Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos a K. Walsh (HL131006, HL138014 y HL132564), a S. Sano (HL152174), la subvención de la Asociación Americana del Corazón a M. A. Evans (20POST35210098) y una subvención de la Japan Heart Foundation a H. Ogawa.

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.
1. Antes del preacondicionamiento
<ol><li>Coloque los ratones receptores en agua suplementada con antibióticos (5 mM de sulfametoxazol, 0,86 mM de trimetoprima) ~ 24 h antes de la irradiación. Esto es necesario para prevenir la infección, ya que el sistema inmunológico se suprimirá después de la irradiación y se ma...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Para los estudios de la hematopoyesis clónica, describimos tres métodos de BMT: BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación con el blindaje parcial, y un método menos de uso general de BMT que no implique ningún pre-condicionamiento (BMT adoptivo). Estos métodos se han utilizado para evaluar el impacto de la hematopoyesis clónica en la enfermedad cardiovascular. Los investigadores pueden modificar estos métodos en consecuencia para adaptarse al propósito específico de su estudio.
<p cla...

La hematopoyesis clonal (CH) es una condición que se observa con frecuencia en individuos mayores y ocurre como resultado de un clon expandido de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) portador de una mutación genética1. Se ha sugerido que a la edad de 50 años, la mayoría de los individuos habrán adquirido un promedio de cinco mutaciones exónicas en cada HSPC2,pero la mayoría de estas mutaciones resultarán en pocas o ninguna consecuencia fenotípica para el individuo. Sin embargo, si por casualidad una de estas mutaciones confiere una ventaja competitiva al HSPC, por ejemplo, promoviendo su proliferación, auto-renovación, supervivencia o alguna combinación de estos, esto puede conducir a la expansión preferencial del clon mutante en relación con los otros HSPCs. Como consecuencia, la mutación se extenderá cada vez más a través del sistema hematopoyético mientras que el HSPC transformado da lugar a las células de sangre maduras, llevando a una población distinta de células transformadas dentro de la sangre periférica. Mientras que las mutaciones en docenas de genes conductores candidatos diferentes se han asociado con eventos clonales dentro del sistema hematopoyético, entre estos, las mutaciones en el ADN metiltransferasa 3 alfa(DNMT3A)y diez once translocaciones 2(TET2)son las más prevalentes3. Varios estudios epidemiológicos han encontrado que los individuos que llevan estas mutaciones genéticas tienen un riesgo perceptiblemente más alto de la enfermedad cardiovascular (CVD), del movimiento, y de la mortalidad todo-causal3,4,5,6,7. Mientras que estos estudios han identificado que existe una asociación entre el CH y la incidencia creciente del CVD y del movimiento, no sabemos si esta relación es causal o un epiphenomenon compartido con el proceso del envejecimiento. Para obtener una mejor comprensión de esta asociación, se requieren modelos animales adecuados que recapitulan correctamente la condición humana del CH.
Varios modelos animales ch han sido establecidos por nuestro grupo y otros utilizando pez cebra, ratones y primates no humanos8,9,10,11,12,13,14. Estos modelos a menudo utilizan métodos de reconstitución hematopoyética mediante trasplante de células modificadas genéticamente, a veces utilizando la recombinación Cre-lox o el sistema CRISPR. Este enfoque permite el análisis de una mutación genética específica en células hematopoyéticas para evaluar cómo contribuye al desarrollo de la enfermedad. Además, estos modelos emplean a menudo las células congénicas o del reportero para distinguir los efectos de células del mutante de las células normales o del salvaje-tipo. En muchos casos, se requiere un régimen de precondicionamiento para injerir con éxito las células madre hematopoyéticas donantes.
Actualmente, el trasplante de médula ósea a ratones receptores se puede dividir en dos categorías principales: 1) condicionamiento mieloablativo y 2) trasplante no condicionado. El condicionamiento mieloablativo puede lograrse por uno de dos métodos, a saber, la irradiación corporal total (LCT) o la quimioterapia15. La LCT se lleva a cabo sometiendo al receptor a una dosis letal de irradiación gamma o de rayos X, generando roturas de ADN o enlaces cruzados dentro de células que se dividen rápidamente, haciéndolas irreparables16. Busulfán y ciclofosfamida son dos medicamentos de quimioterapia de uso común que interrumpen el nicho hematopoyético y causan de manera similar daño en el ADN a las células que se dividen rápidamente. El resultado neto del preacondicionamiento mieloablativo es la apoptosis de las células hematopoyéticas, que destruye el sistema hematopoyético del receptor. Esta estrategia no sólo permite el engraftment acertado del HSPCs dispensador de aceite, pero puede también prevenir el rechazo del injerto suprimiendo el sistema inmune del recipiente. Sin embargo, el preacondicionamiento mieloablativo tiene efectos secundarios graves, como daño a los tejidos y órganos y a sus células inmunitarias residentes, así como la destrucción del nicho de médula ósea nativa17. Por lo tanto, se han propuesto métodos alternativos para superar estos efectos secundarios indeseables, particularmente en lo que respecta al daño a los órganos de interés. Estos métodos incluyen la irradiación blindada de ratones receptores y el BMT adoptivo a ratones no acondicionados9,17. El blindaje del tórax, la cavidad abdominal, la cabeza u otras regiones de la irradiación mediante la colocación de barreras de plomo mantiene los tejidos de interés protegidos de los efectos perjudiciales de la irradiación y mantiene su población de células inmunes residentes. Por otro lado, el BMT adoptivo de HSPCs a ratones no acondicionados tiene una ventaja adicional porque preserva el nicho hematopoyético nativo. En este manuscrito, se describen los protocolos y resultados de la injerto de HSPC después de varios regímenes de trasplante en ratones, específicamente la entrega de HSPC a ratones TBI, a ratones parcialmente protegidos de la irradiación, y a ratones no acondicionados. El objetivo general es ayudar a los investigadores a comprender los diferentes efectos fisiológicos de cada método, así como cómo afectan los resultados experimentales en el contexto del CH y las enfermedades cardiovasculares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

La hematopoyesis clónica es una condición edad-asociada frecuente que resulta de la acumulación de mutaciones somáticas en las células hematopoyéticas del vástago y del progenitor (HSPCs). Las mutaciones en los genes impulsores, que confieren aptitud celular, pueden conducir al desarrollo de clones de HSPC en expansión que cada vez más dan lugar a leucocitos de progenie que albergan la mutación somática. Porque la hematopoyesis clónica se ha asociado a enfermedad cardíaca, al movimiento, y a mortalidad, el desarrollo de los sistemas experimentales que modelan estos procesos es dominante a entender los mecanismos que subly este nuevo factor de riesgo. Los procedimientos del trasplante de la médula que implican el condicionamiento myeloablative en ratones, tales como irradiación de cuerpo entero (TBI), se emplean comúnmente para estudiar el papel de células inmunes en enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el daño simultáneo al nicho de la médula ósea y otros sitios de interés, como el corazón y el cerebro, es inevitable con estos procedimientos. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar los posibles efectos secundarios causados por la LCT: 1) trasplante de médula ósea con blindaje de irradiación y 2) BMT adoptivo a ratones no acondicionados. En órganos blindados, el ambiente local se preserva permitiendo el análisis de la hematopoyesis clónica mientras que la función de células inmunes residentes es imperturbable. Por el contrario, el BMT adoptivo a ratones no acondicionados tiene la ventaja adicional de que tanto los ambientes locales de los órganos como el nicho hematopoyético se conservan. Aquí, comparamos tres diversos acercamientos hematopoyéticos de la reconstitución de la célula y discutimos sus fuerzas y limitaciones para los estudios de la hematopoyesis clónica en enfermedad cardiovascular.

Para comparar el efecto de tres métodos de BMT/pre-conditioning sobre el engraftment dispensador de aceite de la célula, las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en el poste-BMT de 1 mes. Las células aisladas fueron manchadas para que los marcadores específicos del leucocito identifiquen los diversos subconjuntos de leucocitos. En estos experimentos, el salvaje-tipo(PESO) C57BL/6 (CD45.2) las células dispensadoras d...

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Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.

Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Nuestro protocolo ayudará a los investigadores a comprender los efectos fisiológicos de tres métodos diferentes de trasplante de médula ósea y cómo afectan los resultados experimentales en el entorno de la hematopoyesis clonal. El trasplante de médula ósea con radiación corporal total puede afectar negativamente a los órganos cardiovasculares y alterar la patogénesis de la enfermedad. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar posibles efectos secundarios.Demostrando los procedimientos estarán Eunbee Park, un estudiante graduado, y Megan Evans, una becaria postdoctoral, ambos de mi laboratorio Para el blindaje del tórax y el abdomen, coloque la bandeja ajustable y el irradiador de rayos X a la distancia correcta para lograr una irradiación uniforme. Y coloque los ratones anestesiados en una placa plana invertida entre sí en decúbito supino. Asegure las patas a la placa con cinta adhesiva, y coloque el blindaje led para que el extremo inferior se alinee con el hueso xiphisternum y el extremo superior del escudo de plomo se siente cerca del timo.Después del blindaje, coloque los ratones en el irradiador y exponga a los animales a dos fracciones grises de irradiación de 5,5 separadas por un intervalo de cuatro a 24 horas. Para el blindaje de la cabeza, pegue cuidadosamente las cuatro patas del ratón al abdomen. Coloque el ratón en un sujeción cónica y deslice el sujeción en la ranura dentro del escudo de plomo para que la cabeza y las orejas del ratón estén completamente cubiertas, dejando el resto del cuerpo del ratón expuesto a una radiación.Después del blindaje, coloque los ratones en el irradiador y exponga a los animales a 5,5 fracciones grises de una radiación separadas por un intervalo de cuatro a 24 horas. Después de cada tratamiento de radiación, coloque los ratones anestesiados en una jaula en una estera calentada con monitoreo hasta que esté completamente recuperado. Para aislar los huesos, desinfecte la piel del ratón donante con etanol al 70% y haga una pequeña incisión transversal de la piel debajo de la caja torácica.Sosteniendo la piel firmemente a cada lado de la incisión, desgarre en direcciones opuestas hacia la cabeza y los pies y desprenda la piel de todas las extremidades. Corte sobre los hombros y las articulaciones del codo, y use una toallita de laboratorio para eliminar los músculos y tejidos conectivos unidos de los hómenos. Dislote cuidadosamente las articulaciones entre el fémur y los huesos de la cadera.Y use tijeras romas para cortar a lo largo de las cabezas femorales para separar las piernas. Cortar sobre la articulación de la rodilla, para separar el fémur y la tibia. Y use toallitas de laboratorio para eliminar cuidadosamente los músculos unidos y los tejidos conectivos de los huesos.Luego tire de los huesos de ratones del mismo genotipo en tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contienen 20 mililitros de PBS estéril helado en hielo. Para aislar las células de la médula ósea en un gabinete de clase dos de bioseguridad, use una aguja calibre 18 para hacer un pequeño agujero en la parte inferior de un microtubo estéril de 500 microlitros. Y coloque el tubo en un tubo de micro centrífuga estéril individual de 1.5 mililitros que contiene 100 microlitros de PBS estéril helado.Cuando todos los tubos hayan sido preparados, retire el PBS del tubo que contiene los huesos aislados y transfiera los huesos a un plato estéril de cultivo celular de 100 milímetros. Use fórceps finos y tijeras pequeñas para eliminar cuidadosamente la epífisis de los extremos de cada hueso y coloque hasta seis huesos en cada tubo de 500 microlitros. Cuando todos los huesos hayan sido cortados, extraiga las células de la médula ósea por centrifugación.Si se ha eliminado todo el contenido de médula, los huesos deben aparecer blancos y translúcidos con un pellet rojo relativamente grande en la parte inferior del tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Para el trasplante de células de médula ósea, diluya las células aisladas de médula ósea en medios RPMI sin suero y cargue 200 microlitros de la suspensión celular en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros por ratón que se va a inyectar. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, inyecte lentamente todo el volumen de células en la vena orbital retro de cada animal receptor anestesiado.Luego coloque una gota de proparacaína en el ojo para aliviar el dolor. Y permita que el ratón recupere la conciencia mientras es monitoreado. Comparar el efecto de tres métodos de preacondicionamiento de BMT sobre el injerto de células donantes.Las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en un poste BMT del mes. En este análisis representativo, en la sangre periférica de los ratones receptores que recibieron irradiación de cuerpo entero, los monocitos, los neutrófilos y las células B fueron en gran parte ablacionados y reemplazados por la progenie de las células derivadas de la médula ósea donante. Además, las poblaciones cardiacas receptoras residentes del monocito y del neutrófilo fueron substituidas casi totalmente por las células derivadas dispensadoras de aceite.En el grupo parcialmente blindado de la irradiación, el reemplazo cardiaco derivado donante de la célula inmune cardiaca era modesto. Las células receptoras de médula ósea de ratón dentro de las regiones blindadas probablemente contribuyeron al nivel más bajo de reconstitución de la sangre periférica en comparación con los ratones que recibieron irradiación corporal total. En el grupo sin el preacondicionamiento de BMT, las células derivadas dispensadoras de aceite eran perceptibles en la sangre periférica y los corazones de ratones receptores en cuatro semanas de poste BMT.Además, las células donantes deficientes en Tet2 se expandieron gradualmente con el tiempo. En comparación, los ratones receptores injertados con células donantes de tipo salvaje mostraron una expansión clonal mínima de las células donantes. La optimización de estos modelos experimentales permitirá realizar estudios más rigurosos de los genes impulsores de la hematopoyesis clonal que contribuyen a la mortalidad por todas las causas, como las enfermedades cardio-metabólicas y el cáncer.Esperamos que nuestros protocolos permitan a los investigadores estudiar la hematopoyesis clonal para investigar cómo contribuye a la enfermedad cardiovascular y otros estados de la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Investigación

Inmunología e Infección

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...