Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health an K. Walsh (HL131006, HL138014 und HL132564), an S. Sano (HL152174), american Heart Association grant an M. A. Evans (20POST35210098) und ein Japan Heart Foundation Grant an H. Ogawa unterstützt.

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt.
1. Vor der Vorkonditionierung
<ol><li>Legen Sie die Empfängermäuse ~24 h vor der Bestrahlung auf antibiotikahaltiges Wasser (5 mM Sulfamethoxazol, 0,86 mM Trimethoprim). Dies ist notwendig, um eine Infektion zu verhindern, da das Immunsystem nach der Bestrahlung unterdrückt und nach der Bestrahlung für 2 Wochen aufrechterhalten wird. Ergänzen Si...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. 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P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Für Studien der klonalen Hämatopoese beschrieben wir drei Methoden der BMT: BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit Bestrahlung mit partieller Abschirmung und eine weniger häufig verwendete BMT-Methode, die keine Vorkonditionierung beinhaltet (adoptive BMT). Diese Methoden wurden verwendet, um die Auswirkungen der klonalen Hämatopoese auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu bewerten. Forscher können diese Methoden entsprechend dem spezifischen Zweck ihrer Studie modifizieren.
Klonale H...

Klonale Hämatopoese (CH) ist eine Erkrankung, die häufig bei älteren Menschen beobachtet wird und als Folge eines erweiterten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellklons (HSPC) auftritt, der eine genetische Mutation trägt1. Es wurde vermutet, dass die meisten Individuen im Alter von 50 Jahren durchschnittlich fünf exonische Mutationen in jedem HSPC2erworben haben, aber die meisten dieser Mutationen werden zu wenig oder keinen phänotypischen Folgen für das Individuum führen. Wenn jedoch zufällig eine dieser Mutationen dem HSPC einen Wettbewerbsvorteil verschafft - z. B. durch die Förderung seiner Proliferation, Selbsterneuerung, Überleben oder einer Kombination davon - kann dies zu einer bevorzugten Expansion des mutierten Klons im Vergleich zu den anderen HSPCs führen. Infolgedessen wird sich die Mutation zunehmend durch das hämatopoetische System ausbreiten, da das mutierte HSPC zu reifen Blutzellen führt, was zu einer ausgeprägten Population mutierter Zellen im peripheren Blut führt. Während Mutationen in Dutzenden verschiedener Kandidatentreibergene mit klonalen Ereignissen innerhalb des hämatopoetischen Systems in Verbindung gebracht wurden, sind unter diesen Mutationen in DNA-Methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) und zehn elf Translokation 2 (TET2) am häufigsten3. Mehrere epidemiologische Studien haben ergeben, dass Personen, die diese genetischen Mutationen tragen, ein signifikant höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), Schlaganfall und gesamtverursachende Mortalität haben3,4,5,6,7. Während diese Studien festgestellt haben, dass ein Zusammenhang zwischen CH und erhöhter Inzidenz von CVD und Schlaganfall besteht, wissen wir nicht, ob dieser Zusammenhang kausal oder ein gemeinsames Epiphänomen mit dem Alterungsprozess ist. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, sind geeignete Tiermodelle erforderlich, die den menschlichen Zustand von CH korrekt rekapitulieren.
Mehrere CH-Tiermodelle wurden von unserer Gruppe und anderen mit Zebrafischen, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten8,9,10,11,12,13,14erstellt. Diese Modelle verwenden häufig hämatopoetische Rekonstitutionsmethoden durch Transplantation genetisch veränderter Zellen, manchmal unter Verwendung der Cre-lox-Rekombination oder des CRISPR-Systems. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse einer spezifischen Genmutation in hämatopoetischen Zellen, um zu beurteilen, wie sie zur Krankheitsentwicklung beiträgt. Darüber hinaus verwenden diese Modelle oft kongenische oder Reporterzellen, um die Wirkungen mutierter Zellen von normalen oder Wildtypzellen zu unterscheiden. In vielen Fällen ist ein Vorkonditionierungsschema erforderlich, um hämatopoetische Spenderstammzellen erfolgreich zu transplantieren.
Derzeit kann die Transplantation von Knochenmark auf Empfängermäuse in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: 1) myeloablative Konditionierung und 2) nicht konditionierte Transplantation. Die myeloablative Konditionierung kann durch eine von zwei Methoden erreicht werden, nämlich Die Ganzkörperbestrahlung (TBI) oder die Chemotherapie15. TBI wird durchgeführt, indem der Empfänger einer tödlichen Dosis Gamma- oder Röntgenbestrahlung unterzogen wird, wodurch DNA-Brüche oder Querverbindungen innerhalb sich schnell teilender Zellen erzeugt werden, wodurch sie irreparabel werden16. Busulfan und Cyclophosphamid sind zwei häufig verwendete Chemotherapeutika, die die hämatopoetische Nische stören und in ähnlicher Weise DNA-Schäden an sich schnell teilenden Zellen verursachen. Das Nettoergebnis der myeloablativen Vorkonditionierung ist die Apoptose hämatopoetischer Zellen, die das hämatopoetische System des Empfängers zerstört. Diese Strategie ermöglicht nicht nur die erfolgreiche Transplantation der Spender-HSPCs, sondern kann auch eine Transplantatabstoßung verhindern, indem das Immunsystem des Empfängers unterdrückt wird. Die myeloablative Vorkonditionierung hat jedoch schwere Nebenwirkungen wie Schäden an Geweben und Organen und deren ansässigen Immunzellen sowie Die Zerstörung der nativen Knochenmarknische17. Daher wurden alternative Methoden vorgeschlagen, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu überwinden, insbesondere im Hinblick auf Schäden an den interessierender Organen. Diese Methoden umfassen die abgeschirmte Bestrahlung von Empfängermäusen und die adoptive BMT auf nicht konditionierte Mäuse9,17. Die Abschirmung des Thorax, der Bauchhöhle, des Kopfes oder anderer Regionen vor Bestrahlung durch die Platzierung einer Bleibarriere schützt das interessierende Gewebe vor den schädlichen Auswirkungen der Bestrahlung und erhält seine ansässige Immunzellpopulation. Auf der anderen Seite hat die adoptive BMT von HSPCs für nicht konditionierte Mäuse einen zusätzlichen Vorteil, da sie die native hämatopoetische Nische bewahrt. In diesem Manuskript beschreiben wir die Protokolle und Ergebnisse der HSPC-Transplantation nach mehreren Transplantationsschemata bei Mäusen, insbesondere die Abgabe von HSPC an TBI-Mäuse, an Mäuse, die teilweise vor Bestrahlung geschützt sind, und an nicht konditionierte Mäuse. Das übergeordnete Ziel ist es, den Forschern zu helfen, die verschiedenen physiologischen Auswirkungen jeder Methode zu verstehen und zu verstehen, wie sie die experimentellen Ergebnisse im Rahmen von CH und Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

Die klonale Hämatopoese ist eine weit verbreitete altersbedingte Erkrankung, die sich aus der Anhäufung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) ergibt. Mutationen in Treibergenen, die zelluläre Fitness verleihen, können zur Entwicklung expandierender HSPC-Klone führen, die zunehmend zu Nachkommenleukozyten führen, die die somatische Mutation beherbergen. Da klonale Hämatopoese mit Herzerkrankungen, Schlaganfall und Mortalität in Verbindung gebracht wurde, ist die Entwicklung experimenteller Systeme, die diese Prozesse modellieren, der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die diesem neuen Risikofaktor zugrunde liegen. Knochenmarktransplantationsverfahren mit myeloablativer Konditionierung bei Mäusen, wie z. B. Ganzkörperbestrahlung (TBI), werden häufig eingesetzt, um die Rolle von Immunzellen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. Eine gleichzeitige Schädigung der Knochenmarknische und anderer interessensvoller Stellen wie Herz und Gehirn ist bei diesen Verfahren jedoch unvermeidbar. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen durch TBI zu minimieren oder zu vermeiden: 1) Knochenmarktransplantation mit Bestrahlungsabschirmung und 2) adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen. In abgeschirmten Organen bleibt die lokale Umgebung erhalten, was die Analyse der klonalen Hämatopoese ermöglicht, während die Funktion der ansässigen Immunzellen ungestört ist. Im Gegensatz dazu hat die adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen den zusätzlichen Vorteil, dass sowohl die lokale Umgebung der Organe als auch die hämatopoetische Nische erhalten bleiben. Hier vergleichen wir drei verschiedene hämatopoetische Zellrekonstitutionsansätze und diskutieren ihre Stärken und Grenzen für Studien zur klonalen Hämatopoese bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Um die Wirkung von drei BMT/Vorkonditionierungsmethoden auf die Spenderzelltransplantation zu vergleichen, wurden die Fraktionen von Spenderzellen in peripherem Blut und Herzgewebe mittels Durchflusszytometrie nach 1 Monat nach BMT analysiert. Isolierte Zellen wurden für spezifische Leukozytenmarker gefärbt, um die verschiedenen Untergruppen von Leukozyten zu identifizieren. In diesen Experimenten wurden Wildtyp(WT) C57BL/6 (CD45.2) Spenderknochenmarkzellen an WT B6 abgegeben. SJL-Ptprc<...

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Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Unser Protokoll wird den Forschern helfen, die physiologischen Auswirkungen von drei verschiedenen Knochenmarktransplantationsmethoden zu verstehen und wie sie die experimentellen Ergebnisse bei klonaler Hämatopoese beeinflussen. Die Knochenmarktransplantation mit Gesamtkörperstrahlung kann sich negativ auf herz-kardiovaskuläre Organe auswirken und die Pathogenese der Krankheit verändern. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen zu minimieren oder zu vermeiden.Die Verfahren werden von Eunbee Park, einer Doktorandin, und Megan Evans, einer Postdoktorandin, beide aus meinem Labor, demonstriert Für Thorax- und Bauchabschirmung, platzieren Sie die verstellbare Tablett und den Röntgenstrahler im richtigen Abstand, um eine gleichmäßige Bestrahlung zu erreichen. Und legen Sie die betäubten Mäuse auf eine flache LED-Platte, die in Rückenlage umgekehrt zueinander ist. Befestigen Sie die Pfoten mit Klebeband an der Platte und platzieren Sie die LED-Abschirmung so, dass das untere Ende mit dem Xiphisternumknochen ausgerichtet ist und das obere Ende des Bleischildes in der Nähe des Thymus sitzt.Setzen Sie die Mäuse nach der Abschirmung in den Bestrahlungskörper und setzen Sie die Tiere zwei 5,5 grauen Bestrahlungsfraktionen aus, die durch ein Intervall von vier bis 24 Stunden getrennt sind. Zur Kopfabschirmung die vier Pfoten der Maus vorsichtig an den Bauch kleben. Legen Sie die Maus in einen konischen Rückhaltearm und schieben Sie den Rückhalteer in den Schlitz innerhalb des Bleischildes, so dass der Kopf und die Ohren der Maus vollständig bedeckt sind, so dass der Rest des Mauskörpers für eine Strahlung freigelegt bleibt.Nach der Abschirmung legen Sie die Mäuse in den Bestrahlungskörper und setzen die Tiere 5,5 grauen Fraktionen einer Strahlung aus, die durch ein Vier- bis 24-Stunden-Intervall getrennt sind. Nach jeder Strahlenbehandlung legen Sie die betäubten Mäuse in einen Käfig auf einer beheizten Matte mit Überwachung, bis sie vollständig genesen sind. Um die Knochen zu isolieren, desinfizieren Sie die Haut der Spendermaus mit 70% Ethanol und machen Sie einen kleinen quer verlaufenden Hautschnitt unterhalb des Brustkorbs.Halten Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts fest, reißen Sie in entgegengesetzte Richtungen zu Kopf und Füßen und schälen Sie die Haut von allen Gliedmaßen. Schneiden Sie über die Schultern und Ellbogengelenke und verwenden Sie ein Labortuch, um die angeschlossenen Muskeln und das Bindegewebe aus den Humeri zu entfernen. Verrenken Sie vorsichtig die Gelenke zwischen Femur und Hüftknochen.Und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um entlang der Oberschenkelköpfe zu schneiden, um die Beine zu lösen. Schneiden Sie über das Kniegelenk, um den Femur und das Schienbein zu trennen. Und verwenden Sie Labortücher, um die angeschlossenen Muskeln und das Bindegewebe vorsichtig aus den Knochen zu entfernen.Ziehen Sie dann die Knochen von Mäusen des gleichen Genotyps in einzelne 50-Milliliter-Konusenröhrchen, die 20 Milliliter eiskaltes steriles PBS auf Eis enthalten. Um die Knochenmarkzellen in einem Gehäuse der Biosicherheitsklasse zwei zu isolieren, verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um ein kleines Loch in den Boden eines sterilen 500-Mikroliter-Mikroröhrchens zu bohren. Und legen Sie das Röhrchen in ein einzelnes steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern eiskaltem sterilem PBS.Wenn alle Röhrchen vorbereitet sind, entfernen Sie das PBS aus dem Röhrchen, das die isolierten Knochen enthält, und übertragen Sie die Knochen auf eine sterile 100-Millimeter-Zellkulturschale. Verwenden Sie eine feine Zange und eine kleine Schere, um die Epiphyse vorsichtig von den Enden jedes Knochens zu entfernen, und legen Sie bis zu sechs Knochen in jedes 500-Mikroliter-Röhrchen. Wenn alle Knochen geschnitten wurden, extrahieren Sie die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation.Wenn der gesamte Markinhalt entfernt wurde, sollten die Knochen weiß und durchscheinend mit einem relativ großen roten Pellet am Boden des 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens erscheinen. Für die Knochenmarkzelltransplantation verdünnen Sie die isolierten Knochenmarkzellen in serumfreien RPMI-Medien und laden 200 Mikroliter der Zellsuspension in eine 0,5 Milliliter Insulinspritze pro Maus, die injiziert werden soll. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt haben, injizieren Sie langsam das gesamte Zellvolumen in die Retroorbitalvene jedes betäubten Empfängertiers.Dann legen Sie einen Tropfen Proparacain auf das Auge zur Schmerzlinderung. Und erlauben Sie der Maus, das Bewusstsein wiederzuerlangen, während sie überwacht wird. Es sollte die Wirkung von drei BMT-Vorkonditionierungsmethoden auf die Spenderzelltransplantation verglichen werden.Die Fraktionen der Spenderzellen im peripheren Blut und Herzgewebe wurden einen Monat nach der BMT mittels Durchflusszytometrie analysiert. In dieser repräsentativen Analyse wurden im peripheren Blut von Empfängermäusen, die eine Ganzkörperbestrahlung erhielten, Monozyten, Neutrophile und B-Zellen weitgehend abgetragen und durch die Nachkommen von Spenderknochenmarkzellen ersetzt. Darüber hinaus wurden die ansässigen Empfänger-Herzmonozyten- und Neutrophilenpopulationen fast vollständig durch Spenderzellen ersetzt.In der teilweise abgeschirmten Bestrahlungsgruppe war der vom Spender abgeleitete kardiale Immunzellersatz bescheiden. Die Knochenmarkzellen der Empfängermaus in den abgeschirmten Regionen trugen wahrscheinlich zu einem niedrigeren Niveau der peripheren Blutrekonstitution bei als Mäuse, die eine Ganzkörperbestrahlung erhielten. In der Gruppe ohne BMT-Vorkonditionierung waren Spenderzellen vier Wochen nach bmT im peripheren Blut und in den Herzen der Empfängermäuse nachweisbar.Darüber hinaus dehnten sich Tet2-defiziente Spenderzellen im Laufe der Zeit allmählich aus. Im Vergleich dazu zeigten Empfängermäuse, die mit Wildtyp-Spenderzellen transplantiert wurden, eine minimale klonale Ausdehnung der Spenderzellen. Die Optimierung dieser experimentellen Modelle wird strengere Studien der klonalen Hämatopoese-Treibergene ermöglichen, die zu allen Todesursachen wie Kardiometabolischen Erkrankungen und Krebs beitragen.Wir hoffen, dass unsere Protokolle es den Forschern ermöglichen werden, die klonale Hämatopoese zu untersuchen, um zu untersuchen, wie sie zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen Krankheitszuständen beiträgt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

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As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

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