Name: biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions
Uploaded: 2020-12-01T14:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

يشكر المؤلف الدكتورين يوجيرو هاياشي وهياتو إيشيكاوا على توفير الأوسيلتاميفير، والدكتور لي ماكوفسكي على توفير برامج RELIC القائمة بذاتها. كما يعترف المؤلف بتيتسويا كاواغوي للمساعدة التقنية التي قُدِّمَت من تجربة QCM. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI منحة رقم 17K01363 (Y.T.).
بيان توفر البيانات
برامج الـ RELIC المستقلة وبيانات تسلسل الببتيدات المختارة للأدوية وكذلك تسلسل البروتين من قاعدة بيانات البروتيوم المستخدمة في هذه الورقة متاحة من هذا المؤلف عند الطلب (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

ملاحظة: فيما يلي الخطوات لفحص phages T7 التعرف على المخدرات باستخدام جهاز استشعار حيوي QCM واسترداد phages فحصها عن طريق الإشريكية القولونية (BLT5615) العدوى. يمكن العثور على بروتوكولات لتركيب مشتق من جزيء صغير يشكل أحادية تجميعها الذاتي (SAM) وبناء مكتبة الببتيد العشوائي T7 عرض 15-mer في مكان آخر6,7.
1. إعداد رقاقة الاستشعار QCM
<ol><li>إرفاق رقاقة استشعار السيراميك على مذبذب جهاز QCM MHz 27، وتسجيل التردد الجوهري (هرتز) في مرحلة الهواء قبل شل حركة الجزيئات الصغيرة.</li>
	<li>فصل رقاقة وإسقاط 20 ميكرولتر من محلول (1 mM في 70٪ الإيثانول) من جزيء مشتق صغير يشكل سام على القطب الذهبي لرقاقة الاستشعار باستخدام ماصة. تنبيه: يوجد بلورة رقاقة الاستشعار حيث يوجد قطب الذهب (Au، 0.1 مم، 2.5 مم i.d.، 4.9 مم2)رقيقة للغاية وقد صدع بسهولة (SiO2،0.06 مم سميكة، 9 مم i.d.). وبالتالي، الماصة بعناية.</li>
	<li>اتركيه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) في طبق بيتري مع أنسجة مبللة ومحمية من أضواء الغرفة.</li>
	<li>غسل سطح القطب بلطف مع المياه فائقة الطهر؛ ثم، إزالة قطرات الماء عن طريق تهب الهواء مع حقنة أو الهواء منفضة.</li>
	<li>إعداد رقاقة الاستشعار لجهاز QCM وتسجيل الانخفاض في التردد في مرحلة الهواء لقياس كمية الجزيء الصغير الذي تم شل حركته. ملاحظة: على الأقل، 100 هرتز من التردد الجوهري ضروري لشل جزيء صغير ناجح (1 Hz 30 pg).</li>
</ol>2. Biopanning من مكتبة Phage T7 باستخدام جهاز استشعار حيوي QCM (الشكل 1)
<ol><li>تعيين cuvette مع مُنجل مغناطيسي مخصص على جهاز الاستشعار الحيوي QCM وصب 8 مل من العازلة رد فعل (10 mM تريس-HCl, 200 mM NaCl, درجة ح H 7-8) في cuvette.</li>
	<li>إرفاق رقاقة الاستشعار QCM إلى المذبذب وسحب أسفل ذراع مذبذب لغمر رقاقة في المخزن المؤقت يجري أثار في 1000 دورة في الدقيقة.</li>
	<li>ابدأ في مراقبة تردد QCM على الكمبيوتر الشخصي (PC) وانتظر حتى يُرجّح تخطيط الحسية إلى حوالي 3 هرتز/دقيقة من الانجراف الترددي.</li>
	<li>حقن 8 ميكرولتر من مكتبة Phage T7 (1-2 ×10 10 pfu/mL) في cuvette (التركيز النهائي: 1-2 ×10 7 pfu/mL) ووضع علامة على نقطة الحقن على جهاز الاستشعار.</li>
	<li>مراقبة الحد من التردد الناجم عن ربط phages T7 إلى جزيء صغير شلت على سطح القطب الذهب لمدة 10 دقيقة.</li>
	<li>وقف QCM رصد التردد، طرد رقاقة الاستشعار من المذبذب، وإزالة العازلة عن طريق تهب الهواء و / أو فتل بعيدا مع مناديل.</li>
	<li>ضع رقاقة الاستشعار في طبق بيتري رطبة وأسقط 20 ميكرولتر من تعليق E. coli (BLT5615) (OD600 = 0.5-1.0 بعد أن تهتز عند 37 درجة مئوية عن طريق إضافة خلايا IPTG إلى 1 mM) في مرحلة اللوغاريت الذهبي.</li>
	<li>أغلق غطاء الطبق واغطيه برقائق الألومنيوم لمنع الضوء.</li>
	<li>احتضان الطبق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على خلاط 96-جيدا microplate (1000-1500 دورة في الدقيقة) لتعزيز الانتعاش من T7 phages ملزمة.</li>
	<li>استعادة 20 ميكرولتر من الحل وتعليقه إلى 200 ميكرولتر من متوسطة LB. ملاحظة: يمكن الحفاظ على العينات التي تم الحصول عليها في هذه الخطوة عند 4 درجة مئوية في أسبوع واحد.</li>
	<li>إعداد سلسلة تخفيف من محلول phage لعزل البلاك وتسلسل الحمض النووي وفقا للإجراء العام الموصوف في تعليمات الشركة المصنعة8,9.</li>
	<li>امسح سطح قطب الذهب بمسحة قطنية منقوقة بمحلول دوديسيل كبريتات 1٪ من الصوديوم.</li>
	<li>غسل سطح الذهب مع الماء فائقة الخطورة من زجاجة الغسيل ثم إزالة قطرات الماء عن طريق تهب الهواء مع حقنة أو الهواء منفضة.</li>
	<li>قطرة 5 ميكرولتر من محلول البيرانا (Conc. H2SO4:30٪ H2O2 = 3:1) على سطح الذهب وترك لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>غسل سطح الذهب مرة أخرى بالماء ثم يجف عن طريق تهب الهواء و / أو فتل بعيدا مع مناديل.</li>
	<li>كرر الخطوات 2.14 و 2.15. تنبيه: قم بإعداد محلول البيرانا مباشرة قبل الاستخدام. استخدام هذا السائل بعناية، كما هو حمض قوي جدا. العلاج لأكثر من 5 دقائق يتآكل رقاقة الاستشعار.</li>
</ol>3. تحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام مستقبلات ليغاند الاتصال (ريليك) جناح برنامج(الشكل 2)10,11
<ol><li>فك ضغط برنامج RELIC المستقل على جهاز كمبيوتر مع نظام تشغيل MS Windows.</li>
	<li>محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية من 15-mer الببتيدات تقارب المحددة باستخدام المخدرات أو اختيار عشوائي من مكتبة الأم غير مسمّاة في كل ملف تنسيق النص (الاسم.txt).</li>
	<li>اكتب تسلسل الأحماض الأمينية من البروتين (البروتينات) واحد أو متعددة في كل ملف نصي مع شكل FASTA، أو تحميل الملفات النصية قاعدة البيانات في شكل FASTA من أي قاعدة بيانات البروتين (مثل UniProt (http://www.uniprot.org/) أو DrugBank (https://www.drugbank.ca/).</li>
	<li>ضع الملفات النصية (وملفات PDB لـ HETEROalign) في المجلد الضروري لتشغيل كل برنامج RELIC.</li>
	<li>انقر فوق الملف التنفيذي (برنامج.exe) لAADIV، INFO، MOTIF، MATCH، HETEROalign، FASTAcon، و FASTAskan في المجلد المستقل لفتح الإصدار الشخصي من FTN95.</li>
	<li>اكتب اسم الملف المناسب مع الملحق (الاسم.txt) في رسالة الأمر لتنفيذ كل برنامج والحصول على ملف تنسيق النص المطلوب.</li>
	<li>تصدير الملف النصي الناتج إلى برنامج جدول بيانات (على سبيل المثال، Excel) لإنشاء قطعة من محتوى المعلومات (INFO) أو درجات التشابه التراكمية المحسوبة باستخدام BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign). ملاحظة: لم يعد ملقم RELIC الأصلي (http://relic.bio.anl.gov) متوفرًا ويمكن الحصول على بعض برامج RELIC من النوع المستقل التي تعمل على أجهزة الكمبيوتر مع نظام أساسي لـ Windows من المؤلف المقابل (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display.">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics:+an+update.">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics.">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule.">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase,+DWARF4,+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display.">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+Select&#174;+System+Manual.">T7 Select&#174; System Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrientExpressTM+cDNA+Manual.">OrientExpressTM cDNA Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+(CPT-11).">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li><li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases.">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li><li>Kim, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+inhibitors+possessing+a+novel+hydrophobic+interaction+in+the+enzyme+active+site:+design,+synthesis,+and+structural+analysis+of+carbocyclic+sialic+acid+analogues+with+potent+anti-influenza+activity.">Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).</li><li>Hoffmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+pharmacokinetics+of+oseltamivir+and+oseltamivir+carboxylate+in+the+central+nervous+system.">Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DrugBank+5.0:+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018.">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li><li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin.">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool.">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li><li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+(SAM)+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+(QCM)+device.">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li><li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein.">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+(CPT-10-B)+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device.">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li><li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

وهنا، تم عرض استراتيجية للانزيم الحيوي القائم على QCM للببتيدات التي تعترف بالمخدرات، تليها تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق من تفاعلات بروتين المخدرات باستخدام الببتيدات المحددة. تصميم مشتقات الجزيء الصغيرة لشل الحركة على القطب الذهبي للحساسية الحيوية هو خطوة هامة، كما قد الرابط المقدمة تعوق الربط وجمع الببتيد الذي يعترف المخدرات. لتجنب هذا ، يتم إعداد المشتقات ذات المواقف المختلفة من الرابط المقدم23. بدلا من ذلك، لشل حركة الجزيئات الصغيرة hydrophobic، يتم غمر رقاقة الاستشعار في الماء السائبة في طبق بيتري 10 سم، ويتم إسقاط حل 20 ميكرولتر من جزيء صغير (10 mM حل في ثنائي الفينيل السلفوكسيد) على القطب الذهبي من جهاز الاستشعار الحيوي، لتغطية سطحه، ومحتضنة لمدة 5 دقائق. وهذا يسمح بالاحتفاظ بتردد هرتز الجوهري من الجزيئات الصغيرة، الذي يتم الاحتفاظ به لمدة 10 دقائق على الأقل أثناء الغسل الحيوي. في الواقع ، باستخدام هذا الجمود ، والببتيدات أوسيل التي تم اختيارها ، أبرزت بوضوح موقع Osel ملزم في NA (الشكل 3).
يتم هندسة phage T7 المستخدمة لإعداد مكتبة الببتيد هنا وراثيا باستخدام الكاسيت NNK15 الذي يقوم بترميز 32 كودون لجميع الأحماض الأمينية القياسية 20 ويقمع ظهور codons وقف 2 (UAA, UGA) ويظهر فقط UAG (الشكل 1)6,7. وهذا أمر مهم لعرض الببتيدات كاملة الطول 15 مر وزيادة تنوع المكتبة. نظام عرض T7 phage لديه حد العرض الفني من 107-109 T7 phages. ومع ذلك, التنوع من ال 15-mer [ببتيد] مكتبة نظريّا 2015 (3.27 × 1019); وهكذا، لا يمكن استخدامه لبناء مكتبة كاملة. ومع ذلك، فإن البحث عن التشابه أو التعدين من الزخارف المحفوظة يسمح الكشف عن الأحماض الأمينية التي تتألف من مواقع ملزمة المخدرات من البروتينات حتى مع هذا التنوع المحدود من الببتيدات في المكتبة. وبالإضافة إلى ذلك، 3-5 تمتد الأحماض الأمينية داخل مكتبة الببتيد (معدل ظهور بين 1/203 و 1/ 205،والتي يمكن أن تتحقق باستخدام نظام عرض T7 phage) وتشارك في التعرف على أدوية جزيء صغير؛ لذلك، لا يلزم تطابق 100٪ من متواليات الببتيد مع تسلسلات الأحماض الأمينية 15-mer التي تشكل موقع الربط الدوائي للبروتين المستهدف. في الواقع، ما يقرب من 30 الببتيدات التي تم اختيارها تقارب بنجاح أبرز موقع الربط من البروتين الهدف لكل دواء اختباره(الشكل 4). وهكذا، فإن تنوع مكتبة Phage الأم T7 المستخدمة (1.7 ×10 7 pfu/mL) يمكن استخدامه لإعادة بناء موقع الربط بالعقاقير بشكل أساسي.
عادة، ظهرت 3-5 نسخ من phages T7 التي عرضت نفس تسلسلات تلك من تسلسل الأحماض الأمينية 15-mer التي تأوي امتدادات الأحماض الأمينية المعترفة بالعقاقير داخل اللويحات الـ 16 المعزولة بشكل تعسفي، مما يشير إلى نجاح اختيار التقارب بموجب بروتوكولنا. وهذا يشير إلى أن 18-30 مختلفة المخدرات التعرف على تسلسل الببتيد يتم جمعها داخل 96 لويحات معزولة (ويرتبط الرقم مع شكل microplate)، والتي يتم تحديدها في وقت لاحق باستخدام تسلسل الحمض النووي والحصول على تسلسل الأحماض الأمينية المقابلة. في الاستراتيجية الحالية ، حقن 8 ميكرولتر من مكتبة T7 phage في cuvette التي تحتوي على 8 مل العازلة (1000 أضعاف تخفيف المكتبة) هو مناسبة للحد من الربط غير محددة من phages T7. لزيادة تنوع الببتيدات المختارة من التقارب، تكرار اختيار دورة واحدة عدة مرات واستخدام 16 أو 32 عزل البلاك لكل فحص ثبت أن تكون أكثر فعالية من العزلة عن حل واحد في وقت واحد. على سبيل المثال، لجمع نحو 30 ببتيدات منتقاة من القرابة بشكل مختلف، تم إجراء 3-6 مجموعات من اختيار دورة واحدة، وتم عزل 16 أو 32 لويحات في كل تجربة. يشار إلى ظهور تسلسلات متطابقة في جميع 16 أو 32 T7 فيج لويحات الكشف عن طريق الخطأ من الخلفية أو قد تلوث كما حمل. في المقابل، فإن غياب phages T7 مع نفس التسلسل أو المظهر للعديد من phages T7 مع الببتيدات أقصر من طول 15 مير يشير إلى أن Phages T7 في السكان غير ظهرت على وجه التحديد مع احتمال كبير. كما يحدث الحد من التردد QCM إلى نفس القدر حتى في مثل هذه الحالات، ينبغي تقييم نجاح الاختيار بشكل شامل من خلال تسلسل الحمض النووي للphage T7 معزولة، تليها تحليل المعلوماتية الحيوية من تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيدات. وعلاوة على ذلك، على عكس بروتوكول عرض T7 phage التقليدية، تكرار جولات من اختيار أقل فعالية، كما الاختلاف وعدد من phages T7 صغيرة ولا تتركز حتى بعد تكرار خطوات التضخيم والاختيار23.
الأهم من ذلك، هذه الطريقة قابلة للتطبيق لتعدين مواقع صغيرة لتكبيك الجزيئات في البروتيومات من البشر، الفيروسات المسببة للأمراض، وحتى النباتات. ومن المثير للاهتمام, وربما غير منظم طول العرض القصير من الببتيدات على t7 phage capsid يمكن محاكاة الديناميات الجزيئية للببتيدات من البروتينات أثناء الالتحام مع جزيء صغير; يمكن أن يعكس هذا الربط الديناميكي24. وإلى جانب القيود التقنية للأساليب التقليدية، فإن هذه الاستراتيجية، التي تنطبق على بروتوكولات مماثلة للجزيئات الصغيرة، قد توسع البروتيوم القابلة للتخويد، فضلا عن توفير المزيد من التفاصيل فيما يتعلق بتحليل التفاعل بين المخدرات والبروتين.
وينبغي النظر في بعض القيود التقنية لهذا النهج. التركيب العضوي ضروري لشل جزيء صغير على سطح القطب الذهبي لرقاقة المنادق الحيوي. بالنسبة لغير الخبراء في الكيمياء العضوية ، تتوفر بعض الكواشف المتحركة تجاريًا لإصلاح الجزيء الصغير ميكانيكيًا عن طريق الاقتران. وعلاوة على ذلك, بعض أجزاء هراء من الببتيدات قد يؤدي إلى الكشف عن جزء من البروتين لا علاقة لدواء الالتحام كما ايجابيات كاذبة. وهذا يتوافق تجريبيا إلى بيتا ورقة أو ليوسين الغنية المجالات الغنية في بقايا ليوسين أو فالين، والتي يتم ترميزها من قبل أكثر كودون من غيرها من الأحماض الأمينية القياسية، عندما يتم إنتاج نسخ من phage T7. التحكم في طول ببتيد مكتبة قد تتحكم في حدوث ايجابيات كاذبة. وعلى النقيض من ذلك، قد تكون هناك حالات لا يتم فيها اكتشاف بقايا الأحماض الأمينية في موقع الربط بالعقاقير التي تشارك في الإرساء، كما هو موضح باستخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية أو تحليل الـ NMR. ويمكن حل هذا عن طريق جمع عدد أكبر من الببتيدات التعرف على المخدرات أو تغيير اتجاه تحديد جزيئات صغيرة على القطب الذهبي.
العديد من التفاعلات الدوائية البروتينية التي ترتبط بالآثار الرئيسية والثانوية لتعاطي المخدرات قد تكون مجهولة في البروتيوم. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون الإنزيمات والناقل المسؤولين عن امتصاص المخدرات، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإفراز، والسمية، أيضاً غير معروفة. البروتين ملزمة ليست مسؤولة دائما عن النشاط البيولوجي للدواء. وهكذا، فإن الجمع بين المعلومات الأخرى المستقاة من الإحصاءات البيولوجية سيحسن من تحديد الأهداف الأساسية للمخدرات المسؤولة عن الآثار الرئيسية والضارة للمخدرات. وسوف مزيد من التكيف من هذه التقنية موجزة زيادة العملية والإنتاجية للتعدين من مواقع البروتين ملزمة لمجموعة واسعة من الأدوية جزيء صغير. الطريقة المعروضة هنا سوف تسهم إلى حد كبير ليس فقط في إجراء البحوث الأساسية في المجالات ذات الصلة ولكن أيضا توضيح الآليات الجزيئية التي تقوم عليها فعالية علاجية أو غيرها من الآثار البيولوجية للأدوية في الاستخدام السريري.

وتحديد الأهداف الملزمة للمخدرات أمر أساسي لتطوير العقاقير وكذلك لفهم الآليات الجزيئية للأمراض. على وجه الخصوص، مستقبلات و إنزيم البروتينات هي أهم الأهداف الجزيئية للجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا1. على الرغم من أن القبض على تقارب هو تقنية راسخة لتحديد البروتينات ملزمة المخدرات2, القيود التقنية, مثل ذوبان منخفض من البروتينات, غالبا ما تعيق التحقق من أهداف المخدرات2. والأهم من ذلك، أن الجزيئات الصغيرة التي شلت الحركة تفقد درجة الحرية اللازمة للرسو وقد يتعذر الوصول إليها من مواقع الربط الموجودة داخلياً على بروتينات مستهدفة أكبر. وعلاوة على ذلك، فإن التكبيل بالبروتين وعدم القدرة على تحليل ظروف التبلور المشترك والقيود الناجمة عن الحجم الجزيئي غالباً ما تعوق استخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية، والرنين المغناطيسي النووي (NMR)، وغيرها من التحليلات التجريبية لدراسة تفاعلات البروتينات الدوائية.
استخدام عرض phage T7 هو وسيلة فعالة لتحديد موقع ملزم على البروتينات لطعم جزيء صغير3. وعلى وجه الخصوص، فإن مكتبة الببتيد العشوائية المعروضة على شكل T7 phage، والتي يمكن بناؤها عن طريق إدخال الحمض النووي الاصطناعي في موقع متعدد الاستنساخ، فعالة. بالمقارنة مع مكتبة T7 phage عرض البروتينات، والببتيدات القصيرة يمكن هندستها بسهولة ليتم عرضها على phage T7 من دون قيود مادية، والتي يمكن أن تتصل بشكل طبيعي مع أي دواء جزيء صغير ثابت على دعم الصلبة2. وعلاوة على ذلك، فإن إدخال الحساسية الدقيقة الكوارتز-الكريستال (QCM) في منصة عرض T7 phage biopanning يسمح بتحديد مثل هذه التفاعلات الضعيفة ولكن محددة من الببتيدات القصيرة مع المخدرات عن طريق رصد الانخفاض في تردد QCM4،5. ثم يتم استرداد phage T7 المنضم مباشرة عن طريق إصابة القولونية المضيفة Escherichia (BLT5615) ، ويتم تحديد تسلسل الحمض النووي للمنطقة التي يشفر الببتيد المختار الذي يضم شرائح قصيرة معترفة بالمخدرات. التحليل اللاحق لسلسلة الأحماض الأمينية من السكان الببتيد يوفر معلومات بشأن التعرف على المخدرات. في المحاذاة pairwise silico من الأحماض الأمينية التي تم إنقاذها تسلسل يمكن استخدامها للحصول على معلومات بشأن الهدف البيولوجي للدواء داخل البروتيوم مختارة. ويمكن استخدام هذا التحديد عالي الإنتاجية لشظايا البروتين مع تقارب نحو عقار لإعادة بناء موقع ربط المخدرات بشكل أساسي بطريقة مماثلة لتلك التي لإعادة بناء قطعة أثرية قديمة من قطع الفخار6. وعلى وجه الخصوص، يمكن أن يكون هذا النهج الفريد مفيداً عندما تفشل مقاربات البروتيوميات التقليدية.
هنا، نقدم استراتيجية المستندة إلى الاستشعار الحيوي ل biopanning من الببتيدات T7 phage عرض وتحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق من صحة الهدف من الجزيئات الصغيرة. وإلى جانب القيود التقنية المفروضة على الطرق التقليدية، تمكن هذه الاستراتيجية من تحديد مواقع ربط المخدرات على البروتينات المستهدفة لأي جزيء صغير ذو أهمية بموجب البروتوكول المماثل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

المستقبلات والبروتينات الانزيمات هي الجزيئات الحيوية الهامة التي تعمل كأهداف ملزمة للجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا. وهكذا، فإن التحقق السريع والعالمي من التفاعلات الدوائية البروتينية مرغوب فيه للغاية ليس فقط لفهم الآليات الجزيئية الكامنة في الفعالية العلاجية ولكن أيضا لتقييم خصائص الدواء، مثل الامتزاز، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإفراز، والسمية (ADMET) للاستخدام السريري. هنا، نقدم استراتيجية إنتاجية عالية القائمة على الاستشعار الحيوي ل biopanning من الببتيدات القصيرة عرض T7 phage التي يمكن عرضها بسهولة على capsid phage. كما يظهر التحليل اللاحق لمتواليات الأحماض الأمينية للببتيدات التي تحتوي على أجزاء قصيرة ، كـ "آثار مكسورة" لمواقع الربط بالعقاقير باستخدام برامج المعلوماتية الحيوية في مجموعة الاتصال المستقبلة (RELIC). من خلال تطبيق هذه الطريقة على اثنين من الأدوية المعتمدة سريريا، وirinotecan المضادة للورم، ومكافحة الانفلونزا أوسيلتاميفير، يتم شرح العملية التفصيلية لجمع تسلسل الببتيد الاعتراف بالمخدرات وتسليط الضوء على مواقع ربط المخدرات من البروتينات المستهدفة في هذه الورقة. ويمكن تطبيق الاستراتيجية المذكورة هنا على أي جزيئات صغيرة ذات أهمية.

تظهر النتائج التمثيلية لاثنين من الأدوية المعتمدة سريريا في الشكل 3. Irinotecan (الشكل 3A) ، وهو برودريج قابل للذوبان في الماء من camptothecin الطبيعية المستخدمة لعلاج سرطان القولون والمستقيم متقدمة وغير صغيرة سرطان الرئة الخلية ، يتم تحويلها إلى SN -38 في الكبد ، الذي يمنع topoisomerase الأول في الخلايا السرطانية12. وعلاوة على ذلك، هذا المركب يمنع مباشرة أستيلينستيراز (AChE)13،14. ومن خلال هذه الاستراتيجية، تم تحديد 29 ببتيدات تعرف على Iri التي تم تثبيتها كـ SAM من قبل مجموعات فرعية من المواد البيولوجية القائمة على QCM. اللاحقة محاذاة زوج من الببتيدات 29 و AChE أسفرت عن درجات القصوى لY121، Q225، F290، E327، H440، وY442 وتسليط الضوء على جزء في هيكل ثلاثي الأبعاد. وكانت هذه المخلفات الأحماض الأمينية متسقة مع تلك التي تشكل موقع Iri ملزمة من AChE. نفس المجموعة الفرعية من الببتيدات حددت بنجاح E99، L100، L252، L305، I387، وV474 في محيط الثلاثي الحفاز (S221، E353، H467) في الكربوكسترايز (CE)، مشيرا إلى أن هذه الأحماض الأمينية تشكل سقالة للاعتراف Iri خلال إزالة استريشن Iri15. ولا يمكن تحديد هذه المخلفات من الأحماض الأمينية في الموقع الحفاز مباشرة باستخدام التصوير البلوري التقليدي بالأشعة السينية أو تحليل الـ NMR، حيث أن تفاعل الإنزيم يسير بسلاسة ولا يشكل مركب ثابت ثابت في ظل ظروف تجريبية عامة. وهكذا ، فإن الكشف المجمع لمواقع ملزمة للمخدرات من البروتينات المتعددة ، بما في ذلك تلك الموجودة في المجمعات الوسيطة ربما تكونت مع الانزيمات خلال التفاعلات الأيضية لدواء معين ، من الممكن استخدام الببتيدات المختارة تقاربا محددة لدواء واحد.
ويبين الشكل 3B النتائج الأخرى التي تم الحصول عليها لاوسيلتاميفير (أوسيل)، وهو دواء مضاد للإنفلونزا التي يتم تنشيطها إلى الكربوكسيلبيلات oseltamivir، والذي بدوره يمنع نيورامينيداز (NA) من فيروس الأنفلونزا16. ال 27 من الببتيدات التي اعترفت Osel تغطي QCM استشعار رقاقة الذهب القطب كشف بنجاح موقع أوسل ملزمة في NA16. يتكون هذا الموقع الربط من حلقات الببتيد غير منظمة التي يحتمل أن تخضع لحركة ديناميكية أثناء الالتحام مع أوسل. الببتيدات التي تعترف Osel على غطاء T7 phage قد تحاكي هذا الالتحام الديناميكي عند ربط إلى أوسيل ثابتة على سطح القطب الذهبي لرقاقة الاستشعار QCM. وقد تم تحديد الأحداث السلبية العصبية النفسية (NPAEs) في المرضى الشباب الذين يعانون من الأنفلونزا، والتي تؤثر على المرضى وربما ترتبط إلى المرض نفسه بدلا من المخدرات. وقد أظهرت الدراسات أن Osel يتم تصديرها بنشاط من الجهاز العصبي المركزي (CNS) من القوارض عن طريق مقاومة الأدوية المتعددة (MDR) البروتين في حاجز الدم في الدماغ (BBB)17. في الواقع, واحدة من البروتينات من فئة هذا MDR أظهرت درجة عالية (أعلى 5٪ من 4,396 في قاعدة بيانات البروتين 1.0 DrugBank18), بالإضافة إلى ناقلات أخرى, الإنزيمات الناقل العصبي ذات الصلة, ومستقبلات, في دراستنا. ويجري التحقيق في الأهمية الدوائية لهذه البروتينات فيما يتعلق بظهور الآثار السلبية لـ Osel.
حتى الآن، واحدة ومتعددة مواقع صغيرة لجليد الجزيئات على البروتينات المستهدفة تم تحديدها بنجاح لستة جزيء الأدوية الصغيرة تستخدم استراتيجيتنا(الشكل 4). لBrz2001 وromsythromycin (RXM) ، تم تحديد مواقع ملزمة للمخدرات متطابقة على البروتين المستهدف باستخدام برك مختلفة من الببتيدات ، والأرقام وتسلسل الأحماض الأمينية التي تختلف تماما7،19. وعلاوة على ذلك، أدت برك الببتيد المفردة التي تم الحصول عليها لـ Iri وRXM و Osel إلى تحديد مواقع الربط المتعددة على بروتينات مختلفة لكل دواء، مثل AChE وCE لـ Iri (الشكل 3A)20و CYP3A4 لـ RXM19و21وNA والبروتين المرتبط بـ MDR لـ Osel. تم تحديد هدف جزيئي غير معروف لمركب دوكسيوروبيسين المضاد للورم (FANCF)22، والمضادات الحيوية المضادة للجيوجينية المضادات الحيوية RXM (angiomotin)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي لـ QCM bioensor المستندة إلى biopanning مكتبة الببتيد T7 phage عرض. يتم حقن مكتبة Phage T7 التي تعرض الببتيدات العشوائية في cuvette التي تحتوي على العازلة (تحت التحريك) حيث يتم غمر رقاقة QCM biosensor وتثبيت التردد. بعد رصد الحد من التردد بسبب ربط phages T7 إلى جزيئات صغيرة غير ثابتة على سطح القطب الذهبي لرقاقة الاستشعار ، يتم فصل رقاقة الاستشعار عن المذبذب. ثم يتم استرداد الحمض النووي من phage T7 ملزمة مباشرة بعد المضيف E. القولونية (BLT5615) العدوى. يتم عزل phages T7 الناتجة عن تشكيل البلاك، وأخيرا، يتم تحديد تسلسل الأحماض الأمينية من ببتيد المخدرات التي تم اختيارها على الكبسيد T7 phage وفقا لطريقة عرض phage العام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> الشكل 2: التمثيل التخطيطي للتقييم الكمي للمقارنة التسلسلية بين الببتيدات المختارة من المخدرات والبروتينات المفردة أو المتعددة. وتتماشى تسلسلات الببتيد المختارة من الأدوية على التوالي مع تسلسلات الأحماض الأمينية الأولية للبروتينات المفردة والمضاعفات، ويتم تسجيل التشابه في كل مجموعة من الأحماض الأمينية 3-5 بشكل تراكمي عبر المحاذاة الزوجية وفقاً لمصفوفة BLOSUM62 المعدلة. وتشير المؤامرة أو الرسم البياني الناتجة عن ذلك إلى المخلفات أو الأجزاء التي تشكل موقعاً محتملاً لربط المخدرات بالبروتين. مزيد من التحليل باستخدام برنامج RELIC المناسبة يسلط الضوء على موقع ملزم على هيكل ثلاثي الأبعاد (إذا كان ملف PDB هو متاح) أو صفوف البروتينات الكاملة التي ربما تكون الهدف ملزمة (HETEROalign البرنامج غير متوفر حاليا). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> الشكل 3: النتائج التمثيلية لجمع الببتيد وتحليل المعلوماتية الحيوية اللاحقة. (أ) Irinotecan (المضادة للورم prodrug ، topoisomerase I المانع). تم رصد التفاعل T7 phage لمدة 10 دقيقة كتخفيض في تردد QCM. تم استرداد الحمض النووي للphage T7 ملزمة وتسلسل لتحديد تسلسل الأحماض الأمينية المقابلة. وأبرزت سلاسل الأحماض الأمينية من 29 15-mer الببتيدات، التي تم جمعها باستخدام مجموعة فرعية من دورة واحدة biopanning، الأحماض الأمينية التي تشكل موقع Iri-binding of AChE [PDB ID 1U65]. مزيد من التقييم باستخدام نفس الببتيدات 29 أبرز البقايا المجاورة من الأحماض الأمينية (بقايا سقالة لاجتثاث القوستر) من الثالوث الحفاز في CE، وهو إنزيم الكبد الذي يحول Iri إلى SN-38 (شكل نشط) [معرف PDB: 1K4Y]. وقد طرحت عشرات التشابه من 103 الببتيدات مختارة عشوائيا من مكتبة الأم unscreened7,19 من هذه الدرجات لإزالة التحيز مكتبة. وقد استُنسِخت هذه الأرقام من المرجع 20، بإذن من إلسفير. (ب) أوسيلتاميفير (دواء مضاد للإنفلونزا). الببتيدات الـ27 التي تحتوي على الأحماض الأمينية التي تعترف Osel أبرزت أجزاء غير مضطربة من موقع أوسل الملزم لـ Neuraminidase (NA) (إنزيم الفيروس) [معرف PDB: 2HT7]. التحقق العالمي من التشابه بين تسلسل 27 الببتيدات و 4396 البروتينات في DrugBank 1.018 كشفت NA لتكون ضمن أعلى 5٪ نطاق, بالإضافة إلى البروتينات البشرية المضيفة المرتبطة وظائف الجهاز العصبي المركزي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> الشكل 4: ملخص الجزيئات الصغيرة، التي تم تحديد أهدافها الملزمة باستخدام هذه الاستراتيجية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

هدفت هذه الدراسة إلى تقديم استراتيجية لتحديد التفاعلات الببتيد المخدرات. وتنطوي الاستراتيجية على التحريك الأحيائي للببتيدات القصيرة التي تعترف بالمخدرات استنادا إلى جهاز استشعار دقيق للكوارتز والكريستال ، يليها تحليل المعلوماتية الحيوية لإجراء تقييم كمي للمعلومات التي تم الحصول عليها للتعرف على المخدرات وشرح مواقع ربط المخدرات بالبروتينات.

Biopanning المعالجة البيولوجية القائمة على الاستشعار الحيوي واستراتيجية تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق العالمي من التفاعلات البروتين المخدرات

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

استخدام إنتاجية عالية<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

عالية السرعة غيغاهرتز الفرعي مطياف لتحليل Brillouin نثر

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...