20K05709.

1. Preparación del plásmido de expresión de pEU
NOTA: El plásmido de expresión de pEU debe incluir el codón de inicio, el marco de lectura abierto de la proteína de la membrana diana y el codón de parada en el fragmento (ver Figura 1). Agregue secuencias de etiquetas de detección/purificación en la posición adecuada cuando sea necesario. La digestión enzimática de restricción o la clonación sin fisuras son aplicables para la subclonación. Aquí descr...

El protocolo presentado proporciona un método para producir proteínas de membrana con una alta tasa de éxito. Este protocolo es simple, altamente reproducible y fácil de escalar. También tiene el potencial de reducir el tiempo y el costo de los experimentos que consumen una gran cantidad de proteínas de membrana. El método de diálisis bicapa mejora la productividad de 4 a 10 veces en comparación con el método bicapa o el método de diálisis (Figura 2B)45. E...

Las proteínas de membrana son uno de los objetivos farmacológicos más importantes en el diagnóstico y la terapéutica. De hecho, la mitad de los pequeños fármacos compuestos diana son proteínas de membrana, como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y los canales iónicos1. A lo largo de los años, los investigadores han estado trabajando en estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de proteínas de membrana para dilucidar su estructura y función 2,3. El desarrollo de anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana también se realiza activamente con el fin de acelerar los estudios funcionales y estructurales y desarrollar aplicaciones terapéuticas y diagnósticas 4,5,6,7,8,9. Todos estos estudios requieren una gran cantidad de proteínas de membrana de alta calidad10. Por ejemplo, se necesitan varios miligramos de proteínas de membrana purificadas con conformación natural para el desarrollo de anticuerpos. Se requiere una cantidad mucho mayor de proteínas de membrana altamente purificadas para la cristalografía de rayos X. Sin embargo, la producción masiva de proteínas de membrana sigue siendo un cuello de botella en la investigación de proteínas de membrana11. Las proteínas de membrana tienen estructuras complicadas con una o más hélices transmembrana y juegan un papel importante en la homeostasis celular. La sobreexpresión heteróloga de proteínas de membrana conduce a múltiples obstáculos, como la agregación de proteínas de membrana que se acumulan a altas concentraciones locales o la alteración de las vías de señal celular. Incluso si la expresión es exitosa, los pasos posteriores de preparación de la muestra también enfrentan dificultades. Por ejemplo, la preparación del proteoliposoma requiere habilidades de alto nivel y experiencia profesional en solubilización, purificación y estabilización de proteínas de membrana, y también cuesta mucho esfuerzo y tiempo12,13.
Por otro lado, algunas tecnologías avanzadas han surgido en las últimas décadas para producir proteínas sin el uso de células vivas 14,15,16,17,18. La tecnología de síntesis de proteínas libres de células reconstituye la reacción de traducción en un tubo de ensayo. Dado que no hay limitaciones que tiene el sistema de expresión celular, los sistemas libres de células tienen potencial para sintetizar una variedad de proteínas que son difíciles de expresar o muestran toxicidad en las células. El extracto celular purificado o la maquinaria traslacional reconstituida se mezcla con ARNm plantilla, aminoácidos y fuentes de energía, y las proteínas recombinantes se sintetizan en poco tiempo. En cuanto a la síntesis de proteínas de membrana, a la reacción libre de células se añaden algunos tipos de andamios compuestos de lípidos o anfifilios, como liposomas, biceles, nanodiscos o copolímeros 19,20,21,22,23,24. Las proteínas de membrana sintetizadas interactúan con los andamios y pueden estabilizarse en agua. Las proteínas de membrana sintetizadas libres de células se utilizan ampliamente en estudios funcionales y producción de anticuerpos 25,26,27,28,29,30,31.
En este protocolo, describimos un método eficiente libre de células de producción de proteoliposomas utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. El sistema de síntesis de proteínas libres de células de trigo es un potente sistema de traducción in vitro que utiliza extracto de germen de trigo 15,32,33. El germen de trigo contiene una gran cantidad de maquinaria de traducción y pocos inhibidores de traducción. La maquinaria de traslación en el trigo, un miembro de los eucariotas, es adecuada para traducir proteínas eucariotas, y su eficiencia de traducción apenas se ve afectada por el uso del codón del ARNm plantilla. Utilizando el sistema libre de células de trigo, hemos sintetizado una variedad de proteínas que incluyen proteínas quinasas 34,35, ligasas de ubiquitina36, factores de transcripción37 y proteínas de membrana con altas tasas de éxito. Para la producción de proteínas de membrana, agregamos liposoma de vesícula lipídica a la mezcla de traducción como andamio19,38. Los dominios hidrofóbicos de la proteína de membrana interactúan con la bicapa lipídica y se integran espontáneamente con el liposoma. La centrifugación por gradiente de densidad se utiliza para separar estrictamente el proteoliposoma de las proteínas endógenas del trigo, aunque una centrifugación común de la mezcla de reacción de traslación es suficiente para una purificación simple del proteoliposoma20. Muchos tipos de proteínas integrales de membrana han sido sintetizadas utilizando el sistema libre de células de trigo y aplicadas para diversas investigaciones y desarrollos 25,38,39,40,41,42,43,44. Además, desarrollamos el "método de diálisis bicapa" para la producción a gran escala45,46. En este método, el dispositivo de diálisis tipo copa se sumerge en el tampón de alimentación del sustrato, y se forman dos capas de mezcla de reacción de traducción y tampón de alimentación de sustrato en la copa, como se muestra en la Figura 1. El suministro continuo de sustratos y la eliminación del subproducto pueden llevarse a cabo de manera eficiente tanto en la parte superior como en la inferior de la mezcla de reacción durante mucho tiempo, lo que conduce a una excelente eficacia de traducción (Figura 2A y Figura 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Las proteínas de membrana desempeñan funciones esenciales en una variedad de procesos celulares y realizan funciones vitales. Las proteínas de membrana son médicamente importantes en el descubrimiento de fármacos porque son los objetivos de más de la mitad de todos los fármacos. Un obstáculo para la realización de estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de las proteínas de membrana, así como el desarrollo de anticuerpos, ha sido la dificultad para producir grandes cantidades de proteína de membrana de alta calidad con conformación y actividad correctas. Aquí describimos un "método de diálisis bicapa" utilizando un sistema libre de células germinales de trigo, liposomas y copas de diálisis para sintetizar eficientemente proteínas de membrana y preparar proteoliposomas purificados en poco tiempo con una alta tasa de éxito. Las proteínas de membrana se pueden producir tanto como en varios miligramos, como GPCR, canales iónicos, transportadores y tetraspaninas. Este método libre de células contribuye a reducir el tiempo, el costo y el esfuerzo para preparar proteoliposas de alta calidad, y proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Usando este protocolo, se pueden obtener proteoliposomas parcialmente purificados en poco tiempo. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Veinticinco GPCR de Clase A, B y C se sintetizaron con éxito utilizando el método de diálisis bicapa (pequeña escala) y se purificaron parcialmente por centrifugación y lavado tampón. Aunque la cantidad de proteínas sintetizadas varía según el tipo de proteína, generalmente se pueden sintetizar de 50 a 400 μg de proteínas de...

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Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Este protocolo describe un método eficiente libre de células para la producción de proteoliposoma de alta calidad por el método de diálisis bicapa utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. Este método proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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