Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США К. Уолшу (HL131006, HL138014 и HL132564), С. Сано (HL152174), грантом Американской кардиологической ассоциации М. А. Эвансу (20POST35210098) и грантом Японского фонда сердца Х. Огава.

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Вирджинии.
1. Перед предварительным кондиционированием
<ol><li>Поместите мышей-реципиентов на воду, дополненную антибиотиками (5 мМ ...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Для исследований клонального кроветворения мы описали три метода ТКМ: ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с облучением с частичным экранированием и менее часто используемый метод ТКМ, который не включает предварительное кондиционирование (адмтивное ТКМ). Эти методы были использованы для ...

Клональное кроветворение (CH) - это состояние, которое часто наблюдается у пожилых людей и возникает в результате расширенного клона гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC), несущего генетическую мутацию1. Было высказано предположение, что к 50 годам большинство людей приобретут в среднем пять экзонических мутаций в каждом HSPC2,но большинство из этих мутаций приведут к небольшим фенотипическим последствиям для человека или вообще не приведут к ним. Однако, если случайно одна из этих мутаций дает конкурентное преимущество HSPC, например, способствуя его распространению, самообновлению, выживанию или некоторой комбинации из них, это может привести к предпочтительному расширению мутантного клона по сравнению с другими HSPC. В результате мутация будет все больше распространяться через кроветворную систему, поскольку мутированный HSPC дает начало зрелым клеткам крови, что приводит к отчетливой популяции мутировавших клеток в периферической крови. В то время как мутации в десятках различных генов-драйверов-кандидатов были связаны с клональными событиями в кроветворной системе, среди них мутации в ДНК-метилтрансферазе 3 альфа(DNMT3A)и десяти одиннадцати транслокации 2(TET2)являются наиболее распространенными3. Несколько эпидемиологических исследований показали, что лица, которые несут эти генетические мутации, имеют значительно более высокий риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), инсульта и всей причинной смертности3,4,5,6,7. Хотя эти исследования выявили, что существует связь между СН и повышенной частотой сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта, мы не знаем, является ли эта связь причинно-следственной или общей эпифеноменом с процессом старения. Чтобы лучше понять эту ассоциацию, требуются надлежащие животные модели, которые правильно резюмируют состояние СН человека.
Несколько моделей животных CH были установлены нашей группой и другими с использованием рыбок данио, мышей и нечеловеческих приматов8,9,10, 11,12,13,14. Эти модели часто используют методы восстановления кроветворения путем трансплантации генетически модифицированных клеток, иногда с использованием рекомбинации Cre-lox или системы CRISPR. Этот подход позволяет проанализировать специфическую мутацию гена в кроветворных клетках, чтобы оценить, как она способствует развитию заболевания. Кроме того, эти модели часто используют конгенные или репортерные клетки, чтобы отличить эффекты мутантных клеток от нормальных или диких клеток. Во многих случаях требуется режим предварительного кондиционирования для успешного приживирования донорских гемопоэтических стволовых клеток.
В настоящее время трансплантацию костного мозга мышам-реципиенцистам можно разделить на две основные категории: 1) миелоаблативное кондиционирование и 2) неусловная трансплантация. Миелоаблативное кондиционирование может быть достигнуто одним из двух методов, а именно, общим облучением тела (ЧМТ) или химиотерапией15. ЧМТ проводят путем подвергания реципиента смертельной дозе гамма- или рентгеновского облучения, генерирующего разрывы ДНК или поперечные связи внутри быстро делящихся клеток, делая их непоправимыми16. Бусульфан и циклофосфамид являются двумя широко используемыми химиотерапевтическими препаратами, которые нарушают кроветворную нишу и аналогичным образом вызывают повреждение ДНК быстро делящихся клеток. Конечным результатом миелоаблативного прекондиционирования является апоптоз кроветворных клеток, который разрушает кроветворную систему реципиента. Эта стратегия не только позволяет успешно приживить донорские HSPC, но также может предотвратить отторжение трансплантата путем подавления иммунной системы реципиента. Тем не менее, миелоаблативная прекондиционирование имеет серьезные побочные эффекты, такие как повреждение тканей и органов и их резидентных иммунных клеток, а также разрушение родной ниши костного мозга17. Поэтому были предложены альтернативные методы преодоления этих нежелательных побочных эффектов, особенно в отношении повреждения органов, представляющих интерес. Эти методы включают экранированное облучение мышей-реципиентов и приемную ТКМ для неусловленных мышей9,17. Защита грудной клетки, брюшной полости, головы или других областей от облучения путем размещения свинцовых барьеров защищает интересующие ткани от повреждающего воздействия облучения и поддерживает их резидентную популяцию иммунных клеток. С другой стороны, приемная ТКМ HSPC для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, поскольку она сохраняет нативную кроветворную нишу. В этой рукописи мы описываем протоколы и результаты приживления HSPC после нескольких схем трансплантации у мышей, в частности доставки HSPC мышам ЧМТ, мышам, частично защищенным от облучения, и неусловным мышам. Общая цель состоит в том, чтобы помочь исследователям понять различные физиологические эффекты каждого метода, а также то, как они влияют на экспериментальные результаты в условиях СН и сердечно-сосудистых заболеваний.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

Клональный кроветворение является распространенным возрастным состоянием, которое является результатом накопления соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (HSPC). Мутации в генах-драйверах, которые придают клеточную пригодность, могут привести к развитию расширяющихся клонов HSPC, которые все чаще приводят к появлению лейкоцитов потомства, скрывающих соматическую мутацию. Поскольку клональное кроветворение было связано с сердечными заболеваниями, инсультом и смертностью, разработка экспериментальных систем, моделируемых эти процессы, является ключом к пониманию механизмов, лежащих в основе этого нового фактора риска. Процедуры трансплантации костного мозга, включающие миелоаблативное кондиционирование у мышей, такие как облучение всего тела (ЧМТ), обычно используются для изучения роли иммунных клеток в сердечно-сосудистых заболеваниях. Тем не менее, одновременное повреждение ниши костного мозга и других интересных мест, таких как сердце и мозг, неизбежно при этих процедурах. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы свести к минимуму или избежать возможных побочных эффектов, вызванных ЧМТ: 1) трансплантация костного мозга с экранированием облучения и 2) приемная ТКМ неусловным мышам. В экранированных органах сохраняется местная среда, позволяющая проводить анализ клонального кроветворения, в то время как функция резидентных иммунных клеток невозмутима. Напротив, приемная ТКМ для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, за которое сохраняются как местные среды органов, так и кроветворная ниша. Здесь мы сравним три различных подхода к восстановлению кроветворных клеток и обсудим их сильные и слабые стороны для исследований клонального кроветворения при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Чтобы сравнить влияние трех методов ТКМ/предварительного кондиционирования на приживение донорских клеток, фракции донорских клеток в периферической крови и сердечной ткани были проанализированы методом проточной цитометрии через 1 месяц после ТКМ. Изолированные клетки окрашивали ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Описаны три метода трансплантации костного мозга (ТКМ): ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с экранированной облучающей и метод ТКМ без предварительного кондиционирования (адютивная ТКМ) для изучения клонального кроветворения на мышиных моделях.

Процедуры трансплантации костного мозга у мышей для изучения клонального кроветворения

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Наш протокол поможет исследователям понять физиологические эффекты трех различных методов трансплантации костного мозга и то, как они влияют на экспериментальные результаты в условиях клонального кроветворения. Трансплантация костного мозга в целом может негативно повлиять на сердечно-сосудистые органы и изменить патогенез заболевания. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы минимизировать или избежать возможных побочных эффектов.Демонстрировать процедуры будет Ынби Парк, аспирант, и Меган Эванс, постдокторант, оба из моей лаборатории Для защиты грудной клетки и брюшной полости поместите регулируемый лоток и рентгеновский облучатель на правильное расстояние для достижения равномерного облучения. И поместите обезболенные мыши на плоскую светодиодную пластину, перевернутую друг к другу в лежачем положении. Закрепите лапы на пластине скотчем и поместите светодиодное экранирование так, чтобы нижний конец выровнявался с костью xiphisternum, а верхний конец свинцового щита сидел рядом с тимусом.После экранирования поместите мышей в облучатель и подвергайте животных двум 5,5 серым фракциям облучения, разделенным интервалом от четырех до 24 часов. Для защиты головы осторожно приклейте четыре лапы мыши к брюшку. Поместите мышь в конический ограничитель и сдвиньте ограничителя в прорезь внутри свинцового щита, чтобы голова и уши мыши были полностью закрыты, оставив остальную часть тела мыши подверженной воздействию радиации.После экранирования поместите мышей в облучатель и подвергайте животных воздействию 5,5 серых фракций излучения, разделенных интервалом от четырех до 24 часов. После каждой лучевой терапии помещайте обезболиваемых мышей в клетку на нагретый коврик с контролем до полного выздоровления. Чтобы изолировать кости, продезинфицируйте кожу мыши-донора 70% этанолом и сделайте небольшой поперечный разрез кожи ниже грудной клетки.Крепко держа кожу по обе стороны разреза, разрывайте в противоположных направлениях к голове и ногам и отшелушивайте кожу со всех конечностей. Разрезайте плечи и локтевые суставы и используйте лабораторную салфетку, чтобы удалить прикрепленные мышцы и соединительные ткани из плечевой кости. Осторожно вывихивают суставы между бедренной и бедренной костями.И используйте тупые ножницы, чтобы разрезать вдоль головок бедренной кости, чтобы отсоедать ноги. Разрезать коленный сустав, отделить бедренную и большеберцовую кости. И используйте лабораторные салфетки, чтобы аккуратно удалить прикрепленные мышцы и соединительные ткани из костей.Затем вытяните кости мышей того же генотипа в отдельные 50-миллилитровые конические трубки, содержащие 20 миллилитров ледяного стерильного PBS на льду. Чтобы изолировать клетки костного мозга в шкафу класса биобезопасности два, используйте иглу 18 калибра, чтобы сделать небольшое отверстие в нижней части стерильной микротрубки 500 микролитров. И поместите трубку в индивидуальную стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 100 микролитров ледяного холодного стерильного PBS.Когда все трубки будут подготовлены, извлеките PBS из трубки, содержащей изолированные кости, и перенесите кости на стерильную 100-миллиметровую чашку для культивируемых клеток. Используйте тонкие щипцы и небольшие ножницы, чтобы аккуратно удалить эпифиз с концов каждой кости, и поместите до шести костей в каждую трубку размером 500 микролитров. Когда все кости будут разрезаны, извлеките клетки костного мозга путем центрифугирования.Если все содержимое костного мозга было удалено, кости должны казаться белыми и полупрозрачными с относительно большой красной гранулой на дне 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубки. Для трансплантации клеток костного мозга разбавьте изолированные клетки костного мозга в свободной от сыворотки среде RPMI и загрузите 200 микролитров клеточной суспензии в один шприц инсулина 0,5 миллилитра на одну инъекцию мыши. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс медленно вводят весь объем клеток в ретроорбитальную вену каждого анестезированного животного-реципиента.Затем поместите каплю пропаракаина на глаз для облегчения боли. И позвольте мыши прийти в сознание во время наблюдения. Сравнить влияние трех методов предварительного кондиционирования ТКМ на приживление донорских клеток.Фракции донорских клеток в периферической крови и сердечной ткани анализировали с помощью проточной цитометрии через месяц после ТКМ. В этом репрезентативном анализе в периферической крови мышей-реципиентов, получающих общее облучение тела, моноциты, нейтрофилы и В-клетки были в значительной степени абляции и заменены потомство донорских клеток, полученных из костного мозга. Кроме того, популяции сердечных моноцитов и нейтрофилов были почти полностью заменены клетками донорского происхождения.В группе частично экранированного облучения замена сердечных иммунных клеток донорского происхождения была скромной. Клетки костного мозга мыши-реципиента в экранированных областях, вероятно, способствовали более низкому уровню восстановления периферической крови по сравнению с мышами, которые получали общее облучение тела. В группе без предварительного кондиционирования ТКМ донорские клетки были обнаружены в периферической крови и сердцах мышей-реципиентов через четыре недели после ТКМ.Кроме того, дефицитные донорские клетки Tet2 постепенно расширялись с течением времени. Для сравнения, мыши-реципиенты, привитые донорскими клетками дикого типа, показали минимальное клональное расширение донорских клеток. Их оптимизация этих экспериментальных моделей позволит более тщательно истолковать гены-драйверы клонального кроветворения, которые способствуют смертности от всех причин, таких как кардио-метаболические заболевания и рак.Мы надеемся, что наши протоколы позволят исследователям изучать клональный кроветворение, чтобы исследовать, как он способствует сердечно-сосудистым заболеваниям и другим болезненным состояниям.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma Киста гондий стены Образование в Активированный костномозгового происхождения Макрофаги и Bradyzoite условия

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Костного мозга, полученных макрофагов производства

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Долгосрочная Хронический<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Дыхательных инфекции у мышей

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Отслеживание костного мозга мышей моноцитов<em&gt; В Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Ретровирусное Трансдукция костного мозга клеток-предшественников для генерации Т-клеточного рецептора Retrogenic Мыши

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...