Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dei National Institutes of Health degli Stati Uniti a K. Walsh (HL131006, HL138014 e HL132564), a S. Sano (HL152174), sovvenzione dell'American Heart Association a M. A. Evans (20POST35210098) e una sovvenzione della Japan Heart Foundation a H. Ogawa.

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia.
1. Prima della precondizione
<ol><li>Posizionare i topi ricevente sull'acqua integrata da antibiotici (5 mM di sulfamethoxazolo, 0,86 mM trimetooprim) ~24 ore prima dell'irradiazione. Ciò è necessario per prevenire l'infezione, poiché il sistema immunitario verrà soppresso dopo l'irradiazione e mantenuto per 2 settimane dopo l'...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Per gli studi sull'ematopoiesi clonale, abbiamo descritto tre metodi di BMT: BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione con schermatura parziale e un metodo BMT meno comunemente usato che non comporta precondi condizionamento (BMT adottivo). Questi metodi sono stati utilizzati per valutare l'impatto dell'ematopoiesi clonale sulle malattie cardiovascolari. I ricercatori possono modificare questi metodi di conseguenza per soddisfare lo scopo specifico del loro studio.
Mo...

L'ematopoiesi clonale (CH) è una condizione che si osserva frequentemente negli individui anziani e si verifica come risultato di un fusto ematopoietico espanso e di un clone della cellula progenitrice (HSPC) che porta una mutazione genetica1. È stato suggerito che all'età di 50 anni, la maggior parte degli individui avrà acquisito una media di cinque mutazioni esoniche in ogni HSPC2, ma la maggior parte di queste mutazioni comporterà poche o nessuna conseguenza fenotipica per l'individuo. Tuttavia, se per caso una di queste mutazioni conferisce un vantaggio competitivo all'HSPC, ad esempio promuovendone la proliferazione, l'autorinovità, la sopravvivenza o qualche combinazione di queste, ciò potrebbe portare all'espansione preferenziale del clone mutante rispetto agli altri HSPC. Di conseguenza, la mutazione si diffonderà sempre più attraverso il sistema ematopoietico poiché l'HSPC mutato dà origine a cellule del sangue mature, portando a una distinta popolazione di cellule mutate all'interno del sangue periferico. Mentre mutazioni in dozzine di diversi geni driver candidati sono stati associati a eventi clonali all'interno del sistema ematopoietico, tra questi, le mutazioni nel DNA metiltransferasi 3 alfa (DNMT3A) e dieci undici traslocazioni 2 (TET2) sono le più prevalenti3. Diversi studi epidemiologici hanno scoperto che gli individui che portano queste mutazioni genetiche hanno un rischio significativamente più elevato di malattie cardiovascolari (CVD), ictus e mortalità per cause3,4,5,6,7. Mentre questi studi hanno identificato che esiste un'associazione tra CH e aumento dell'incidenza di CVD e ictus, non sappiamo se questa relazione sia causale o un epifenomeno condiviso con il processo di invecchiamento. Per ottenere una migliore comprensione di questa associazione, sono necessari modelli animali adeguati che ricapitolano correttamente la condizione umana di CH.
Diversi modelli di animali CH sono stati stabiliti dal nostro gruppo e altri utilizzando zebrafish, topi e primati non umani8,9,10,11,12,13,14. Questi modelli utilizzano spesso metodi di ricostituzione ematopoietica mediante trapianto di cellule geneticamente modificate, a volte utilizzando la ricombinazione Cre-lox o il sistema CRISPR. Questo approccio consente l'analisi di una specifica mutazione genica nelle cellule ematopoietiche per valutare come contribuisce allo sviluppo della malattia. Inoltre, questi modelli spesso impiegano cellule congeniche o reporter per distinguere gli effetti delle cellule mutanti dalle cellule normali o di tipo selvaggio. In molti casi, è necessario un regime di precondizione per innestare con successo le cellule staminali ematopoietiche del donatore.
Attualmente, il trapianto di midollo osseo ai topi riceventi può essere diviso in due categorie principali: 1) condizionamento mieloablativo e 2) trapianto non condizionato. Il condizionamento mieloablativo può essere ottenuto con uno dei due metodi seguenti, vale a dire l'irradiazione totale del corpo (TBI) o la chemioterapia15. Il TBI viene effettuato sottopose il ricevente a una dose letale di irradiazione gamma o a raggi X, generando rotture di DNA o collegamenti incrociati all'interno di cellule che si dividono rapidamente, rendendoleirreparabili 16. Busulfan e ciclofosfamide sono due farmaci chemioterapici comunemente usati che interrompono la nicchia ematopoietica e allo stesso modo causano danni al DNA alle cellule che si dividono rapidamente. Il risultato netto della precondizione mieloablativa è l'apoptosi delle cellule ematopoietiche, che distrugge il sistema ematopoietico del ricevente. Questa strategia non solo consente il successo dell'innesto degli HSPC donatori, ma può anche prevenire il rifiuto dell'innesto sopprimendo il sistema immunitario del ricevente. Tuttavia, la precondizione mieloablativa ha gravi effetti collaterali come danni a tessuti e organi e alle loro cellule immunitarie residenti, nonché distruzione della nicchia nativa del midollo osseo17. Pertanto, sono stati proposti metodi alternativi per superare questi effetti collaterali indesiderati, in particolare per quanto riguarda i danni agli organi di interesse. Questi metodi comprendono l'irradiazione protetta dei topi riceventi e il BMT adottivo per i topinon condizionati 9,17. La protezione del torace, della cavità addominale, della testa o di altre regioni dall'irradiazione mediante il posizionamento di una barriera di piombo protegge i tessuti di interesse dagli effetti dannosi dell'irradiazione e mantiene la loro popolazione di cellule immunitarie residenti. D'altra parte, il BMT adottivo degli HSPC per i topi non condizionati ha un ulteriore vantaggio perché preserva la nicchia ematopoietica nativa. In questo manoscritto, descriviamo i protocolli e i risultati dell'innesto HSPC dopo diversi regimi di trapianto nei topi, in particolare la consegna di HSPC ai topi TBI, ai topi parzialmente schermati dall'irradiazione e ai topi non condizionati. L'obiettivo generale è quello di aiutare i ricercatori a comprendere i diversi effetti fisiologici di ogni metodo e come influenzano i risultati sperimentali nella definizione di CH e malattie cardiovascolari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

L'ematopoiesi clonale è una condizione prevalente associata all'età che deriva dall'accumulo di mutazioni somatiche nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Le mutazioni nei geni dei driver, che conferiscono forma fisica cellulare, possono portare allo sviluppo di cloni HSPC in espansione che danno sempre più origine a leucociti progenie che ospitano la mutazione somatica. Poiché l'ematopoiesi clonale è stata associata a malattie cardiache, ictus e mortalità, lo sviluppo di sistemi sperimentali che modellano questi processi è fondamentale per comprendere i meccanismi che sottinero a questo nuovo fattore di rischio. Le procedure di trapianto di midollo osseo che coinvolgono il condizionamento mieloablativo nei topi, come l'irradiazione totale del corpo (TBI), sono comunemente utilizzate per studiare il ruolo delle cellule immunitarie nelle malattie cardiovascolari. Tuttavia, il danno simultaneo alla nicchia del midollo osseo e ad altri siti di interesse, come il cuore e il cervello, è inevitabile con queste procedure. Pertanto, il nostro laboratorio ha sviluppato due metodi alternativi per ridurre al minimo o evitare possibili effetti collaterali causati da TBI: 1) trapianto di midollo osseo con schermatura di irradiazione e 2) BMT adottivo a topi non condizionati. Negli organi schermati, l'ambiente locale è preservato consentendo l'analisi dell'ematopoiesi clonale mentre la funzione delle cellule immunitarie residenti non è perturbata. Al contrario, il BMT adottivo per topi non condizionati ha l'ulteriore vantaggio che sia gli ambienti locali degli organi che la nicchia ematopoietica sono conservati. Qui, confrontiamo tre diversi approcci di ricostituzione delle cellule ematopoietiche e discutiamo i loro punti di forza e limiti per gli studi sull'ematopoiesi clonale nelle malattie cardiovascolari.

Per confrontare l'effetto di tre metodi BMT/precondizionamento sull'innesto cellulare del donatore, le frazioni di cellule donatrici nel sangue periferico e nel tessuto cardiaco sono state analizzate dalla citometria a flusso a 1 mese dopo la BMT. Le cellule isolate sono state macchiate per specifici marcatori di leucociti per identificare i diversi sottoinsiemi di leucociti. In questi esperimenti, le cellule del midollo osseo donatrici di tipo selvatico(WT) C57BL/6 (CD45.2) sono state consegnate al WT ...

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Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Il nostro protocollo aiuterà i ricercatori a comprendere gli effetti fisiologici di tre diversi metodi di trapianto di midollo osseo e come influenzano i risultati sperimentali nell'impostazione dell'ematopoiesi clonale. Il trapianto totale di midollo osseo con radiazioni corporee può avere un impatto negativo sugli organi cardiovascolari e alterare la patogenesi della malattia. Pertanto, il nostro laboratorio ha sviluppato due metodi alternativi per ridurre al minimo o evitare possibili effetti collaterali.A dimostrare le procedure saranno Eunbee Park, una studentessa laureata, e Megan Evans un post-dottorato, entrambi del mio laboratorio Per la schermatura del torace e dell'addome, posizionare il vassoio regolabile e l'irradiatore a raggi X alla giusta distanza per ottenere un'irradiazione uniforme. E posizionare i topi anestetizzati su una piastra a led piatta invertita l'uno all'altro in posizione supina. Fissare le zampe alla piastra con del nastro adesivo e posizionare la schermatura a led in modo che l'estremità inferiore si allinei con l'osso xiphisternum e l'estremità superiore dello scudo di piombo si si sieda vicino al timo.Dopo la schermatura, posizionare i topi nell'irraggiatore ed esporre gli animali a due frazioni grigie di irradiazione di 5,5 ore separate da un intervallo di quattro-24 ore. Per la schermatura della testa, rastremi attentamente le quattro zampe del mouse all'addome. Posizionare il mouse in un limitatore conico e far scorrere il trattino nella fessura all'interno dello scudo di piombo in modo che la testa e le orecchie del mouse siano completamente coperte, lasciando il resto del corpo del mouse esposto per una radiazione.Dopo la schermatura posizionare i topi nell'irradiatore ed esporre gli animali a 5,5 frazioni grigie di una radiazione separate da un intervallo di quattro-24 ore. Dopo ogni trattamento con radiazioni, posizionare i topi anestetizzati in una gabbia su un tappetino riscaldato con monitoraggio fino a completo recupero. Per isolare le ossa, disinfettare la pelle del topo donatore con il 70% di etanolo e fare una piccola incisione trasversale della pelle sotto la gabbia toracica.Tenendo la pelle saldamente su entrambi i lati dell'incisione, strappare in direzioni opposte verso la testa e i piedi e sbucciare la pelle da tutti gli arti. Tagliare le spalle e le articolazioni del gomito e utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere i muscoli attaccati e i tessuti connettivi dagli humeri. Dislocare con cura le articolazioni tra il femore e le ossa dell'anca.E usa forbici smussate per tagliare lungo le teste del femorale per staccare le gambe. Tagliare sopra l'articolazione del ginocchio, per separare il femore e la tibia. E usa le salviette da laboratorio per rimuovere con cura i muscoli attaccati e i tessuti connettivi dalle ossa.Quindi estrarre le ossa dai topi dello stesso genotipo in singoli tubi conici da 50 millilitri contenenti 20 millilitri di PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio. Per isolare le cellule del midollo osseo in un armadio di classe due di biosicurezza, utilizzare un ago calibro 18 per fare un piccolo foro nella parte inferiore di un microtubo sterile da 500 microliter. E posizionare il tubo in un singolo tubo sterile di micro centrifuga sterile da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di PBS sterile freddo ghiaccio.Una volta preparati tutti i tubi, rimuovere il PBS dal tubo contenente le ossa isolate e trasferire le ossa su un piatto sterile di coltura cellulare da 100 millimetri. Utilizzare forcep fini e piccole forbici per rimuovere con cura l'epifisi dalle estremità di ogni osso e posizionare fino a sei ossa in ogni tubo da 500 microliter. Quando tutte le ossa sono state tagliate, estrarre le cellule del midollo osseo per centrifugazione.Se tutto il contenuto di midollo è stato rimosso, le ossa dovrebbero apparire bianche e traslucide con un pellet rosso relativamente grande nella parte inferiore del tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Per il trapianto di cellule del midollo osseo, diluire le cellule isolate del midollo osseo in mezzi RPMI senza siero e caricare 200 microlitri della sospensione cellulare in una siringa per insulina da 0,5 millilitri per topo da iniettare. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, iniettare lentamente l'intero volume delle cellule nella vena orbitale retrò di ogni animale ricevente anestetizzato.Quindi posizionare una goccia di proparacaina sull'occhio per alleviare il dolore. E permettere al topo di riprendere conoscenza mentre viene monitorato. Confrontare l'effetto di tre metodi di precondizione BMT sull'innesto cellulare del donatore.Le frazioni di cellule donatrici nel sangue periferico e nel tessuto cardiaco sono state analizzate dalla citometria del flusso a un mese dopo la BMT. In questa analisi rappresentativa, nel sangue periferico dei topi riceventi che hanno ricevuto l'irradiazione totale del corpo, monociti, neutrofili e cellule B sono stati in gran parte ablati e sostituiti dalla progenie delle cellule derivate dal midollo osseo donatore. Inoltre, le popolazioni di monociti cardiaci e neutrofili riceventi residenti sono state quasi completamente sostituite da cellule derivate dal donatore.Nel gruppo di irradiazione parzialmente schermato, la sostituzione delle cellule immunitarie cardiache derivata dal donatore era modesta. Le cellule del midollo osseo del topo ricevente all'interno delle regioni schermate hanno probabilmente contribuito al livello inferiore di ricostituzione del sangue periferico rispetto ai topi che hanno ricevuto l'irradiazione totale del corpo. Nel gruppo senza precondizione BMT, le cellule derivate dal donatore erano rilevabili nel sangue periferico e nel cuore dei topi riceventi a quattro settimane dopo la BMT.Inoltre, le cellule donatrici carenti di Tet2 si espansero gradualmente nel tempo. In confronto, i topi ricevente innestati con cellule donatrici di tipo selvatico hanno mostrato una minima espansione clonale delle cellule donatrici. L'ottimizzazione di questi modelli sperimentali consentirà studi più rigorosi dei geni del driver dell'ematopoiesi clonale che contribuiscono a tutte le cause di mortalità come le malattie cardio-metaboliche e il cancro.Speriamo che i nostri protocolli consentano ai ricercatori di studiare l'ematopoiesi clonale per indagare come contribuisce alle malattie cardiovascolari e ad altri stati di malattia.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...