Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud til K. Walsh (HL131006, HL138014, og HL132564), til S. Sano (HL152174), American Heart Association tilskud til M. A. Evans (20POST35210098), og en Japan Heart Foundation tilskud til H. Ogawa.

Alle forsøg med forsøgspersoner er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia.
1. Forud for forkonditionering
<ol><li>Sæt recipientmusene på antibiotisk suppleret vand (5 mM sulfamethoxazol, 0,86 mM trimethoprim) ~24 timer før bestråling. Dette er nødvendigt for at forhindre infektion, da immunsystemet vil blive undertrykt efter bestråling og opretholdt i 2 uger efter bestråling. På dette tidspunkt supplere mus med en ernæring...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Til undersøgelser af blodlegemer beskrev vi tre metoder til BMT: BMT med total kropsbestråling, BMT med bestråling med delvis afskærmning og en mindre almindeligt anvendt BMT-metode, der ikke involverer prækonditionering (adoptiv BMT). Disse metoder er blevet brugt til at vurdere virkningen af klonisk hæmatopoies på hjerte-kar-sygdomme. Forskere kan ændre disse metoder i overensstemmelse hermed, så de passer til det specifikke formål med deres undersøgelse.
Clonal hæmatopoi...

Clonal hematopoiesis (CH) er en tilstand, der ofte observeres hos ældre personer og opstår som følge af en udvidet hæmatopoietisk stamcelle- og stamcelleklon (HSPC), der bærer en genetisk mutation1. Det er blevet foreslået, at i en alder af 50, de fleste individer vil have erhvervet et gennemsnit på fem exonic mutationer i hver HSPC2, men de fleste af disse mutationer vil resultere i ringe eller ingen fænotypiske konsekvenser for den enkelte. Men hvis en af disse mutationer ved en tilfældighed giver HSPC en konkurrencemæssig fordel – f.eks. ved at fremme dens spredning, selvfornyelse, overlevelse eller en kombination af disse – kan dette føre til præferenceudvidelsen af den mutante klon i forhold til de andre HSC'er. Som følge heraf vil mutationen i stigende grad sprede sig gennem det hæmatopoietiske system, da det muterede HSPC giver anledning til modne blodlegemer, hvilket fører til en tydelig population af muterede celler i det perifere blod. Mens mutationer i snesevis af forskellige kandidat driver gener har været forbundet med kloniske begivenheder inden for hæmatopoietiske system, blandt disse, mutationer i DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) og ti elleve translokation 2 (TET2) er de mest udbredte3. Flere epidemiologiske undersøgelser har vist, at personer, der bærer disse genetiske mutationer, har en betydeligt højere risiko for hjerte-kar-sygdom (CVD), slagtilfælde og all-kausaldødelighed 3,4,5,6,7. Mens disse undersøgelser har identificeret, at der er en sammenhæng mellem CH og øget forekomst af CVD og slagtilfælde, ved vi ikke, om dette forhold er årsagssammenhæng eller en fælles epiphenomenon med aldringsprocessen. For at få en bedre forståelse af denne forening kræves der korrekte dyremodeller, der korrekt opsummerer CH's menneskelige tilstand.
Flere CH dyremodeller er blevet etableret af vores gruppe og andre ved hjælp af zebrafisk, mus og ikke-menneskelige primater8,9,10,11,12,13,14. Disse modeller anvender ofte hæmatopoietiske rekonstitutionsmetoder ved transplantation af genetisk modificerede celler, nogle gange ved hjælp af Cre-lox rekombination eller CRISPR-systemet. Denne tilgang giver mulighed for analyse af en specifik genmutation i hæmatopoietiske celler for at vurdere, hvordan det bidrager til sygdomsudvikling. Derudover anvender disse modeller ofte congeniske eller reporterceller til at skelne virkningerne af mutantceller fra normale eller vilde celler. I mange tilfælde er en pre-conditioning regime er forpligtet til at kunne engraft donor hæmatopoietiske stamceller.
I øjeblikket kan transplantationen af knoglemarv til recipientmus opdeles i to hovedkategorier: 1) myeloablativ konditionering og 2) ikke-betinget transplantation. Myeloablativ konditionering kan opnås ved en af to metoder, nemlig total kropsbestråling (TBI) eller kemoterapi15. TBI udføres ved at udsætte modtageren for en dødelig dosis gamma- eller røntgenbestråling, generere DNA-brud eller krydsforbindelser i hurtigt dividere celler, hvilket gør dem uoprettelige16. Busulfan og cyclophosphamide er to almindeligt anvendte kemoterapi lægemidler, der forstyrrer den hæmatopoietiske niche og ligeledes forårsage DNA-skader på hurtigt at opdele celler. Nettoresultatet af myeloablativ forudsætning er apoptose af hæmatopoietiske celler, som ødelægger modtagerens hæmatopoietiske system. Denne strategi giver ikke kun mulighed for en vellykket engraftment af donor HSC'er, men kan også forhindre graft afvisning ved at undertrykke modtagerens immunsystem. Men myeloablative forudsætninger har alvorlige bivirkninger såsom skader på væv og organer og deres hjemmehørende immunceller samt ødelæggelse af den indfødte knoglemarvsnicher17. Der er derfor foreslået alternative metoder til at overvinde disse uønskede bivirkninger, navnlig med hensyn til skader på organer af interesse. Disse metoder omfatter afskærmet bestråling af recipientmus og adoptiv-BMT til ikke-betingede mus9,17. Afskærmning af brystkassen, bughulen, hovedet eller andre regioner mod bestråling ved placering af blybarrierer beskytter væv af interesse mod de skadelige virkninger af bestråling og opretholder deres bosiddende immuncellepopulation. På den anden side har den adoptiv BMT af HSC'er til ikke-betingede mus en yderligere fordel, fordi den bevarer den indfødte hæmatopoietiske niche. I dette manuskript beskriver vi protokollerne og resultaterne af HSPC-engraftment efter flere transplantationsregimer hos mus, specifikt levering af HSPC til TBI-mus, til mus, der delvist er afskærmet mod bestråling, og til ikke-betingede mus. Det overordnede mål er at hjælpe forskerne med at forstå de forskellige fysiologiske virkninger af hver metode samt hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i fastsættelsen af CH og hjerte-kar-sygdomme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

Clonal hæmatopoiesis er en udbredt aldersrelateret tilstand, der skyldes akkumulering af somatiske mutationer i hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC'er). Mutationer i førergener, der giver cellulær fitness, kan føre til udvikling af ekspanderende HSPC-kloner, der i stigende grad giver anledning til afkom leukocytter, der huser den somatiske mutation. Fordi klonisk hæmatopoiesis har været forbundet med hjertesygdomme, slagtilfælde og dødelighed, er udviklingen af eksperimentelle systemer, der modellerer disse processer, nøglen til at forstå de mekanismer, der underly denne nye risikofaktor. Knoglemarvstransplantationsprocedurer, der involverer myeloablativ konditionering hos mus, såsom bestråling af hele kroppen (TBI), anvendes ofte til at studere immuncellernes rolle i hjerte-kar-sygdomme. Men samtidig skade på knoglemarvsnicher og andre steder af interesse, såsom hjerte og hjerne, er uundgåelig med disse procedurer. Således har vores laboratorium udviklet to alternative metoder til at minimere eller undgå mulige bivirkninger forårsaget af TBI: 1) knoglemarvstransplantation med bestrålingsafskærmning og 2) adoptiv BMT til ikke-konditionerede mus. I afskærmede organer bevares det lokale miljø, hvilket giver mulighed for analyse af klonisk hæmatopoiesis, mens funktionen af bosiddende immunceller er uforstyrret. I modsætning hertil har den adoptiv BMT til ikke-betingede mus den yderligere fordel, at både de lokale miljøer af organerne og den hæmatopoietiske niche bevares. Her sammenligner vi tre forskellige hæmatopoietiske cellerekonstruktionsmetoder og diskuterer deres styrker og begrænsninger for undersøgelser af klonisk hæmatopoiesis i hjerte-kar-sygdomme.

For at sammenligne effekten af tre BMT/pre-conditioning metoder på donor celle engraftment, fraktioner af donorceller i perifere blod og hjertevæv blev analyseret af flow cytometry på 1-måneders post-BMT. Isolerede celler blev farvet for specifikke leukocyt markører til at identificere de forskellige delmængder af leukocytter. I disse forsøg blev donor knoglemarvsceller af vild type(WT) C57BL/6 (CD45.2) leveret til WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/B...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Vi beskriver tre metoder til knoglemarvstransplantation (BMT): BMT med total kropsbestråling, BMT med afskærmet bestråling og BMT-metode uden prækonditionering (adoptiv BMT) til undersøgelse af klonisk hæmatopoiesis i musemodeller.

Knoglemarvstransplantationsprocedurer hos mus til undersøgelse af klonisk hæmatopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Vores protokol vil hjælpe forskere med at forstå de fysiologiske virkninger af tre forskellige knoglemarvstransplantationsmetoder, og hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i klonisk hæmatopoiesisindstilling. Total kropsstråling knoglemarvstransplantation kan have en negativ indvirkning hjerte-kar-organer og ændre sygdom patogenese. Således har vores laboratorium udviklet to alternative metoder til at minimere eller undgå mulige bivirkninger.Demonstrere procedurerne vil være Eunbee Park en kandidatstuderende, og Megan Evans en postdoc stipendiat, både fra mit laboratorium For thorax og mave afskærmning, skal du placere justerbare bakken og x-ray bestråling på den rigtige afstand for at opnå ensartet bestråling. Og placer de bedøvede mus på en flad led plade omvendt til hinanden i liggende stilling. Fastgør poterne til pladen med tape, og placer led-afskærmningen, så den nederste ende flugter med xiphisternumbenet, og den øvre ende af blyskjoldet sidder nær thymus.Efter afskærmning skal du placere musene i bestrålingsapparatet og udsætte dyrene for to, 5,5 grå fraktioner af bestråling adskilt af et fire til 24 timers interval. Til hovedafskærmning tapes forsigtigt musens fire poter til maven. Placer musen i en konisk fastholdelsesperson og skub fastholderen ind i åbningen i blyskjoldet, så musens hoved og ører er helt dækket, så resten af musens krop udsættes for stråling.Efter afskærmning placere musene i bestrålingsanlægget og udsætte dyrene for, til 5,5 grå brøkdele af en stråling adskilt af en fire til 24 timers interval. Efter hver strålebehandling skal du placere de bedøvede mus i et bur på en opvarmet måtte med overvågning, indtil de er fuldt genoprettet. For at isolere knoglerne skal du desinficere donormusens hud med 70% ethanol og lave et lille tværgående hudindsnit under brystkassen.Hold huden tæt på hver side af snittet, rive i modsatte retninger mod hoved og fødder og skræl huden fra alle lemmerne. Skær over skuldre og albue leddene, og brug en lab tørre til at fjerne de vedhæftede muskler og bindevæv fra humeri. Forsigtigt forvrænge leddene mellem lårbenet og hoftebenene.Og brug stump saks til at skære langs lårbenet hoveder til at løsne benene. Skær over knæleddet, for at adskille lårbenet og skinnebenet. Og brug lab klude til omhyggeligt at fjerne de vedhæftede muskler og bindevæv fra knoglerne.Træk derefter knoglerne fra mus af samme genotype ind i individuelle 50 milliliter koniske rør, der indeholder 20 milliliter iskold steril PBS på is. For at isolere knoglemarvscellerne i et biosikkerhedsklasse to-kabinet skal du bruge en 18-gauge nål til at lave et lille hul i bunden af et sterilt mikroliter mikrorør på 500 mikroliter. Og læg røret i et individuelt sterilt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter, der indeholder 100 mikroliter iskoldt sterilt PBS.Når alle rørene er forberedt, skal du fjerne PBS fra røret, der indeholder de isolerede knogler, og overføre knoglerne til en steril 100 millimeter cellekultur skål. Brug fine pincet og små saks til forsigtigt at fjerne epifysen fra enderne af hver knogle, og læg op til seks knogler i hver 500 mikroliter rør. Når alle knoglerne er skåret, udtrække knoglemarvscellerne ved centrifugering.Hvis alt marvindhold er fjernet, skal knoglerne fremstå hvide og gennemskinnelige med en relativt stor rød pellet i bunden af 1,5 milliliter mikrocentrifugerøret. Til knoglemarvscelletransplantation fortyndes de isolerede knoglemarvsceller i serumfri RPMI-medier, og 200 mikroliter af celleaffjedringen indlæses i en 0,5 milliliter insulinsprøjte pr. mus, der skal injiceres. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på pedalrefleks, injiceres langsomt hele mængden af celler i retro orbital venen af hvert bedøvet recipientdyr.Placer derefter en dråbe proparacain på øjet for smertelindring. Og lad musen komme til bevidsthed, mens den overvåges. At sammenligne effekten af tre BMT-forudsætningsmetoder på donorcelleindskrivning.Fraktionerne af donorceller i perifert blod og hjertevæv blev analyseret ved flowcytometri på en måned efter BMT. I denne repræsentative analyse blev i det perifere blod hos recipientmus, der modtog total kropsbestråling, monocytter, neutrofiler og B-celler stort set ablated og erstattet af afkom af donor knoglemarvsafledte celler. Derudover blev den bosiddende modtager af hjertemonocyt og neutrofilpopulationer næsten fuldstændig erstattet af donorafledte celler.I den delvist afskærmede bestrålingsgruppe var donoren kun beskeden. Recipientmus knoglemarvscellerne i de afskærmede områder bidrog sandsynligvis til det lavere niveau af perifer blodrekonstruktion sammenlignet med mus, der modtog total kropsbestråling. I gruppen uden BMT-forkonditionering kunne donorafledte celler påvises i modtagermusenes perifere blod og hjerter fire uger efter BMT.Derudover blev Tet2 mangelfulde donorceller gradvist udvidet over tid. Til sammenligning viste recipientmus, der var indgraveret med donorceller af vild type, minimal klonlig udvidelse af donorceller. De optimering af disse eksperimentelle modeller vil muliggøre strengere undersøgelser af kloniske hæmatopoiesis driver gener, der bidrager til alle forårsager dødelighed såsom hjerte-metabolisk sygdom og kræft.Vi håber, at vores protokoller vil give forskerne mulighed for at studere klonisk hæmatopoiesis at undersøge, hvordan det bidrager til hjerte-kar-sygdomme og andre sygdomstilstande.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Undersøgelse af Makrofag Polarization Brug knoglemarvsafledte makrofager

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-afledt Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langtids kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftvejsinfektion i mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation af Tail Hud til Study Allogen CD4 T-celle respons i mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Sporing Mouse knoglemarv Monocytter<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Lang Bone Dissektion og knoglemarv Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transduktion af knoglemarven til at generere T-celle receptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...