Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Saúde dos EUA a K. Walsh (HL131006, HL138014 e HL132564), à S. Sano (HL152174), subvenção da American Heart Association a M. A. Evans (20POST35210098), e uma bolsa da Japan Heart Foundation para H. Ogawa.

Todos os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.
1. Antes do pré-condicionamento
<ol><li>Coloque os camundongos receptores em água suplementada com antibióticos (5 mM sulfametoxazol, 0,86 mM trimeoprim) ~24 h antes da irradiação. Isso é necessário para prevenir a infecção, pois o sistema imunológico será suprimido após a irradiação, e mantido por 2 semanas após a ir...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Para estudos de hematopoiese clonal, descrevemos três métodos de BMT: BMT com irradiação total do corpo, BMT com irradiação com blindagem parcial, e um método de BMT menos comumente utilizado que não envolve pré-condicionamento (BMT adotivo). Esses métodos têm sido utilizados para avaliar o impacto da hematopoiese clonal em doenças cardiovasculares. Os pesquisadores podem modificar esses métodos de acordo para se adequarem ao propósito específico de seu estudo.
Modelos d...

A hematopoiese clonal (CH) é uma condição que é frequentemente observada em idosos e ocorre como resultado de um clone de célula hematopoiética e progenitora expandida (HSPC) portador de uma mutação genética1. Foi sugerido que, aos 50 anos, a maioria dos indivíduos terá adquirido uma média de cinco mutações exônicas em cada HSPC2,mas a maioria dessas mutações resultará em pequenas ou nenhuma consequências fenotípicas para o indivíduo. No entanto, se por acaso uma dessas mutações confere uma vantagem competitiva ao HSPC — como promover sua proliferação, auto-renovação, sobrevivência ou alguma combinação delas — isso pode levar à expansão preferencial do clone mutante em relação aos outros HSPCs. Como resultado, a mutação se espalhará cada vez mais pelo sistema hematopoiético à medida que o HSPC mutado dá origem a células sanguíneas maduras, levando a uma população distinta de células mutantes dentro do sangue periférico. Enquanto mutações em dezenas de diferentes genes de driver candidatos têm sido associadas a eventos clonais dentro do sistema hematopoiético, entre eles, mutações no DNA metiltransferase 3 alfa(DNMT3A) e dez onze translocação 2(TET2) são as mais prevalentes3. Vários estudos epidemiológicos descobriram que indivíduos que carregam essas mutações genéticas têm um risco significativamente maior de doenças cardiovasculares (DCV), acidente vascular cerebral e mortalidade causal3,4,5,6,7. Embora esses estudos tenham identificado que existe associação entre ACS e aumento da incidência de DCV e AVC, não sabemos se essa relação é causal ou um epifenômeno compartilhado com o processo de envelhecimento. Para obter uma melhor compreensão dessa associação, são necessários modelos animais adequados que recapitulem corretamente a condição humana do ACS.
Vários modelos de animais CH foram estabelecidos pelo nosso grupo e outros usando zebrafish, camundongos e primatas não humanos8,9,10,11,12,13,14. Esses modelos frequentemente usam métodos de reconstituição hematopoiética por meio do transplante de células geneticamente modificadas, às vezes usando recombinação cre-lox ou o sistema CRISPR. Essa abordagem permite a análise de uma mutação genética específica em células hematopoiéticas para avaliar como ela contribui para o desenvolvimento da doença. Além disso, esses modelos geralmente empregam células congênicas ou repórteres para distinguir os efeitos das células mutantes de células normais ou do tipo selvagem. Em muitos casos, um regime pré-condicionado é necessário para engrafar com sucesso células-tronco hematopoiéticas doadoras.
Atualmente, o transplante de medula óssea para camundongos receptores pode ser dividido em duas categorias principais: 1) condicionamento mieleloblativo e 2) transplante não condicionado. O condicionamento mieloblativo pode ser alcançado por um dos dois métodos, a ver: irradiação corporal total (TCE) ou quimioterapia15. O TBI é realizado submetendo o receptor a uma dose letal de irradiação gama ou raios-X, gerando quebras de DNA ou cruzamentos dentro de células rapidamente divididas, tornando-as irreparáveis16. Busulfan e ciclofosfameda são duas drogas quimioterapias comumente usadas que interrompem o nicho hematopoiético e causam danos ao DNA para células rapidamente divididas. O resultado líquido do pré-condicionamento mieloblativo é apoptose das células hematopoiéticas, que destrói o sistema hematopoiético do receptor. Essa estratégia não só permite o enxerto bem-sucedido dos HSPCs doadores, mas também pode evitar a rejeição do enxerto suprimindo o sistema imunológico do receptor. No entanto, o pré-condicionamento mieloblativo tem efeitos colaterais graves, como danos a tecidos e órgãos e suas células imunes residentes, bem como destruição do nicho de medula óssea nativo17. Por conseguinte, foram propostos métodos alternativos para superar esses efeitos colaterais indesejáveis, particularmente no que diz respeito aos danos aos órgãos de interesse. Esses métodos incluem a irradiação blindada de camundongos receptores e o BMT adotivo para camundongos não condicionados9,17. Proteger o tórax, a cavidade abdominal, a cabeça ou outras regiões da irradiação pela colocação de barreiras de chumbo mantém os tecidos de interesse protegidos dos efeitos nocivos da irradiação e mantém sua população de células imunes residentes. Por outro lado, o BMT adotivo de HSPCs para camundongos não condicionados tem uma vantagem adicional porque preserva o nicho hematopoiético nativo. Neste manuscrito, descrevemos os protocolos e resultados do enxerto de HSPC após vários regimes de transplante em camundongos, especificamente a entrega de HSPC a camundongos TBI, a camundongos parcialmente protegidos da irradiação e a ratos não condicionados. O objetivo geral é ajudar os pesquisadores a entender os diferentes efeitos fisiológicos de cada método, bem como como eles afetam os desfechos experimentais no cenário de ACS e doenças cardiovasculares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

A hematopoiese clonal é uma condição predominante associada à idade que resulta do acúmulo de mutações somáticas em células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Mutações nos genes do driver, que conferem aptidão celular, podem levar ao desenvolvimento da expansão de clones HSPC que cada vez mais dão origem a leucócitos progêneros que abrigam a mutação somática. Como a hematopoiese clonal tem sido associada a doenças cardíacas, acidente vascular cerebral e mortalidade, o desenvolvimento de sistemas experimentais que modelam esses processos é fundamental para entender os mecanismos que fundamentam esse novo fator de risco. Procedimentos de transplante de medula óssea envolvendo condicionamento mieloablativo em camundongos, como a irradiação total do corpo (TCE), são comumente empregados para estudar o papel das células imunes em doenças cardiovasculares. No entanto, danos simultâneos ao nicho da medula óssea e outros locais de interesse, como o coração e o cérebro, são inevitáveis com esses procedimentos. Assim, nosso laboratório desenvolveu dois métodos alternativos para minimizar ou evitar possíveis efeitos colaterais causados pelo TCE: 1) transplante de medula óssea com blindagem de irradiação e 2) TMO adotivo para camundongos não condicionados. Em órgãos blindados, o ambiente local é preservado permitindo a análise de hematopoiese clonal enquanto a função das células imunes residentes não é perturbada. Em contrapartida, o BMT adotivo para camundongos não condicionados tem a vantagem adicional de que tanto os ambientes locais dos órgãos quanto o nicho hematopoiético sejam preservados. Aqui, comparamos três diferentes abordagens de reconstituição de células hematopoiéticas e discutimos suas forças e limitações para estudos de hematopoiese clonal em doenças cardiovasculares.

Para comparar o efeito de três métodos de TMO/pré-condicionamento no enxerto celular doador, as frações de células doadoras no sangue e tecido cardíaco periféricos foram analisadas por citometria de fluxo em 1 mês após o TMO. Células isoladas foram manchadas por marcadores leucócitos específicos para identificar os diferentes subconjuntos de leucócitos. Nestes experimentos, foram entregues células de medula óssea do tipo selvagem(WT) C57BL/6 (CD45.2) ao WT B6. SJL-Ptprc...

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Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Descrevemos três métodos de transplante de medula óssea (TMO): TMO com irradiação total do corpo, TMO com irradiação blindada e método de TMO sem pré-condicionamento (TMO adotivo) para o estudo da hematopoiese clonal em modelos de camundongos.

Procedimentos de transplante de medula óssea em camundongos para estudar hematopoiese clonal

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Nosso protocolo ajudará os pesquisadores a entender os efeitos fisiológicos de três diferentes métodos de transplante de medula óssea e como eles afetam os resultados experimentais na configuração da hematopoiese clonal. O transplante total de radiação corporal de medula óssea pode impactar negativamente órgãos cardiovasculares e alterar a patogênese da doença. Assim, nosso laboratório desenvolveu dois métodos alternativos para minimizar ou evitar possíveis efeitos colaterais.Demonstrando os procedimentos estarão Eunbee Park uma estudante de pós-graduação, e Megan Evans uma bolsista de pós-doutorado, tanto do meu laboratório para blindagem do tórax e abdômen, coloque a bandeja ajustável e o irradiador de raios-X na distância correta para alcançar a irradiação uniforme. E coloquem os ratos anestesiados em uma placa de led plana invertida umas com as outras na posição supina. Fixar as patas na placa com fita adesiva, e coloque a blindagem de led para que a extremidade inferior se alinhe com o osso xiphisternum e a extremidade superior do escudo de chumbo fique perto do timo.Após a blindagem, coloque os camundongos no irradiador e exponha os animais a duas frações cinzentas de irradiação separadas por um intervalo de quatro a 24 horas. Para blindagem da cabeça, corte cuidadosamente as quatro patas do rato no abdômen. Coloque o mouse em um contidor cônico e deslize o conterrâneo para dentro do slot dentro do escudo de chumbo para que a cabeça e as orelhas do mouse estejam completamente cobertas, deixando o resto do corpo do rato exposto para uma radiação.Após a blindagem, coloque os ratos no irradiador e exponha os animais a, a 5,5 frações cinzas de uma radiação separada por um intervalo de quatro a 24 horas. Após cada tratamento de radiação, coloque os camundongos anestesiados em uma gaiola em um tapete aquecido com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Para isolar os ossos, desinfetar a pele do rato doador com 70% de etanol e fazer uma pequena incisão transversal da pele abaixo da caixa torácica.Segurando a pele firmemente em ambos os lados da incisão, rasgue em direções opostas em direção à cabeça e aos pés e retire a pele de todos os membros. Corte sobre os ombros e articulações do cotovelo, e use uma limpeza de laboratório para remover os músculos ligados e tecidos conjuntivos do úmero. Desloque cuidadosamente as articulações entre os ossos do fêmur e do quadril.E use uma tesoura sem cortes para cortar ao longo das cabeças femorais para desprender as pernas. Corte sobre a articulação do joelho, para separar o fêmur e a tíbia. E use lenços de laboratório para remover cuidadosamente os músculos ligados e tecidos conjuntivos dos ossos.Em seguida, puxe os ossos de camundongos do mesmo genótipo em tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS estéreis gelados no gelo. Para isolar as células da medula óssea em um armário de classe de biosegurança dois, use uma agulha de calibre 18 para fazer um pequeno buraco na parte inferior de um micro tubo estéril de 500 microliter. E coloque o tubo em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros estéril individual contendo 100 microliters de PBS estéril gelado.Quando todos os tubos tiverem sido preparados, remova o PBS do tubo contendo os ossos isolados e transfira os ossos para um prato de cultura celular estéril de 100 milímetros. Use fórceps finos e pequenas tesouras para remover cuidadosamente a epífise das extremidades de cada osso, e coloque até seis ossos em cada tubo de 500 microliter. Quando todos os ossos tiverem sido cortados, extraia as células da medula óssea por centrifugação.Se todo o conteúdo da medula tiver sido removido, os ossos devem parecer brancos e translúcidos com uma pelota vermelha relativamente grande na parte inferior do tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Para transplante de células de medula óssea, diluir as células isoladas de medula óssea em mídia RPMI livre de soro, e carregar 200 microliters da suspensão celular em uma seringa de insulina de 0,5 mililitro por rato a ser injetado. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, injete lentamente todo o volume de células na veia orbital retrô de cada animal receptor anestesiado.Em seguida, coloque uma gota de proparacaína no olho para alívio da dor. E permitir que o rato recupere a consciência enquanto é monitorado. Para comparar o efeito de três métodos de pré-condicionamento de BMT no enxerto celular doador.As frações de células doadoras no sangue periférico e tecido cardíaco foram analisadas por citometria de fluxo em um mês após o TMO. Nesta análise representativa, no sangue periférico de camundongos receptores que receberam irradiação corporal total, monócitos, neutrófilos e células B foram largamente ablados e substituídos pela prole das células derivadas da medula óssea doadoras. Além disso, as populações de moncito cardíaco e neutrófilo receptores residentes foram quase completamente substituídas por células derivadas de doadores.No grupo de irradiação parcialmente blindado, a substituição de células imunes cardíacas derivadas do doador foi modesta. As células de medula óssea do camundongo receptor dentro das regiões protegidas provavelmente contribuíram para o menor nível de reconstituição do sangue periférico em comparação com camundongos que receberam irradiação corporal total. No grupo sem pré-condicionamento de BMT, as células derivadas de doadores foram detectáveis no sangue periférico e nos corações dos camundongos receptores a quatro semanas após o BMT.Além disso, as células doadoras deficientes do Tet2 expandiram-se gradualmente ao longo do tempo. Em comparação, camundongos receptores engrafados com células doadoras do tipo selvagem apresentaram expansão clonal mínima de células doadoras. A otimização desses modelos experimentais permitirá estudos mais rigorosos dos genes condutores de hematopoiese clonal que contribuem para todas as causas de mortalidade, como doença cardio-metabólica e câncer.Esperamos que nossos protocolos permitam aos pesquisadores estudar hematopoiese clonal para investigar como ela contribui para doenças cardiovasculares e outros estados de doenças.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Imunologia e Infecção

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...