Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health grants til K. Walsh (HL131006, HL138014 og HL132564), til S. Sano (HL152174), American Heart Association grant til M. A. Evans (20POST35210098), og et Japan Heart Foundation-tilskudd til H. Ogawa.

Alle prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia.
1. Før forutsetning
<ol><li>Plasser mottakermusene på antibiotika-supplert vann (5 mM sulfametoksazol, 0,86 mM trimetoprim) ~ 24 timer før bestråling. Dette er nødvendig for å forhindre infeksjon, da immunsystemet vil bli undertrykt etter bestråling, og opprettholdes i 2 uker etter bestråling. På dette tidspunktet, supplere mus med en ernæringsmessig...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

For studier av klonisk hematopoiesis beskrev vi tre metoder for BMT: BMT med total kroppsbestråling, BMT med bestråling med delvis skjerming, og en mindre vanlig BRUKT BMT-metode som ikke innebærer pre-conditioning (adoptiv BMT). Disse metodene har blitt brukt til å vurdere effekten av klonisk hematopoiesis på kardiovaskulær sykdom. Forskere kan endre disse metodene tilsvarende for å passe til det spesifikke formålet med studien.
Clonal hematopoiesis modeller Clonal...

Clonal hematopoiesis (CH) er en tilstand som ofte observeres hos eldre individer og oppstår som følge av en utvidet hematopoietisk stamme og stamcelle (HSPC) klone som bærer en genetisk mutasjon1. Det har blitt antydet at i en alder av 50 år vil de fleste individer ha fått i gjennomsnitt fem eksoniske mutasjoner i hver HSPC2, men de fleste av disse mutasjonene vil resultere i små eller ingen fenotypiske konsekvenser for individet. Men hvis en av disse mutasjonene ved en tilfeldighet gir HSPC et konkurransefortrinn – for eksempel ved å fremme spredning, selvfornyelse, overlevelse eller en kombinasjon av disse – kan dette føre til den foretrukne utvidelsen av mutantklonen i forhold til de andre HSPCene. Som et resultat vil mutasjonen i økende grad spre seg gjennom det hematopoietiske systemet, da den muterte HSPC gir opphav til modne blodlegemer, noe som fører til en tydelig populasjon av muterte celler i perifert blod. Mens mutasjoner i dusinvis av forskjellige kandidatdrivergener har vært forbundet med kloniske hendelser i det hematopoietiske systemet, er mutasjoner i DNA-metyltransferase 3 alfa (DNMT3A) og ti elleve translokasjon 2 (TET2) de mest utbredte3. Flere epidemiologiske studier har funnet at personer som bærer disse genetiske mutasjonene har en betydelig høyere risiko for kardiovaskulær sykdom (CVD), hjerneslag og all-kausaldødelighet 3,4,5,6,7. Selv om disse studiene har identifisert at det finnes en sammenheng mellom CH og økt forekomst av CVD og hjerneslag, vet vi ikke om dette forholdet er årsakssammenheng eller et delt epifenomenon med aldringsprosessen. For å få en bedre forståelse av denne foreningen, er det nødvendig med riktige dyremodeller som riktig rekapitulerer den menneskelige tilstanden til CH.
Flere CH dyremodeller er etablert av vår gruppe og andre ved hjelp av sebrafisk, mus og ikke-menneskelige primater8,9,10,11,12,13,14. Disse modellene bruker ofte hematopoietiske rekonstitueringsmetoder ved transplantasjon av genetisk modifiserte celler, noen ganger ved hjelp av Cre-lox rekombinasjon eller CRISPR-systemet. Denne tilnærmingen gjør det mulig for analyse av en bestemt genmutasjon i hematopoietiske celler å vurdere hvordan det bidrar til sykdomsutvikling. I tillegg bruker disse modellene ofte congenic eller reporterceller for å skille effekten av mutantceller fra normale eller ville celler. I mange tilfeller er det nødvendig med et prekondisjoneringsregime for å lykkes med å engraft donor hematopoietiske stamceller.
For tiden kan transplantasjonen av benmarg til mottakermus deles inn i to hovedkategorier: 1) myeloablativ kondisjonering og 2) ikke-betinget transplantasjon. Myeloablativ kondisjonering kan oppnås ved en av to metoder, nemlig total kroppsbestråling (TBI) eller kjemoterapi15. TBI utføres ved å utsette mottakeren for en dødelig dose gamma- eller røntgenbestråling, generere DNA-pauser eller krysskoblinger i raskt dele celler, noe som gjør dem uopprettelige16. Busulfan og cyklofosfamid er to ofte brukte kjemoterapimedisiner som forstyrrer den hematopoietiske nisjen og på samme måte forårsaker DNA-skade på raskt delte celler. Nettoresultatet av myeloablativ forutsetning er apoptose av hematopoietiske celler, som ødelegger mottakerens hematopoietiske system. Denne strategien tillater ikke bare vellykket engraftment av donor HSPCs, men kan også forhindre graft avvisning ved å undertrykke mottakerens immunsystem. Imidlertid har myeloablativ forutsetning alvorlige bivirkninger som skade på vev og organer og deres bosatte immunceller samt ødeleggelse av den innfødte benmargsnisjen17. Derfor er det foreslått alternative metoder for å overvinne disse uønskede bivirkningene, spesielt med hensyn til skade på organer av interesse. Disse metodene inkluderer skjermet bestråling av mottakermus og adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus9,17. Skjerming av thorax, bukhule, hode eller andre regioner fra bestråling ved plassering av blybarrierer holder vev av interesse beskyttet mot de skadelige effektene av bestråling og opprettholder deres bosatte immuncellepopulasjon. På den annen side har adoptiv BMT av HSPCer til ikke-kondisjonerte mus en ekstra fordel fordi den bevarer den innfødte hematopoietiske nisjen. I dette manuskriptet beskriver vi protokollene og resultatene av HSPC-engraftment etter flere transplantasjonsregimer hos mus, spesielt levering av HSPC til TBI-mus, til mus delvis skjermet fra bestråling og til ikke-kondisjonerte mus. Det overordnede målet er å hjelpe forskere med å forstå de forskjellige fysiologiske effektene av hver metode, samt hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i innstillingen av CH og kardiovaskulær sykdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

Clonal hematopoiesis er en utbredt aldersrelatert tilstand som skyldes akkumulering av somatiske mutasjoner i hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Mutasjoner i førergener, som gir cellulær kondisjon, kan føre til utvikling av ekspanderende HSPC-kloner som i økende grad gir opphav til avkom leukocytter som skjuler den somatiske mutasjonen. Fordi klonisk hematopoiesis har vært assosiert med hjertesykdom, hjerneslag og dødelighet, er utviklingen av eksperimentelle systemer som modellerer disse prosessene nøkkelen til å forstå mekanismene som under denne nye risikofaktoren. Benmargstransplantasjonsprosedyrer som involverer myeloablativ kondisjonering hos mus, som total kroppsbestråling (TBI), brukes ofte til å studere immuncellenes rolle i kardiovaskulære sykdommer. Imidlertid er samtidig skade på benmargsnisjen og andre steder av interesse, som hjerte og hjerne, uunngåelig med disse prosedyrene. Dermed har laboratoriet vårt utviklet to alternative metoder for å minimere eller unngå mulige bivirkninger forårsaket av TBI: 1) benmargstransplantasjon med bestrålingsskjerming og 2) adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus. I skjermede organer bevares det lokale miljøet slik at analysen av klonnal hematopoiesis mens funksjonen til bosatte immunceller er uforstyrret. I motsetning har adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus den ekstra fordelen at både de lokale miljøene i organene og den hematopoietiske nisjen bevares. Her sammenligner vi tre forskjellige hematopoietiske cellerekonstitueringsmetoder og diskuterer deres styrker og begrensninger for studier av klonnal hematopoiesis ved kardiovaskulær sykdom.

For å sammenligne effekten av tre BMT/prekondisjoneringsmetoder på donorcelle-engraftment, ble fraksjonene av donorceller i perifert blod og hjertevev analysert ved strømningscytometri ved 1 måned etter BMT. Isolerte celler ble farget for spesifikke leukocyttmarkører for å identifisere de forskjellige undergruppene av leukocytter. I disse eksperimentene ble wild-type (WT) C57BL/6 (CD45.2) donorbenmargceller levert til WT B6. SJL-PtprcaPrpcb...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Vi beskriver tre metoder for benmargstransplantasjon (BMT): BMT med total kroppsbestråling, BMT med skjermet bestråling og BMT-metode uten prekondisjonering (adoptiv BMT) for studiet av klone hematopoiesis i musemodeller.

Benmargstransplantasjonsprosedyrer hos mus for å studere klonisk hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Vår protokoll vil hjelpe forskere med å forstå de fysiologiske effektene av tre forskjellige benmargstransplantasjonsmetoder og hvordan de påvirker eksperimentelle utfall i klonisk hematopoiesis-setting. Total kroppsstråling benmargstransplantasjon kan påvirke kardiovaskulære organer negativt og endre sykdomspatogenese. Dermed har laboratoriet vårt utviklet to alternative metoder for å minimere eller unngå mulige bivirkninger.Å demonstrere prosedyrene vil være Eunbee Park en avgangsstudent, og Megan Evans en postdoktor, både fra laboratoriet mitt For thorax og mageskjerming, plasser den justerbare skuffen og røntgenbestråleren på riktig avstand for å oppnå jevn bestråling. Og plasser de bedøvede musene på en flat ledet plate invertert til hverandre i liggende stilling. Fest potene til platen med tape, og plasser den ledede skjermingen slik at den nedre enden stemmer overens med xiphisternum-beinet og den øvre enden av blyskjoldet sitter i nærheten av tymusen.Etter skjerming, plasser musene i bestråleren og utsett dyrene for to, 5,5 grå brøkdeler av bestråling skilt med et fire til 24 timers intervall. For hodeskjerming, tape forsiktig musens fire poter til magen. Plasser musen i en konisk restrainer og skyv holderen inn i sporet i blyskjoldet slik at musens hode og ører er helt dekket, slik at resten av musens kropp blir utsatt for stråling.Etter skjerming plasser musene i bestråleren og utsett dyrene for, til 5,5 grå brøkdeler av en stråling skilt med et fire til 24 timers intervall. Etter hver strålebehandling plasserer du de bedøvede musene i et bur på en oppvarmet matte med overvåking til de er fullstendig gjenopprettet. For å isolere beinene, desinfiser huden på donormusen med 70% etanol og gjør et lite tverrgående hudinnsnitt under ribbeburet.Hold huden tett på hver side av snittet, rive i motsatte retninger mot hodet og føttene og skrell huden fra alle lemmer. Klipp over skuldrene og albue leddene, og bruk en lab tørk for å fjerne de vedlagte musklene og bindevev fra humeri. Disloker leddene forsiktig mellom lårbenet og hoftebenene.Og bruk stump saks for å kutte langs lårhodene for å løsne bena. Klipp over kneleddet, for å skille lårbenet og tibia. Og bruk laboratorieservietter for å forsiktig fjerne de vedlagte musklene og bindevevene fra beinene.Trekk deretter beinene fra mus av samme genotype inn i individuelle 50 milliliter koniske rør som inneholder 20 milliliter iskald steril PBS på is. For å isolere benmargscellene i et biosikkerhetsklasse to skap, bruk en 18 gauge nål for å lage et lite hull i bunnen av et sterilt 500 mikroliter mikrorør. Og legg røret i et individuelt sterilt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder 100 mikroliter iskald steril PBS.Når alle rørene er forberedt, fjern PBS fra røret som inneholder de isolerte beinene og overfør beinene til en steril 100 millimeter cellekulturrett. Bruk fine tang og liten saks for å forsiktig fjerne epifysen fra endene av hvert bein, og legg opptil seks bein i hvert 500 mikroliterrør. Når alle beinene er kuttet, trekk ut benmargscellene ved sentrifugering.Hvis alt marginnholdet er fjernet, skal beinene virke hvite og gjennomsiktige med en relativt stor rød pellet på bunnen av 1,5 milliliter mikro sentrifugerøret. For benmargscelletransplantasjon, fortynn de isolerte benmargscellene i serumfrie RPMI-medier, og last 200 mikroliter av celleopphenget i en 0,5 milliliter insulinsprøyte per mus som skal injiseres. Etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks, injiser sakte hele volumet av celler i den retro orbitale venen til hvert bedøvet mottakerdyr.Legg deretter en dråpe proparakain på øyet for smertelindring. Og la musen gjenvinne bevisstheten mens den overvåkes. For å sammenligne effekten av tre BMT forutsetningsmetoder på donorcelle engraftment.Fraksjonene av donorceller i perifert blod og hjertevev ble analysert ved strømningscytometri etter en måned etter BMT. I denne representative analysen ble i perifert blod av mottakermus som fikk total kroppsbestråling, monocytter, nøytrofiler og B-celler i stor grad ablated og erstattet av avkom av donorbenmargsavledede celler. I tillegg ble den bosatte mottakerens hjertemonocytt- og nøytrofilpopulasjoner nesten fullstendig erstattet av donoravledede celler.I den delvis skjermede bestrålingsgruppen var donoravledede hjerteimmuncelleerstatning beskjeden. Mottakerens musebenmargsceller i de skjermede områdene bidro sannsynligvis til lavere nivå av perifer blodrekonstituering sammenlignet med mus som fikk total kroppsbestråling. I gruppen uten BMT-forutsetninger var donoravledede celler påvisbare i perifert blod og hjerter til mottakermus etter fire uker etter BMT.I tillegg utvidet Tet2 mangelfulle donorceller gradvis over tid. Til sammenligning viste mottakermus som var sammenflettet med donorceller av vill type minimal clonal utvidelse av donorceller. De optimering av disse eksperimentelle modellene vil muliggjøre strengere studier av kloniske hematopoiesis drivergener som bidrar til all årsaksdødelighet som kardio-metabolsk sykdom og kreft.Vi håper at våre protokoller vil tillate forskere å studere klone hematopoiesis for å undersøke hvordan det bidrar til kardiovaskulær sykdom og andre sykdomstilstander.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Undersøkelse av Macrophage Polarisering Bruk Bone Marrow makrofager som stammer

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantasjon av Tail Skin Study Cell Responses Allogen CD4 T i Mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Sporing Mouse Bone Marrow Monocytter<em&gt; I Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection og benmarg Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduksjon av stamceller i benmarg for å generere T-celle reseptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...