Name: cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) från AMED under bidragsnummer JP20am0101077. Detta arbete stöddes också delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

1. Beredning av pEU-uttrycksplasmid
OBS: pEU-uttrycksplasmid bör inkludera startkodon, öppen läsram för målmembranprotein och stoppkodon i fragmentet (se figur 1). Lägg till sekvens(er) av detekterings-/reningstaggar på lämplig plats vid behov. Antingen restriktionsenzymsmältning eller sömlös kloning är tillämplig för subkloning. Här beskriver vi ett protokoll med en sömlös kloningsmetod.
<ol><li>Förbered sätt in DNA-fragment.<ol><li>Förstär...

Det presenterade protokollet ger en metod för att producera membranproteiner med hög framgångsgrad. Detta protokoll är enkelt, mycket reproducerbart och lätt att skala upp. Det har också potential att minska tiden och kostnaden för experiment som konsumerar en stor mängd membranproteiner. Dubbelskiktsdialysmetoden förbättrar produktiviteten med 4–10 gånger jämfört med tvåskiktsmetoden eller dialysmetoden (figur 2B)45. I ett extremt fall ökade utbytet ...

Membranproteiner är ett av de viktigaste läkemedelsmålen inom diagnos och terapi. Faktum är att hälften av små sammansatta läkemedel riktar sig till membranproteiner, såsom G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och jonkanaler1. Under åren har forskare arbetat med biokemiska, biofysiska och strukturella studier av membranproteiner för att belysa deras struktur och funktion 2,3. Utveckling av monoklonala antikroppar mot membranproteiner utförs också aktivt för att påskynda funktionella och strukturella studier och för att utveckla terapeutiska och diagnostiska tillämpningar 4,5,6,7,8,9. Alla dessa studier kräver en stor mängd membranproteiner av hög kvalitet10. Till exempel behövs flera milligram renade membranproteiner med naturlig konformation för antikroppsutveckling. En mycket större mängd högrenade membranproteiner krävs för röntgenkristallografi. Massproduktion av membranproteiner är dock fortfarande en flaskhals i membranproteinforskningen11. Membranproteiner har komplicerade strukturer med en eller flera transmembranhelices och spelar viktiga roller i cellhomeostas. Heterolog överuttryck av membranproteiner leder till flera hinder såsom aggregering av membranproteiner som ackumuleras vid höga lokala koncentrationer eller störningar av cellulära signalvägar. Även om uttrycket är framgångsrikt står efterföljande steg i provberedningen också inför svårigheter. Till exempel kräver beredning av proteoliposom hög kompetens och yrkeserfarenhet inom solubilisering, rening och stabilisering av membranproteiner och kostar mycket ansträngning och tid också12,13.
Å andra sidan har viss avancerad teknik dykt upp under de senaste decennierna för att producera proteiner utan användning av levande celler 14,15,16,17,18. Cellfri proteinsyntesteknik rekonstituerar translationsreaktion i ett provrör. Eftersom det inte finns några begränsningar som det cellulära uttryckssystemet har, har cellfria system potential att syntetisera en mängd olika proteiner som är svåra att uttrycka eller visa toxicitet i celler. Renat cellextrakt eller rekonstituerat translationellt maskineri blandas med mall-mRNA, aminosyror och energikällor, och rekombinanta proteiner syntetiseras på kort tid. När det gäller membranproteinsyntesen tillsätts vissa typer av byggnadsställningar som består av lipider eller amfifiler, såsom liposomer, biceller, nanodiscs eller sampolymerer till den cellfria reaktionen 19,20,21,22,23,24. Syntetiserade membranproteiner interagerar med byggnadsställningarna och kan stabiliseras i vatten. Cellfria syntetiserade membranproteiner används i stor utsträckning i funktionella studier och antikroppsproduktion 25,26,27,28,29,30,31.
I detta protokoll beskriver vi en effektiv cellfri metod för proteoliposomproduktion med hjälp av vetecellfritt system och liposomer. Vetecellfritt proteinsyntessystem är ett kraftfullt in vitro-översättningssystem som använder extrakt från vetegroddar 15,32,33. Vetegroddar innehåller en stor mängd translationella maskiner och få översättningshämmare. Translationsmaskineriet i vete, en medlem av eukaryoter, är lämpligt för översättning av eukaryota proteiner, och dess översättningseffektivitet påverkas knappast av kodonanvändning av mallen mRNA. Med hjälp av vetecellfritt system har vi syntetiserat en mängd olika proteiner inklusive proteinkinaser 34,35, ubiquitinligaser36, transkriptionsfaktorer37 och membranproteiner med höga framgångsgrader. För membranproteinproduktion tillsätter vi lipidvesikelliposom i översättningsblandningen som ställning19,38. Hydrofoba domäner av membranprotein interagerar med lipid-dubbelskikt och är spontant integrerade med liposom. Densitetsgradientcentrifugering används för att strikt separera proteoliposom från endogena veteproteiner, även om en gemensam centrifugering av translationsreaktionsblandningen är tillräcklig för en enkel rening av proteoliposom20. Många typer av integrerade membranproteiner har syntetiserats med hjälp av vetecellfritt system och tillämpats för olika undersökningar och utvecklingar 25,38,39,40,41,42,43,44. Dessutom utvecklade vi "dubbelskiktsdialysmetoden" för storskalig produktion45,46. I denna metod nedsänks dialysanordningen av kopptyp i substratmatningsbufferten och två lager av translationsreaktionsblandning och substratmatningsbuffert bildas i koppen som visas i figur 1. Kontinuerlig tillförsel av substrat och avlägsnande av biprodukten kan effektivt utföras på både toppen och botten av reaktionsblandningen under lång tid, vilket leder till utmärkt översättningseffekt (figur 2A och figur 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membranproteiner spelar viktiga roller i en mängd olika cellulära processer och utför vitala funktioner. Membranproteiner är medicinskt viktiga vid läkemedelsupptäckt eftersom de är mål för mer än hälften av alla läkemedel. Ett hinder för att genomföra biokemiska, biofysiska och strukturella studier av membranproteiner samt antikroppsutveckling har varit svårigheten att producera stora mängder högkvalitativt membranprotein med korrekt konformation och aktivitet. Här beskriver vi en "dubbelskiktsdialysmetod" med hjälp av ett vetegroddscellsfritt system, liposomer och dialyskoppar för att effektivt syntetisera membranproteiner och förbereda renade proteoliposomer på kort tid med hög framgångsgrad. Membranproteiner kan produceras så mycket som i flera milligram, såsom GPCR, jonkanaler, transportörer och tetraspaniner. Denna cellfria metod bidrar till att minska tid, kostnad och ansträngning för att framställa högkvalitativa proteoliposomer och ger lämpliga medel för funktionell analys av membranproteiner, screening av läkemedelsmål och antikroppsutveckling.

Med hjälp av detta protokoll kan delvis renade proteoliposomer erhållas på kort tid. Representativa resultat visas i figur 2A. Tjugofem GPCR av klass A, B och C syntetiserades framgångsrikt med hjälp av dubbelskiktsdialysmetoden (liten skala) och renades delvis genom centrifugering och bufferttvätt. Även om mängden syntetiserade proteiner varierar beroende på typen av protein, kan 50 till 400 μg membranproteiner vanligtvis syntetiseras per reaktion när stora dialyskoppar används....

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Detta protokoll beskriver en effektiv cellfri metod för produktion av högkvalitativ proteoliposom genom dubbelskiktsdialysmetod med användning av vetecellfritt system och liposomer. Denna metod ger lämpliga medel för funktionell analys av membranproteiner, screening av läkemedelsmål och antikroppsutveckling.

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriell Inner-membran Display för screening av ett bibliotek av antikroppsfragment

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion och rening av en terapeutisk antikropp

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifiering av funktionellt Protein regioner genom chimära Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiverat tvärbunden Aguppstod för den snabba utvecklingen av affinitet Kromatografihartser-antikropps fångst som en fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...