Name: dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00
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Nous tenons à remercier Lindsey W. Plasschaert et Justin Sui pour leurs contributions substantielles à l’élaboration précoce de ce protocole. Les auteurs sont reconnaissants à la communauté des mouches pour leur générosité avec les réactifs, et en particulier à Ruth Lehmann et Benjamin Lin pour leur don de la ligne nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' avant sa publication. Les stocks obtenus du Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) ont été utilisés dans cette étude. Ce travail a été soutenu par NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 et R35GM136270 (S.D) ainsi que par des bourses de formation T32GM007229 (B.W.) et F32GM125123 (L.A.).

1. Préparation du jour avant la dissection
<ol><li>Affûter électrolytiquement une aiguille en tungstène24 de sorte que le diamètre résultant soit d’environ 0,03 mm. Réglez la tension fournie à environ 14 V et utilisez 3,3 M NaOH. L’affûtage ne devrait pas prendre plus de 1 ou 2 min. ATTENTION: Le NaOH est très corrosif et causera des brûlures au contact de la peau. Portez des gants et des lunettes lors de la manipulation et travaillez à l’intérieur d’une hotte aspirante.<...

<ol>
	<li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome.">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li><li>Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Cadherin+is+required+for+centrosome+and+spindle+orientation+in+Drosophila+male+germline+stem+cells.">E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells.</a> PLoS One. 5, 1-7 (2010).</li><li>Lenhart, K. F., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+encystment+promotes+abscission+in+germline+stem+cells+following+a+regulated+block+in+cytokinesis.">Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis.</a> Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).</li><li>Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Germinal+Proliferation+Center+in+the+Testis+of+Drosophila+melanogaster.">The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+group+of+pumilio+mutations+affects+the+asymmetric+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 124, 2463-2476 (1997).</li><li>Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piRNA+pathway+is+developmentally+regulated+during+spermatogenesis+in+Drosophila.">The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila.</a> RNA. 22, 1044-1054 (2016).</li><li>Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+to+adult:+PiRNA-mediated+silencing+throughout+germline+development+in+Drosophila.">From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).</li><li>Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., P&#233;rez-Palencia, R., B&#246;kel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+BMP+receptor+activation+at+adherens+junctions+in+the+Drosophila+germline+stem+cell+niche.">Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche.</a> Nature Communications. 2, (2011).</li><li>Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes+mediate+niche-stem-cell+signalling+in+the+Drosophila+testis.">Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis.</a> Nature. 523, 329-332 (2015).</li><li>Leatherman, J. L., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfh-1+controls+somatic+stem+cell+self-renewal+in+the+Drosophila+testis+and+nonautonomously+influences+germline+stem+cell+self-renewal.">Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal.</a> Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).</li><li>Leatherman, J. L., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+self-renewal+requires+cyst+stem+cells,+while+stat+regulates+niche+adhesion+in+Drosophila+testes.">Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes.</a> Nature Cell Biology. 12, (2010).</li><li>Tulina, N., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stem+cell+self-renewal+in+Drosophila+Spermatogenesis+by+JAK-STAT+signaling.">Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling.</a> Science. 294, 2546-2549 (2001).</li><li>Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spermatogenesis+in+Drosophila+with+P-element+enhancer+detectors.">Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors.</a> Development. 114, 89-98 (1992).</li><li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila.">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+drosophila+testis.">Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).</li><li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche.">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).</li><li>Rebecca Sheng, X., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Aboim, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developpement+embryonnaire+et+post-embryonnaire+des+gonades+normales+et+agametiques+de+Drosophila+melanogaster.">Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster.</a> Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+actin+regulator+ENABLED+regulates+cell+shape+and+orientation+during+gonad+morphogenesis.">The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Au cours de la gonadogenèse, la gonade embryonnaire, et en particulier la niche de cellules souches dans la gonademâle 15, subit des changements morphologiques rapides. Les mécanismes de développement qui sous-tendent ces changements dynamiques sont mieux compris par des techniques d’imagerie en direct. Cependant, au stade embryonnaire 17, l’imagerie in vivo de la gonade est rendue impossible par l’apparition de contractions musculaires à grande échelle17</su...

Le testicule drosophila melanogaster a servi de paradigme pour notre compréhension de nombreux processus cellulaires dynamiques. Les études de ce modèle ont mis en lumière la régulationde la division des cellules souches 1,2,3, le développement des cellules germinales 4,5, la biologie des arnos 6,7,8 et les événements de signalisation des cellules souches de niche 9,10,11,12,13. Ce modèle est avantageux car il est génétiquement traitable14,15 et est l’un des rares où l’on peut imager en direct des cellules souches dans leur environnement naturel 3,16,17,18. Cependant, l’imagerie en direct de ce modèle a été limitée aux tissus adultes et aux premiers stades embryonnaires, laissant une lacune dans notre connaissance de la dynamique gonadique chez l’embryon tardif, le stade précis où la niche se forme et commence à fonctionner.
La gonade embryonnaire à un stade avancé est une sphère, composée de cellules de niche somatiques à l’antérieure et de cellules germinales enkystées par des cellules gonadiques somatiques dans des régions plus postérieures19. Cet organe peut être imagé en direct in vivo jusqu’au stade embryonnaire précoce 17 17,20,21. Une imagerie supplémentaire est empêchée en raison de l’initiation de contractions musculaires à grande échelle. Ces contractions sont si graves qu’elles poussent la gonade hors du cadre d’imagerie, et un tel mouvement ne peut pas être corrigé avec un logiciel d’imagerie. Notre laboratoire s’intéresse au dévoilement des mécanismes de formation de niches, qui se produit pendant cette période insaisissable pour l’imagerie en direct. Par conséquent, nous avons généré une approche ex vivo pour imager en direct la gonade à partir du stade embryonnaire 16, facilitant l’étude de la dynamique cellulaire pendant cette période cruciale du développement des gonades. Des travaux antérieurs de notre laboratoire montrent que cette imagerie ex vivo récapitule fidèlement le développement in vivo des gonades17. Cette technique est la première et la seule du genre pour la gonade embryonnaire de la drosophile.
Nous présentons ici le protocole de dissection requis pour l’imagerie en direct ex vivo de la gonade à la fin du stade embryonnaire. Ce protocole peut être combiné avec des traitements pharmacologiques ou une manipulation transgénique de lignées cellulaires spécifiques dans les gonades. En utilisant cette technique, nous avons photographié avec succès les étapes de la formation de niche de cellules souches17. Cette approche d’imagerie est donc déterminante pour le domaine de la biologie des cellules souches, car elle permettra de visualiser les premières étapes de la formation de niches en temps réel dans son environnement naturel15,17. Bien que cette méthode soit bénéfique pour le domaine de la biologie des cellules souches, elle est également applicable pour visualiser tous les processus dynamiques se produisant dans les gonades au cours de ce point temporel de développement, y compris les réarrangements cellulaires22, l’adhésion cellulaire 2,12,23 et la migration cellulaire23. Ce protocole de dissection améliorera ainsi notre compréhension de nombreux processus biologiques cellulaires fondamentaux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar&#160;Tungsten wire</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA10408G6</td>
			<td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>FBtp0056035</td>
			<td>Schuh, Lehner, &#38; Heidmann, Current Biology, 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td>
			<td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td>
			<td></td>
			<td>Lin, Luo, &#38; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#39;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td>
			<td></td>
			<td>FBtp0083398</td>
			<td>Sano et al., PLoS One, 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l0516</td>
			<td>Store aliquots at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nytex basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&#8217;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

La gonade embryonnaire mâle Drosophila melanogaster est un modèle avantageux pour étudier divers aspects de la biologie du développement, y compris, mais sans s’y limiter, le développement des cellules germinales, la biologie des piARN et la formation de niches. Ici, nous présentons une technique de dissection pour imager en direct la gonade ex vivo pendant une période où l’imagerie en direct in vivo est très inefficace. Ce protocole décrit comment transférer des embryons dans une boîte d’imagerie, choisir des embryons mâles mis en scène de manière appropriée et disséquer la gonade de ses tissus environnants tout en maintenant son intégrité structurelle. Après dissection, les gonades peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal pour visualiser les processus cellulaires dynamiques. La procédure de dissection nécessite un timing et une dextérité précis, mais nous fournissons un aperçu de la façon de prévenir les erreurs courantes et de surmonter ces défis. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole de dissection pour la gonade embryonnaire de la drosophile et permettra l’imagerie en direct pendant une fenêtre de temps autrement inaccessible. Cette technique peut être combinée avec des manipulations transgéniques pharmacologiques ou spécifiques au type cellulaire pour étudier tout processus dynamique se produisant à l’intérieur ou entre les cellules dans leur environnement gonadique naturel.

Nous illustrons la préparation de la boîte d’imagerie à la figure 1, comme décrit dans « Préparation du jour de la dissection ». Ces méthodes devraient finalement aboutir à des embryons bien hydratés collés à une bande de couverture, qui est temporairement fixée au fond du plat et immergée dans la solution de Ringer (Figure 1F). Un couteau à pointe de diamant permet de trancher proprement un couvercle de 22 x 22 mm glissé en trois à quatre ban...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

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