Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
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この研究は、K.ウォルシュ(HL131006、HL138014、HL132564)、S.サノ(HL152174)、M.A.エバンス(20POST35210098)への米国心臓協会助成金、および小川への日本心臓財団への米国国立衛生研究所の助成金によって支援されました。

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 事前調整の前に
<ol><li>レシピエントマウスを抗生物質補充水(5 mMスルファメトキサゾール、0.86 mMトリメトプリム)~24時間前に照射する。これは、感染を予防するために必要であり、免疫系は照射後に抑制され、照射後2週間維持される。この時点...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

クローン造造の研究では、総ボディ照射を伴うBMT、部分シールドによる照射を伴うBMT、およびプレコンディショニングを伴わないあまり一般的に使用されないBMT法(養子BMT)の3つの方法について説明した。これらの方法は、クローン造造が心血管疾患に及ぼす影響を評価するために使用されてきた。研究者は、研究の特定の目的に合わせてこれらの方法を変更することができます。
<p class="j...

クローン造血(CH)は、高齢の個体で頻繁に観察される状態であり、遺伝子変異を運ぶ造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)クローンの拡大の結果として生じる。50歳までに、ほとんどの個体が各HSPC2で平均5つのエキソン突然変異を獲得することが示唆されているが、これらの突然変異のほとんどは、その個体にほとんどまたは全く触知の結果をもたらすであろう。しかし、偶然にも、これらの突然変異の1つがHSPCに対して競争上の優位性を与える(例えば、HSPCの増殖、自己再生、生存、またはこれらの組み合わせ)が与える場合、これは他のHSPCsに対する変異クローンの優先的な拡大につながる可能性があります。その結果、突然変異したHSPCが成熟した血液細胞を生み出し、末梢血内の突然変異細胞の明確な集団に至るにつれて、突然変異は造血系を通じてますます広がる。数十の異なる候補ドライバ遺伝子の変異が造血系内のクローンイベントと関連している一方、これらの中で、DNAメチルトランスヴァリン酵素3α(DNMT3A)および111個の転座2(TET2)の変異が最も一般的である3。いくつかの疫学的研究では、これらの遺伝子変異を運ぶ個人は、心血管疾患(CVD)、脳卒中、および全因果死亡率のリスクが有意に高いことを発見しました3,4,5,6,7.これらの研究は、CHとCVDと脳卒中の発生率の増加との間に関連が存在することを特定したが、この関係が因果関係であるか、老化プロセスと共通のエピレプションであるかは分からない。この関連を理解するためには、CHの人間の状態を正しく再現する適切な動物モデルが必要です。
ゼブラフィッシュ、マウス、および非ヒト霊長類8、9、10、11、12、13、14を使用して、我々のグループと他の人によっていくつかのCH動物モデルが確立されています。これらのモデルは、しばしば、Cre-lox組換えまたはCRISPRシステムを用いて、遺伝子組換え細胞の移植による造血再構成法を使用する。このアプローチにより、造血細胞における特定の遺伝子変異の分析が、疾患の発症にどのように寄与するかを評価することができます。さらに、これらのモデルは、多くの場合、正常または野生型細胞から変異細胞の効果を区別するために、コンジェニックまたはレポーター細胞を採用しています。多くの場合、ドナー造血幹細胞を正常に生着させるためには、事前調整レジメンが必要です。
現在、骨髄をレシピエントマウスに移植することは、1)骨髄性調節と2)非条件付き移植の2つの主要なカテゴリーに分けることができる。骨髄性調節は、2つの方法、すなわち、全身照射(TBI)または化学療法15のいずれかによって達成することができる。TBIは、レシピエントにガンマまたはX線照射の致死量を照射することによって行われ、急速に分裂した細胞内でDNA切断またはクロスリンクを生成し、それらを取り返しのつかない16にレンダリングする。ブスルファンとシクロホスファミドは、造血ニッチを破壊し、同様に急速に分裂する細胞にDNA損傷を引き起こす2つの一般的に使用される化学療法薬である。骨髄性プレコンディショニングの結果は、レシピ細胞のアポトーシスであり、レシピエントの造血系を破壊する。この戦略は、ドナーHSPの生着を成功させるだけでなく、レシピエントの免疫系を抑制することによって移植片拒絶反応を防ぐこともできる。しかし、骨髄性プレコンディショニングは、組織および器官およびそれらの常駐免疫細胞への損傷ならびに天然骨髄ニッチ17の破壊などの重篤な副作用を有する。したがって、これらの望ましくない副作用を克服する代替方法が提案されているが、特に目的の器官への損傷に関してである。これらの方法は、受容マウスのシールド照射及び非条件マウス9、17への養子BMTを含む。リードバリアの配置による胸郭、腹腔、頭部または他の領域を照射から遮蔽し、照射の有害な影響から保護された目的の組織を維持し、その常駐免疫細胞集団を維持する。一方、非コンディションマウスにHSPCの採用BMCは、天然造血ニッチを維持するため、追加の利点を有する。本稿では、マウスにおけるいくつかの移植レジメン、特にTBIマウスへのHSPCの送達、部分的に照射から遮蔽されたマウス、および非調整マウスへのHSPC生着のプロトコルおよび結果について述べる。全体的な目標は、研究者が各方法の異なる生理学的影響だけでなく、CHと心血管疾患の設定における実験的成果にどのような影響を与えるかを理解するのを助けるものです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

クローン造血は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)における体細胞突然変異の蓄積に起因する一般的な年齢関連状態である。細胞の適合性を与えるドライバー遺伝子の突然変異は、体細胞突然変異を抱える子孫白血球をますます生じさせるHSPCクローンの拡大につながる可能性がある。クローン造形は心臓病、脳卒中、死亡率に関連しているため、これらのプロセスをモデル化する実験システムの開発は、この新しい危険因子のメカニズムを理解する鍵です。全身照射(TBI)などのマウスにおける骨髄性調節を伴う骨髄移植手順は、心血管疾患における免疫細胞の役割を研究するために一般的に採用されている。しかし、骨髄ニッチおよび心臓や脳などの関心のある他の部位への同時損傷は、これらの手順では避けられない。このように、私たちの研究室は、TBIによって引き起こされる可能性のある副作用を最小限に抑えるか回避するための2つの代替方法を開発しました:1)照射シールドによる骨髄移植と2)非条件付きマウスへの養子BMT。シールドされた器官では、局所的な環境が保存され、常駐免疫細胞の機能が妨げられていない間、クローン造造りの分析を可能にする。対照的に、非コンディショネートマウスへの導入BMTは、臓器の局所環境と造血ニッチの両方が保存されるという付加的な利点を有する。ここでは、3つの異なる造血細胞再構成アプローチを比較し、心血管疾患におけるクローン造血の研究におけるそれらの強みと限界について議論する。

ドナー細胞の生着に対する3つのBMT/プレコンディショニング方法の効果を比較するために、末梢血および心臓組織におけるドナー細胞の分画を、1ヶ月後のBMT後のフローサイトメトリーによって分析した。特定の白血球マーカーについて分離細胞を染色し、白血球の異なるサブセットを同定した。これらの実験では、野生型(WT)C57BL/6(CD45.2)ドナー骨髄細胞をWT B6に送達した。SJL-Pt...

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Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

骨髄移植(BMT)の3つの方法について、全体照射によるBMT、シールド照射を伴うBMT、マウスモデルにおけるクローナル造頭法の研究のための予備調整なし(養子BMT)を用いたBMT法について述べた。

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

私たちのプロトコルは、研究者が3つの異なる骨髄移植方法の生理学的影響と、それらがクローン造造りの設定における実験的結果にどのような影響を与えるかを理解するのに役立ちます。全身放射線骨髄移植は、心血管器官に悪影響を及ぼし、疾患の病態を変える可能性があります。このように、我々の研究室は、副作用の可能性を最小限に抑える、または回避するための2つの代替方法を開発しました。手順を実証するのは、大学院生のウンビーパークと、私の研究室の博士研究員のメーガン・エヴァンスが、私の研究室から胸郭と腹部のシールドのために、調整可能なトレイとX線照射器を正しい距離に置いて均一な照射を達成します。そして、麻酔マウスを平らな導いたプレートに置き、より大きな位置に互いに反転させた。テープでプレートに足を固定し、下端がキシヒステルナム骨と整列し、リードシールドの上端が胸腺の近くに座るように導いたシールドを配置します。遮蔽後、マウスを照射器に入れ、動物を4〜24時間間隔で分離した2、5.5グレイの照射分画に曝露する。ヘッドシールドのために、慎重に腹部にマウスの4つの足をテープ。マウスを円錐型の拘束器に置き、リードシールド内のスロットに拘束剤をスライドさせて、マウスの頭と耳が完全に覆われて、残りのマウスの体を放射線のために露出させます。マウスを照射器に入れて、動物を曝露した後、4〜24時間間隔で分離された放射線の5.5グレイの画分に。各放射線治療の後、麻酔をしたマウスを完全に回復するまで監視と加熱されたマットのケージに入れます。骨を単離するには、70%エタノールでドナーマウスの皮膚を消毒し、リブケージの下に小さな横皮切開を行います。切開の両側で皮膚をしっかりと保持し、頭と足に向かって反対方向に引き裂き、すべての手足から皮膚を剥がします。肩と肘の関節を切り取り、ラボワイプを使用して、付着した筋肉や結合組織を上腕骨から取り除きます。大腿骨と股関節の間の関節を慎重に外します。そして、脚を取り外すために大腿骨の頭に沿ってカットするために鈍いはさみを使用してください。膝関節を切り取り、大腿骨と脛骨を分離する。そして、慎重に骨から取り付けられた筋肉や結合組織を除去するためにラボワイプを使用してください。その後、同じ遺伝子型のマウスから、氷の上に20ミリリットルの氷冷滅菌PBSを含む個々の50ミリリットルの円錐管に骨を引き込みます。バイオセーフティクラス2キャビネットで骨髄細胞を分離するには、18ゲージの針を使用して、滅菌500マイクロチューブの底部に小さな穴を開けます。そして、氷冷滅菌PBSの100マイクロリットルを含む個々の無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにチューブを置きます。すべてのチューブが準備されたら、分離された骨を含むチューブからPBSを取り出し、滅菌100ミリメートル細胞培養皿に骨を移します。細かい鉗子と小さいはさみを使用して、各骨の端部から骨外を慎重に取り除き、各500マイクロリットルチューブに最大6本の骨を入れる。すべての骨が切断されたら、遠心分離によって骨髄細胞を抽出します。すべての骨髄内容物が除去された場合、骨は1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管の底に比較的大きな赤いペレットで白く半透明に見えるはずです。骨髄細胞移植の場合、分離した骨髄細胞を血清フリーRPMI培地で希釈し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を1本の0.5ミリリットルのインスリン注射器に注入して注射する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、各麻酔付きレシピエント動物のレトロな軌道静脈に細胞の全容をゆっくりと注入する。その後、痛みの軽減のために目にプロパラカインの滴を置きます。そして、マウスが監視されている間に意識を取り戻すことを可能にします。ドナー細胞生着に対する3つのBMT予備調整方法の効果を比較する。末梢血および心臓組織におけるドナー細胞の画分を、BMT後1ヶ月でフローサイトメトリーによって分析した。本代表分析では、全身照射を受けたレシピエントマウスの末梢血において、単球、好中球およびB細胞を大部分がアブラ化し、ドナー骨髄由来細胞の子孫に置換された。さらに、常駐する心臓単球および好中球集団は、ドナー由来細胞にほぼ完全に置き換えられた。部分的にシールドされた照射群では、ドナー由来の心臓免疫細胞置換は控えめであった。シールド領域内のレシピエントマウス骨髄細胞は、全身照射を受けたマウスと比較して、末梢血再構成の低レベルに寄与した可能性が高い。BMT予備調整を行わない群では、ドナー由来細胞は、BMT後4週間でレシピエントマウスの末梢血および心臓で検出可能であった。さらに、Tet2欠損ドナー細胞は徐々に徐々に拡大した。それに比べて、野生型ドナー細胞を有するレシピエントマウスは、ドナー細胞のクローン拡張を最小限に抑えた。これらの実験モデルの最適化は、カーディオ代謝疾患や癌などのすべての原因の死亡率に寄与するクローン造図ドライバー遺伝子のより厳格な研究を可能にする。私たちのプロトコルは、研究者がクローン造造を研究し、それが心血管疾患やその他の疾患状態にどのように寄与するかを調査することを望んでいます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

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活性骨髄由来マクロファージとBradyzoite条件におけるトキソプラズマのシスト壁形成

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

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Bone Marrow-derived Macrophage Production

骨髄由来マクロファージの生産

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

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長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

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Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

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As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...