Name: biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions
Uploaded: 2020-12-01T14:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

Forfatteren takker Drs. Yujiro Hayashi og Hayato Ishikawa for at give oseltamivir, og Dr. Lee Makowski for at give stand-alone RELIC programmer. Forfatteren anerkender også Tetsuya Kawagoe for teknisk bistand fra QCM eksperimentet. Dette arbejde blev delvist støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
ERKLÆRING OM DATATILGÆNGELIGHED
De enkeltstående RELIC-programmer og sekvensdataene for affinitetsvalgte peptider for lægemidler samt proteinsekvenserne fra proteomdatabasen, der bruges i dette papir, er tilgængelige fra denne forfatter efter anmodning (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

BEMÆRK: Følgende er trinene til screening af lægemiddelgenkendelse af T7-phages ved hjælp af en QCM-biosensor og genvinding af de screenede phages via E. coli (BLT5615) infektion. Protokollerne for syntesen af et derivat af et lille molekyle, der danner en selvsamlet monolayer (SAM) og til opførelsen af T7 phage-displayet 15-mer tilfældig peptid bibliotek kan findes andre steder6,7.
1. Forberedelse af QCM sensor chip
<ol><li>Fastgør en keramisk sensorchip på oscillatoren på et 27-MHz QCM-apparat, og registrer den iboende frekvens (Hz) i luftfasen før små molekyle immobilisering.</li>
	<li>Del chippen af og slip 20 μL af en opløsning (1 mM i 70% ethanol) af et lille molekylederivat, der danner SAM på sensorchippens guldelektrode ved hjælp af en pipette. ADVARSEL: Sensorchipkrystallen, hvor guldelektroden (Au, 0,1 mm tyk, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2) er placeret, er ekstremt tynd og let kan knække (SiO2, 0,06 mm tyk, 9 mm i.d.). Derfor pipette omhyggeligt.</li>
	<li>Lad det stå i 1 time ved stuetemperatur (ca. 20 °C) i en petriskål med fugtet væv og afskærmet fra rumlys.</li>
	<li>Vask elektrodeoverfladen forsigtigt med ultrapure vand; Fjern derefter vanddråberne ved at blæse luft med en sprøjte eller luftduster.</li>
	<li>Opsæt sensorchippen til QCM-apparatet, og registrer reduktionen i frekvensen i luftfasen for at måle mængden af det lille molekyle, der er blevet immobiliseret. BEMÆRK: Mindst 100 Hz iboende frekvens er nødvendig for en vellykket lille molekyle immobilisering (1 Hz immobiliserer 30 pg).</li>
</ol>2. Biopanning af T7 phage biblioteket ved hjælp af en QCM biosensor (Figur 1)
<ol><li>Sæt en cuvette med en dedikeret magnetisk omrører på QCM biosensor og hæld 8 mL af reaktionsbufferen (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) i cuvette.</li>
	<li>Fastgør QCM-sensorchippen til oscillatoren, og træk oscillatorens arm ned for at nedsænke chippen i den buffer, der omrøres ved 1000 omdrejninger i minuttet.</li>
	<li>Begynd at overvåge QCM-frekvensen på pc'en, og vent, indtil sensorgrammet ekvilibrerer til omkring 3 Hz/min af frekvensdriften.</li>
	<li>Der indsprøjtes 8 μL af et T7-phagebibliotek (1-2 ×10 10 pfu/mL) i cuvettet (endelig koncentration: 1-2 × 107 pfu/mL) og indsprøjtningspunktet markeres på sensoren.</li>
	<li>Overvåg frekvensreduktion forårsaget af bindingen af T7-phages til det lille molekyle immobiliseret på guldelektrodeoverfladen i 10 minutter.</li>
	<li>Stop QCM-frekvensmonitoren, fjern sensorchippen fra oscillatoren, og fjern bufferen ved at blæse luft og/eller fugttransportere væk med klude.</li>
	<li>Sensorchippen hældes i en fugtig petriskål, og 20 μL af suspensionen af E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 efter at have rystet ved 37 °C ved at tilsætte IPTG til 1 mM) værtsceller i logfasen på guldelektroden.</li>
	<li>Luk låget på skålen og dæk den med aluminiumsfolie for at blokere lyset.</li>
	<li>Skålen inkuberes ved 37 °C i 30 minutter på en 96-brønds mikropladeblander (1000-1500 omdrejninger i minuttet) for at forbedre genvindingen af de bundne T7-phages.</li>
	<li>Opløsningens 20 μL genvindes, og den suspenderes til 200 μL LB-medium. BEMÆRK: Prøverne i dette trin kan opbevares ved 4 °C med en uge.</li>
	<li>Der fremstilles en fortyndingsserie af phageopløsningen til plakisolation og DNA-sekventering efter den generelle procedure, der er beskrevet i fabrikantens anvisninger8,9.</li>
	<li>Tør guldelektrodeoverfladen af med en vatpind gennemblødt med 1% natrium dodecyl sulfatopløsning.</li>
	<li>Vask guldoverfladen med ultrapure vand fra vaskeflasken og fjern derefter vanddråber ved at blæse luft med en sprøjte eller luft duster.</li>
	<li>5 μL piranhaopløsning (Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) på guldoverfladen og lad den stå i 5 min.</li>
	<li>Vask guldoverfladen igen med vand og tør derefter ved at blæse luft og/eller fugtsprede væk med klude.</li>
	<li>Gentag trin 2.14 og 2.15. ADVARSEL: Forbered piranhaopløsningen umiddelbart før brug. Brug denne væske omhyggeligt, da det er en meget stærk syre. Behandling i mere end 5 minutter udhuler sensorchippen.</li>
</ol>3. Bioinformatik analyse ved hjælp af Receptor Ligand Contact (RELIC) program suite (Figur 2)10,11
<ol><li>Unzip det separate RELIC-program på en pc med et MS Windows-operativsystem.</li>
	<li>Juster aminosyresekvenserne i de 15-mer peptider, der er valgt ved hjælp af stoffet, eller vælg tilfældigt fra det uscreenede overordnede bibliotek i hver tekstformatfil (navn.txt).</li>
	<li>Skriv aminosyresekvensen af enkelte eller flere proteiner i hver tekstfil med FASTA-format, eller hent databasetekstfilerne i FASTA-format fra en hvilken som helst proteindatabase (f.eks. UniProt (http://www.uniprot.org/) eller DrugBank (https://www.drugbank.ca/).</li>
	<li>Placer tekstfilerne (og FBF-filerne til HETEROalign) i den mappe, der er nødvendig for at køre hvert RELIC-program.</li>
	<li>Klik på den eksekverbare fil (program.exe) for AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon og FASTAskan i den uafhængige mappe for at åbne den personlige version af FTN95.</li>
	<li>Skriv det relevante filnavn sammen med filtypenavnet (navn.txt) i kommandomeddelelsen for at køre hvert program og hente den nødvendige tekstformatfil.</li>
	<li>Eksporter den resulterende tekstfil til en regnearkssoftware (f.eks. Excel) for at generere et plot med informationsindhold (INFO) eller kumulative lighedsscores beregnet ved hjælp af en BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign). BEMÆRK: Den oprindelige RELIC-server (http://relic.bio.anl.gov) er ikke længere tilgængelig, og nogle enkeltstående type RELIC-programmer, der fungerer på pc'er med en Windows-platform, kan fås hos den tilsvarende forfatter (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display.">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics:+an+update.">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics.">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule.">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase,+DWARF4,+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display.">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+Select&#174;+System+Manual.">T7 Select&#174; System Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrientExpressTM+cDNA+Manual.">OrientExpressTM cDNA Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+(CPT-11).">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li><li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases.">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li><li>Kim, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+inhibitors+possessing+a+novel+hydrophobic+interaction+in+the+enzyme+active+site:+design,+synthesis,+and+structural+analysis+of+carbocyclic+sialic+acid+analogues+with+potent+anti-influenza+activity.">Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).</li><li>Hoffmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+pharmacokinetics+of+oseltamivir+and+oseltamivir+carboxylate+in+the+central+nervous+system.">Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DrugBank+5.0:+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018.">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li><li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin.">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool.">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li><li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+(SAM)+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+(QCM)+device.">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li><li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein.">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+(CPT-10-B)+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device.">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li><li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Her er der fremlagt en strategi for QCM biosensorbaseret biopanning af lægemiddelincitificerende peptider efterfulgt af bioinformatikanalyse til validering af lægemiddelproteininteraktioner ved hjælp af de identificerede peptider. Design af de små molekylederivater til immobilisering på biosensorens guldelektrode er et vigtigt skridt, da den introducerede linker kan hindre bindingen og samlingen af peptid, der genkender stoffet. For at undgå dette udarbejdes derivater med forskellige positioner af den indførte linker23. Alternativt, for immobilisering hydrofobe små molekyler, sensoren chip er nedsænket i bulk vand i en 10 cm Petri parabol, og en 20 μL opløsning af det lille molekyle (10 mM opløsning i dimethyl sulfoxid) er faldet på guld elektrode af biosensor, til at dække sin overflade, og inkuberes i 5 min. Dette gør det muligt at fastholde en sub-hundrede hertz iboende frekvens af små molekyler, som holdes i mindst 10 minutter under biopanning. Ved hjælp af en sådan immobilisering fremhævede osel-affinitetsvalgte peptider klart det Osel-bindende sted i NA (figur 3).
Den T7 phage bruges til at forberede peptid biblioteket her er genetisk manipuleret ved hjælp af NNK15 kassette, der koder 32 codons for alle 20 af standard aminosyrer og undertrykker fremkomsten af 2 stop codons (UAA, UGA) og viser kun UAG (Figur 1)6,7. Dette er vigtigt for at vise 15-mer peptider i fuld længde og øge bibliotekets mangfoldighed. T7 phage display system har en teknisk display grænse på 107-109 T7 phages. Mangfoldigheden i det 15-mer peptidbibliotek er imidlertid teoretisk set 2015 (3,27 × 1019); Den kan derfor ikke bruges til komplet bibliotekskonstruktion. Ikke desto mindre gør lighedssøgning eller minedrift af bevarede motiver det muligt at detektere aminosyrerne, der omfatter proteiners stofbindende steder, selv med denne begrænsede mangfoldighed af peptider i biblioteket. Derudover strækker 3-5 aminosyrer sig inden for bibliotekets peptid (udseendehastigheden er mellem 1/203 og 1/ 205, som kan realiseres ved hjælp af T7 phage display system) er involveret i anerkendelsen af små molekylelægemidler; derfor er en 100% match af peptidsekvenserne med 15-mer aminosyresekvenser, der udgør målproteinets stofbindingssted, ikke påkrævet. Faktisk fremhævede ca. 30 affinitetsvalgte peptider med succes målproteinets bindende sted for hvert testet lægemiddel (figur 4). Således kan mangfoldigheden af det anvendte forældre-T7-phagebibliotek (1,7 ×10 7 pfu/mL) bruges til heuristisk at rekonstruere det narkotikabindende sted.
Typisk opstod 3-5 kopier af T7-phages, der viste de samme sekvenser som dem i de 15-mer aminosyresekvenser, der huser stofinficerende aminosyrestrækninger, inden for de 16 plaques vilkårligt isoleret, hvilket indikerer succesen med affinitetsvalget under vores protokol. Dette indikerer, at der indsamles 18-30 forskellige stofintificerende peptidsekvenser inden for de 96 isolerede plaques (tallet er forbundet med mikropladeformatet), som identificeres efterfølgende ved hjælp af sekventering af DNA'et og opnåelse af den tilsvarende aminosyresekvens. I den nuværende strategi er injektion af 8 μL af T7 phage biblioteket i cuvette indeholdende 8 mL buffer (1000 gange fortynding af biblioteket) egnet til at reducere den ikke-specifikke binding af T7 phages. For at øge mangfoldigheden af de affinitetsvalgte peptider viste det sig at være mere effektivt end isolation fra en enkelt opløsning ad gangen at gentage valg af en cyklus flere gange og bruge 16 eller 32 plakisolationer pr. screening. For eksempel, for effektivt at indsamle ca. 30 forskelligt sekventerede affinitetsvalgte peptider, blev der udført 3-6 sæt valg af en cyklus, 16 eller 32 plaques blev isoleret i hvert eksperiment. Udseende af identiske sekvenser i alle 16 eller 32 T7 phage plaques er angivet utilsigtet påvisning af baggrund eller kan kontaminere som en overførsel. I modsætning hertil indikerer fraværet af T7-phages med samme rækkefølge eller udseende af mange T7-phages med kortere peptider end 15-mer-længden, at T7-phages i populationen ikke-specifikt opstod med høj sandsynlighed. Da QCM-frekvensreduktion sker i samme omfang, selv i sådanne tilfælde, bør udvælgelsens succes vurderes grundigt ved at sekventere DNA'et for den isolerede T7-phage efterfulgt af bioinformatikanalyse af peptiders aminosyresekvenser. I modsætning til den konventionelle T7 phage displayprotokol er gentagne udvælgelsesrunder mindre effektive, da variationen og antallet af T7-phages er lille og ikke er koncentreret, selv efter at du har gentaget forstærknings- ogudvælgelsestrinnene 23.
Det er vigtigt, at denne metode gælder for udvinding af små molekylebindingssteder i proteomer hos mennesker, patogene vira og endda planter. Interessant nok kan den muligvis ustrukturerede korte displaylængde af peptider på T7 phage capsid efterligne den molekylære dynamik af peptider af proteiner under docking med et lille molekyle; Dette kan afspejle dynamisk binding24. Ud over de tekniske begrænsninger af konventionelle metoder, denne strategi, der gælder for identiske protokoller for små molekyler, kan udvide druggable proteom samt give mere granularitet med hensyn til narkotika-protein interaktion analyse.
Visse tekniske begrænsninger af denne fremgangsmåde bør overvejes. Organisk syntese er nødvendig for små molekyle immobilisering på guld elektrode overfladen af biosensor chip. For ikke-eksperter i organisk kemi er nogle immobiliseringsreagenser kommercielt tilgængelige for mekanisk at fikse det lille molekyle ved kobling. Desuden kan visse nonsens dele af peptider resultere i påvisning af en del af proteinet ikke er relevante for narkotika docking som falske positiver. Dette svarer empirisk til beta-ark eller leucin-rige domæner rig på leucin eller valine rester, som er kodet af flere codons end andre standard aminosyrer, når kopier af T7 phage produceres. Styring af bibliotekets peptidlængde kan styre forekomsten af falske positiver. I modsætning hertil kan der være tilfælde, hvor aminosyrerester på det stofbindende sted, der er involveret i docking, som påvist ved hjælp af røntgenkrystallografi eller NMR-analyse, ikke opdages. Dette kan løses ved at indsamle et større antal af de stof-genkendelse peptider eller ændre retningen af fastsættelse af de små molekyler på guld elektroden.
Mange interaktioner mellem stoffer og proteiner, der er relateret til de vigtigste og sekundære virkninger af stofbrug, kan endnu ikke identificeres i proteomet; Desuden kan enzymer og transportører, der er ansvarlige for absorption af lægemidler, distribution, metabolisme, udskillelse og toksicitet, også stadig være uidentificerede. Proteinbinding er ikke altid ansvarlig for et lægemiddels bioaktivitet. Således vil en kombination af andre oplysninger fra biologiske assays forbedre identifikationen af væsentlige narkotika mål ansvarlig for de vigtigste og negative virkninger af narkotika. Yderligere tilpasninger af denne koncise teknik vil øge det praktiske og gennemløb for minedrift af proteinbindende steder af en bred vifte af små molekylelægemidler. Den metode, der præsenteres heri, vil i vid udstrækning bidrage til ikke blot at udføre grundforskning på de relaterede områder, men også afklare de molekylære mekanismer, der ligger til grund for terapeutisk effekt eller andre biologiske virkninger af lægemidler til klinisk brug.

Identifikation af narkotikabindende mål er afgørende for udviklingen af lægemidler og for forståelsen af sygdommes molekylære mekanismer. Især receptor- og enzymproteiner er de vigtigste molekylære mål for bioaktive små molekyler1. Selvom affinitetsfangst er en veletableret teknik til identifikation af de narkotikabindende proteiner2, hæmmer tekniske begrænsninger, såsom proteiners lave opløselighed, ofte valideringen af lægemiddelmål2. Vigtigst af alt mister de immobiliserede små molekyler den grad af frihed, der er nødvendig for docking og kan være utilgængelig for de internt placerede bindingssteder på større målproteiner. Desuden hæmmer proteinfejl, manglende evne til at analysere co-krystalliseringsbetingelser og begrænsninger på grund af molekylær størrelse ofte brugen af røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og andre sådanne eksperimentelle analyser til undersøgelse af lægemiddelproteininteraktioner.
Brugen af T7 phage display biopanning er en effektiv måde at bestemme bindingsstedet på proteiner til små molekyle lokkemad3. Især en T7 phage-displayet tilfældig peptid bibliotek, som kan konstrueres ved at indsætte syntetisk DNA i en multi-kloning site, er effektiv. Sammenlignet med T7 phage biblioteket viser proteiner, de korte peptider kan let manipuleres til at blive vist på T7 phage capsid uden fysiske begrænsninger, som kan sterisk kontakt med enhver lille molekyle stof fastgjort på en solid støtte2. Desuden giver indførelsen af en kvarts-krystal mikrobalance (QCM) biosensor i T7 phage display biopanning platform identifikation af sådanne svage, men specifikke interaktioner af korte peptider med lægemidler ved at overvåge reduktionen i QCM frekvens4,5. Den bundne T7-phage genvindes derefter direkte ved at inficere værten Escherichia coli (BLT5615), og DNA-sekvensen i den region, der koder den affinitetsvalgte peptid, der huser stofgenkendelse af korte segmenter, bestemmes. Efterfølgende analyse af aminosyresekvensen af peptidpopulationen giver oplysninger om lægemiddelgenkendelse. I silico pairwise tilpasning af de reddede aminosyre sekvenser kan bruges til at indhente oplysninger om det biologiske mål for lægemidlet inden for en udvalgt proteom. Denne høje gennemstrømning identifikation af protein fragmenter med affinitet over for et lægemiddel kan bruges til heuristisk rekonstruere narkotika-bindende site på en måde, der svarer til at rekonstruere en gammel artefakt fra keramik skår6. Især kan denne unikke tilgang være nyttig, når konventionelle proteomics tilgange mislykkes.
Her præsenterer vi en biosensorbaseret strategi for biopanning af T7 phage-displayede peptider og bioinformatikanalyse til målvalidering af de små molekyler. Ud over tekniske begrænsninger for konventionelle metoder gør denne strategi det muligt at identificere narkotikabindende steder på målproteiner for ethvert lille molekyle af interesse under den identiske protokol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

Receptorer og enzymproteiner er vigtige biomolekyler, der fungerer som bindende mål for bioaktive små molekyler. Den hurtige og globale validering af interaktioner mellem lægemidler og proteiner er således meget ønskelig, fordi man ikke blot forstår de molekylære mekanismer, der ligger til grund for den terapeutiske virkning, men også for at vurdere lægemiddelegenskaber, såsom adsorption, distribution, metabolisme, udskillelse og toksicitet (ADMET) til klinisk brug. Her præsenterer vi en biosensorbaseret høj gennemløbsstrategi for biopanning af T7 phage-displayede korte peptider, der let kan vises på phage capsid. Efterfølgende analyse af aminosyresekvenserne af peptider, der indeholder korte segmenter, som "brudte relikvier", af de stofbindende steder ved hjælp af bioinformatikprogrammer i receptor ligand kontakt (RELIC) suite, er også vist. Ved at anvende denne metode til to klinisk godkendte lægemidler, en anti-tumor irinotecan, og en anti-influenza oseltamivir, den detaljerede proces for indsamling af narkotika-anerkendende peptid sekvenser og fremhæve narkotika-bindende steder af målet proteiner er forklaret i dette papir. Den strategi, der er beskrevet heri, kan anvendes til alle små molekyler af interesse.

De repræsentative resultater for to klinisk godkendte lægemidler er vist i figur 3. Irinotecan (Figur 3A), en vandopløselig produktion af naturlige camptothecin anvendes til behandling af fremskreden kolorektal cancer og ikke-småcellet lungekræft, omdannes til SN-38 i leveren, som hæmmer topoisomerase I i kræftceller12. Desuden hæmmer denne forbindelse direkte acetylkolinsterase (AChE)13,14. Gennem strategien blev 29 peptider, der anerkendte Iri immobiliseret som en SAM, identificeret af QCM biosensorbaserede en-cyklus biopanning delmængder. Efterfølgende parvis justering af de 29 peptider og AChE gav maksimal score for Y121, Q225, F290, E327, H440 og Y442 og fremhævede delen i den tredimensionelle struktur. Disse aminosyrerester var i overensstemmelse med dem, der udgør det Iri-bindende sted for AChE. Den samme delmængde af peptider identificerede med succes E99, L100, L252, L305, I387 og V474 i nærheden af den katalytiske triade (S221, E353 og H467) i carboxylesterase (CE), hvilket indikerer, at disse aminosyrer danner et stillads til Iri-anerkendelse under deesterificering af Iri15. Sådanne aminosyrerester på det katalytiske sted kan ikke identificeres direkte ved hjælp af konventionel røntgenkrystallografi eller NMR-analyse, da enzymreaktionen skrider glat frem og ikke danner det statiske kompleks stabilt under generelle forsøgsbetingelser. Således, at kombinatorisk påvisning af narkotika-bindende steder af flere proteiner, herunder dem i de mellemliggende komplekser muligvis dannet med enzymer under metaboliske reaktioner for et bestemt lægemiddel, er muligt ved hjælp af affinitet-valgte peptider bestemt for et lægemiddel.
Figur 3B viser de øvrige resultater, der er opnået for oseltamivir (Osel), et antiinfluenzamedicin, der aktiveres for oseltamivir carboxylat, hvilket igen hæmmer neuraminidase (NA) af influenzavirus16. De 27 peptider, der genkendte Osel, der dækkede QCM sensor chip guldelektrodeoverfladen, opdagede med succes Osel-bindingsstedet i NA16. Dette indbindingssted består af ustrukturerede peptidsløjfer, der potentielt gennemgår dynamisk bevægelse under docking med Osel. Den Osel-genkendelse peptider på T7 phage capsid kan efterligne denne dynamiske docking, når bindende til Osel fast på guld elektrode overfladen af QCM sensor chip. Neuropsykiatriske bivirkninger (NPAEs) er blevet identificeret hos unge patienter med influenza, som påvirker patienterne er muligvis relateret til selve sygdommen snarere end stoffet. Undersøgelser har vist, at Osel aktivt eksporteres fra centralnervesystemet (CNS) af gnavere via multidrugresistens (MDR) protein i blod-hjerne barrieren (BBB)17. Faktisk viste et af proteinerne i klassen af denne MDR en høj score (top 5% ud af 4.396 i DrugBank 1.0 proteindatabase18) ud over andre transportører, neurotransmitterrelaterede enzymer og receptorer i vores undersøgelse. Den farmakologiske betydning af disse proteiner med hensyn til udseendet af bivirkninger af Osel er ved at blive undersøgt.
Indtil videre er enkelte og flere små molekylebindende steder på målproteinerne med succes blevet identificeret for seks små molekylelægemidler, der har brugt vores strategi (Figur 4). For Brz2001 og roxithromycin (RXM) blev identiske stofbindingssteder på et målprotein identificeret ved hjælp af forskellige puljer af peptider, tal og aminosyresekvenser, for hvilke varierede helt7,19. Desuden førte enkelt peptidpuljer, der blev opnået for Iri, RXM og Osel, til identifikation af flere bindingssteder for forskellige proteiner for hvert lægemiddel, såsom AChE og CE for Iri (Figur 3A)20, angiomotin og CYP3A4 for RXM19,21og NA- og MDR-associeret protein til Osel. Et ukendt molekylært mål blev identificeret for anti-tumor sammensatte doxorubicin (FANCF)22, og anti-angiogen makrolide antibiotika RXM (angiomotin)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af QCM biosensorbaseret biopanning af T7 phage-displayet peptidbibliotek. En T7 phage bibliotek, der viser tilfældige peptider injiceres i cuvette indeholder buffer (under omrøring), hvor QCM biosensor chip er nedsænket, og frekvensen er stabiliseret. Efter overvågning af frekvensreduktionen på grund af bindingen af T7-phages til små molekyler, der er immobiliseret på sensorchippens guldelektrodeoverflade, løsnes sensorchippen fra oscillatoren. DNA fra den bundne T7 phage er derefter direkte genvundet efter vært E. coli (BLT5615) infektion. De resulterende T7 phages isoleres via plakdannelse, og endelig bestemmes aminosyresekvensen af lægemidlet affinitetsvalgt peptid, der vises på T7 phage capsid, i henhold til den generelle phage displaymetode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> Figur 2: Skematisk gengivelse af den kvantitative vurdering af sekvenssammenligningen mellem lægemiddelvalgte peptider og enkelte eller flere proteiner. Lægemiddelvalgte peptidsekvenser er henholdsvis justeret med de primære aminosyresekvenser af enkelte og flere proteiner, og ligheden i hvert 3-5 aminosyresæt scores kumulativt via parvis justering i henhold til en modificeret BLOSUM62-matrix. Det resulterende plot eller diagram angiver de rester eller dele, der udgør et potentielt stofbindingssted på proteinet. Yderligere analyse ved hjælp af et passende RELIC-program fremhæver bindingsstedet på den tredimensionelle struktur (hvis PDB-fil er tilgængelig) eller rangerer hele proteiner, der muligvis er bindingsmålet (HETEROalign-programmet er i øjeblikket ikke tilgængeligt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> Figur 3: Repræsentative resultater af peptidindsamling og efterfølgende bioinformatikanalyse. (A) Irinotecan (anti-tumor prodrug, topoisomerase I-hæmmer). T7 phage interaktion blev overvåget i 10 min som en reduktion i QCM frekvens. DNA af den bundne T7 phage blev genvundet og sekventeret for at bestemme den tilsvarende aminosyre sekvens. Aminosyresekvenserne på 29 15-mer peptider, indsamlet ved hjælp af en delmængde af en-cyklus biopanning, fremhævede de aminosyrer, der udgør det Iri-bindende sted for AChE [PDB ID 1U65]. Yderligere vurdering ved hjælp af de samme 29 peptider fremhævede de nærliggende aminosyrerester (stilladsrester til afesterificering) af den katalytiske triade i CE, et leverenzym, der omdanner Iri til SN-38 (aktiv form) [PDB ID: 1K4Y]. Lighed score på 103 tilfældigt udvalgte peptider fra den uscreenede overordnede bibliotek7,19 er blevet trukket fra disse scores for at fjerne biblioteket bias. Disse tal er gengivet fra ref. 20 med tilladelse fra Elsevier. (B) Oseltamivir (antiinfluenzamedicin). De 27 peptider, der indeholder Osel-genkendelige aminosyrer, fremhævede uordnede dele af det Osel-bindende sted for neuraminidase (NA) (virusenzym) [PDB ID: 2HT7]. Global validering af sekvens lighed mellem 27 peptider og 4.396 proteiner i DrugBank 1,018 viste NA at være inden for top 5% rækkevidde, ud over værten menneskelige proteiner forbundet med funktionerne i centralnervesystemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> Figur 4:Resumé af desmå molekyler, hvis bindende mål blev identificeret ved hjælp af denne strategi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Denne undersøgelse havde til formål at præsentere en strategi for at identificere stof-peptid interaktioner. Strategien omfatter biopanning af lægemiddelanerkendende korte peptider baseret på en kvarts-krystal mikrobalance (QCM) biosensor, efterfulgt af bioinformatikanalyse til kvantitativ vurdering af de oplysninger, der er opnået til lægemiddelgenkendelse og anmærkning af de narkotikabindende steder på proteiner.

Biosensorbaseret analysestrategi for høj gennemstrømning af biopanning og bioinformatik til global validering af interaktioner mellem lægemidler og proteiner

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelativ mikroskopi til 3D Strukturel analyse af dynamiske vekselvirkning

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bestemmelse af transport Rate af Xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjælp af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelige placentaperfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

High Speed ​​Sub-GHz spektrometer til Brillouin spredning Analyse

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput bestemmelse af bakterier Repellent Polymerer til medicinsk udstyr

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...