Name: bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından K. Walsh'a (HL131006, HL138014 ve HL132564), S. Sano'ya (HL152174), M. A. Evans'a Amerikan Kalp Derneği hibesi (20POST35210098) ve H. Ogawa'ya Japonya Kalp Vakfı hibesi ile desteklendi.

Hayvan konularını içeren tüm prosedürler Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Ön koşuldan önce
<ol><li>Alıcı fareleri ışınlamadan önce antibiyotik takviyeli suya (5 mM sülfamethoxazole, 0.86 mM trimethoprim) ~24 saat yerleştirin. Bu, enfeksiyonu önlemek için gereklidir, çünkü bağışıklık sistemi ışınlamadan sonra baskılanacak ve ışınlamadan sonra 2 hafta boyunca korunacaktır. Bu noktada, ...

<ol>
	<li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease,+aging,+and+clonal+hematopoiesis.">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes.">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li><li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure.">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence.">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease.">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li><li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis.">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1&#946;/NLRP3+inflammasome.">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1&#946;/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure.">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li><li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking.">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease.">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li><li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation:+one+size+does+not+fit+all.">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li><li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens:+working+definitions.">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li><li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li><li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner.">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model.">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).</li><li>Ismaiel, A., Dumitra&#351;cu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease:+the+liver-heart+axis-literature+review.">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).</li><li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system.">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li><li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy.">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease.">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li><li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia.">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li><li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li><li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL/6J+mice.">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury.">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li></ol>

Klonal hematopoez çalışmaları için üç BMT yöntemi tanımladık: total vücut ışınlamalı BMT, kısmi kalkanlı ışınlamalı BMT ve ön koşullandırma içermeyen daha az yaygın olarak kullanılan bir BMT yöntemi (benimsenen BMT). Bu yöntemler klonal hematopoezin kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bu yöntemleri çalışmalarının özel amacına uyacak şekilde değiştirebilirler.
Klonal hematopoe...

Klonal hematopoez (CH), yaşlı bireylerde sıklıkla gözlenen ve genetik mutasyon taşıyan genişletilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) klonunun bir sonucu olarak ortaya çıkan bir durumdur1. 50 yaşına kadar, çoğu bireyin her HSPC2'deortalama beş eksonik mutasyon elde etmiş olacağı ileri sürülmektedir , ancak bu mutasyonların çoğu birey için çok az fenotipik sonuçlara neden olacaktır. Bununla birlikte, bu mutasyonlardan biri HSPC'ye rekabet avantajı sağlıyorsa (örneğin, çoğalmasını, kendini yenilemesini, hayatta kalmasını veya bunların bir kombinasyonunu teşvik ederek), bu mutant klonun diğer HSPC'lere göre tercihli genişlemesine yol açabilir. Sonuç olarak, mutasyona uğramış HSPC olgun kan hücrelerine yol açtıkça mutasyon hematopoetik sisteme giderek daha fazla yayılacak ve periferik kan içinde mutasyona uğramış hücrelerin farklı bir popülasyonuna yol açacaktır. Onlarca farklı aday sürücü genlerindeki mutasyonlar hematopoetik sistem içindeki klonal olaylarla ilişkili olsa da, bunlar arasında DNA metiltransferaz 3 alfa (DNMT3A) ve on bir translokasyon 2 (TET2) mutasyonları en yaygın3 'tür. Çeşitli epidemiyolojik çalışmalar, bu genetik mutasyonları taşıyan bireylerin kardiyovasküler hastalık (CVD), inme ve tüm nedensel mortalite3, 4 ,5,6,7riskinin önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulmuştur. Bu çalışmalar CH ile CVD ve inme insidansının artması arasında bir ilişki olduğunu tespit etmekle birlikte, bu ilişkinin nedensel mi yoksa yaşlanma süreci ile paylaşılan bir epifenomenon mu olduğunu bilmiyoruz. Bu ilişkinin daha iyi anlaşılması için, CH'nin insan durumunu doğru bir şekilde özetleyen uygun hayvan modelleri gereklidir.
Zebra balığı, fare ve insan dışı primatlar 8 , 9 , 10 , 11,12,13,14kullanılarak grubumuz ve diğerleri tarafından çeşitli CH hayvan modelleri kurulmuştur. Bu modeller genellikle genetiği değiştirilmiş hücrelerin nakliyle, bazen Cre-lox rekombinasyonunu veya CRISPR sistemini kullanarak hematopoetik rekonsyon yöntemlerini kullanır. Bu yaklaşım, hematopoetik hücrelerdeki belirli bir gen mutasyonunun hastalık gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için analizini sağlar. Ek olarak, bu modeller genellikle mutant hücrelerin etkilerini normal veya vahşi tip hücrelerden ayırt etmek için konjenik veya muhabir hücreler kullanır. Çoğu durumda, donör hematopoetik kök hücreleri başarılı bir şekilde engrafe etmek için bir ön koşullandırma rejimi gereklidir.
Şu anda, kemik iliğinin alıcı farelere nakli iki ana kategoriye ayrılabilir: 1) miyeloablatif şartlandırma ve 2) koşulsuz transplantasyon. Miyeloablatif koşullandırma, toplam vücut ışınlama (TBI) veya kemoterapi15olmak üzere iki yöntemden biriyle elde edilebilir. TBI, alıcıyı ölümcül bir gama veya X-ışını ışınlama dozuna tabi tutularak, hızla bölünen hücrelerde DNA kırılmaları veya çapraz bağlantılar üreterek, onarılamaz hale getirerekgerçekleştirilir 16. Busulfan ve siklofosfamide, hematopoetik nişi bozan ve benzer şekilde hızla bölünen hücrelere DNA hasarı veren iki yaygın olarak kullanılan kemoterapi ilacıdır. Miyeloablatif önkoşulların net sonucu, alıcının hematopoetik sistemini yok eden hematopoetik hücrelerin apoptozudur. Bu strateji sadece donör HSPC'lerin başarılı bir şekilde yerleştirilmesine izin verir, aynı zamanda alıcının bağışıklık sistemini baskılayarak greft reddini de önleyebilir. Bununla birlikte, miyeloablatif önkoşul, doku ve organlara ve yerleşik bağışıklık hücrelerine zarar vermenin yanı sıra yerli kemik iliği nişinin tahrip edilmesi gibi ciddi yan etkilere sahiptir17. Bu nedenle, özellikle ilgi organlarının zarar görmesi açısından, bu istenmeyen yan etkilerin üstesinden gelmek için alternatif yöntemler önerilmiştir. Bu yöntemler, alıcı farelerin korumalı ışınlanması ve koşulsuz farelere benimseyen BMT9,17. Bir kurşun bariyerlerin yerleştirilmesiyle toraks, karın boşluğu, kafa veya diğer bölgeleri ışınlamadan korumak, ilgi çekici dokuları ışınlamanın zarar verici etkilerinden korur ve yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonlarını korur. Öte yandan, HSPC'lerin koşullanmamış farelere benimseyen BMT'si, doğal hematopoetik niş koruduğu için ek bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, farelerde birkaç transplantasyon rejiminden sonra HSPC engraftasyonunun protokollerini ve sonuçlarını, özellikle HSPC'nin TBI farelerine, ışınlamadan kısmen korunan farelere ve koşulsuz farelere teslimini açıklıyoruz. Genel amaç, araştırmacıların her yöntemin farklı fizyolojik etkilerini ve CH ve kardiyovasküler hastalıkların ayarlanmasındaki deneysel sonuçları nasıl etkilediklerini anlamalarına yardımcı olmaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-121</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26028</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>200559</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>395195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium-137 Irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd&#160;</td>
			<td>Mark IV</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>043-304</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>KCC34155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td>
			<td>TEVA</td>
			<td>0703-9526-01</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>139-236</td>
			<td>injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Rad source</td>
			<td>RS-2000</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation procedures in mice to study clonal hematopoiesis

Klonal hematopoez, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC) somatik mutasyonların birikmesinden kaynaklanan yaygın bir yaşla ilişkili durumdur. Sürücü genlerindeki mutasyonlar, hücresel zindelik sağlayan, somatik mutasyonu barındıran progeny lökositlere giderek daha fazla yol açan genişleyen HSPC klonlarının gelişmesine yol açabilir. Klonal hematopoez kalp hastalığı, inme ve mortalite ile ilişkili olduğundan, bu süreçleri modelleyen deneysel sistemlerin geliştirilmesi, bu yeni risk faktörünün altında yer alan mekanizmaları anlamanın anahtarıdır. Toplam vücut ışınlama (TBI) gibi farelerde miyeloablatif koşullandırmayı içeren kemik iliği nakli prosedürleri, bağışıklık hücrelerinin kardiyovasküler hastalıklardaki rolünü incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kemik iliği nişine ve kalp ve beyin gibi diğer ilgi alanlarına eşzamanlı hasar, bu prosedürlerle kaçınılmazdır. Bu nedenle laboratuvarımız TBI'ın neden olduğu olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir: 1) ışınlama kalkanı ile kemik iliği nakli ve 2) koşulsuz farelere benimseyen BMT. Korumalı organlarda, lokal çevre korunarak klonal hematopoez analizine izin verirken, yerleşik bağışıklık hücrelerinin işlevi bozulmamıştır. Buna karşılık, koşullanmamış farelere benimseyen BMT, hem organların yerel ortamlarının hem de hematopoetik nişinin korunması ek avantaja sahiptir. Burada, üç farklı hematopoetik hücre rekonstrüt yaklaşımını karşılaştırıyoruz ve kardiyovasküler hastalıkta klonal hematopoez çalışmaları için güçlü yönlerini ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

Üç BMT/pre-conditioning yönteminin donör hücre engraftmenti üzerindeki etkisini karşılaştırmak için, donör hücrelerin periferik kan ve kalp dokusundaki fraksiyonları BMT sonrası 1 aylık akış sitometrisi ile analiz edildi. İzole hücreler, lökositlerin farklı alt kümelerini tanımlamak için spesifik lökosit belirteçleri için lekelendi. Bu deneylerde WT B6'ya yabani tip(WT) C57BL/6 (CD45.2) donör kemik iliği hücreleri teslim edildi. SJL-Ptprca...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Protokolümüz, araştırmacıların üç farklı kemik iliği transplantasyon yönteminin fizyolojik etkilerini ve klonal hematopoez ortamında deneysel sonuçları nasıl etkilediklerini anlamalarına yardımcı olacaktır. Toplam vücut radyasyon kemik iliği nakli kardiyovasküler organları olumsuz etkileyebilir ve hastalık patogenezlerini değiştirebilir. Böylece laboratuvarımız olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir.Prosedürleri gösteren eunbee park bir yüksek lisans öğrencisi olacak, ve Megan Evans doktora sonrası bir arkadaş, hem benim laboratuvarımdan toraks ve karın kalkanı için, ayarlanabilir tepsi ve x-ray ışınlayıcı doğru mesafeye yerleştirmek üniforma ışınlama elde etmek için. Ve uyuşturulmuş fareleri sırtüstü pozisyonda birbirine ters çevrilmiş düz bir led plakaya yerleştirin. Pençeleri bantla tabağa sabitleyin ve led kalkanı alt ucu xiphisternum kemiği ile hiza olacak şekilde yerleştirin ve kurşun kalkanın üst ucu timusa yakın olacak şekilde yerleştirin.Kalkandan sonra, fareleri ışınlayıcıya yerleştirin ve hayvanları dört ila 24 saat arayla ayrılmış iki, 5,5 gri ışınlama fraksiyonuna maruz bırakın. Baş koruyucu için, farenin dört pençesini dikkatlice karnına bantleyin. Fareyi konik bir kısıtlayıcıya yerleştirin ve kısıtlayıcıyı kurşun kalkan içindeki yuvaya kaydırın, böylece farenin başı ve kulakları tamamen kaplanır ve farenin vücudunun geri kalanı radyasyona maruz kalır.Siper ettikten sonra fareleri ışınlayıcıya yerleştirin ve hayvanları dört ila 24 saat arayla ayrılmış bir radyasyonun 5,5 gri fraksiyonuna maruz bırakır. Her radyasyon tedavisinden sonra, uyuşturulmuş fareleri tamamen iyileşene kadar izleme ile ısıtılmış bir paspas üzerinde bir kafese yerleştirin. Kemikleri izole etmek için, donör farenin derisini% 70 etanol ile dezenfekte edin ve göğüs kafesinin altında küçük bir enine cilt kesisi yapın.Kesiğin her iki tarafında cildi sıkıca tutarak, baş ve ayaklara doğru ters yönde yırtın ve cildi tüm uzuvlardan soyun. Omuzları ve dirsek eklemlerini kesin ve bağlı kasları ve bağ dokularını humeriden çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın. Uyluk kemiği ve kalça kemikleri arasındaki eklemleri dikkatlice yerinden sökün.Ve bacakları ayırmak için uyluk kafalarını kesmek için künt makas kullanın. Uyluk kemiği ve kaval kemiğini ayırmak için diz eklemini kesin. Ve bağlı kasları ve bağ dokularını kemiklerden dikkatlice çıkarmak için laboratuvar mendilleri kullanın.Daha sonra kemikleri aynı genotipteki farelerden buz üzerinde 20 mililitre buz soğuk steril PBS içeren bireysel 50 mililitre konik tüplere çekin. Kemik iliği hücrelerini biyo-güvenlik sınıfı iki kabinde izole etmek için, steril 500 mikroliter mikro tüpün dibinde küçük bir delik açmak için 18 kalibrelik bir iğne kullanın. Ve tüpü, 100 mikrolitre buz gibi steril PBS içeren tek bir steril 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.Tüm tüpler hazırlandığında, PBS'yi izole edilmiş kemikleri içeren tüpten çıkarın ve kemikleri steril bir 100 milimetre hücre kültürü çanağında aktarın. Her kemiğin uçlarından epifizi dikkatlice çıkarmak için ince epanslar ve küçük makas kullanın ve her 500 mikroliter tüpüne altı adede kadar kemik yerleştirin. Tüm kemikler kesildiğinde, kemik iliği hücrelerini santrifüjleme ile çıkarın.Tüm ilik içeriği çıkarılmışsa, kemikler 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpünün dibinde nispeten büyük bir kırmızı pelet ile beyaz ve yarı saydam görünmelidir. Kemik iliği hücre nakli için, izole edilmiş kemik iliği hücrelerini serumsuz RPMI ortamlarında seyreltin ve hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini enjekte edilecek fare başına 0,5 mililitre insülin şırıngasına yükleyin. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, tüm hücre hacmini yavaşça her anestezi alan hayvanın retro orbital damarına enjekte edin.Daha sonra ağrı kesici için göze bir damla proparacaine yerleştirin. Ve farenin izlenirken bilincini geri kazanmasına izin verin. Üç BMT önkoşullama yönteminin donör hücre engraftasyonu üzerindeki etkisini karşılaştırmak.Periferik kan ve kalp dokusundaki donör hücrelerin fraksiyonları BMT sonrası bir aylıkken akış sitometrisi ile analiz edildi. Bu temsili analizde, toplam vücut ışınlanması alan alıcı farelerin periferik kanında monositler, nötrofiller ve B hücreleri büyük ölçüde ablatlandı ve donör kemik iliği türevi hücrelerin soyu ile değiştirildi. Ek olarak, yerleşik alıcı kardiyak monosit ve nötrofil popülasyonları donör türevi hücrelerle neredeyse tamamen değiştirildi.Kısmen korumalı ışınlama grubunda, donör türetilmiş kardiyak immün hücre değişimi mütevazıydı. Kalkanlı bölgelerdeki alıcı fare kemik iliği hücreleri, muhtemelen toplam vücut ışınlanması alan farelere kıyasla daha düşük periferik kan rekonsepsiyon seviyesine katkıda bulunmuştur. BMT önkoşulu olmayan grupta, donör türevi hücreler BMT sonrası dört haftada alıcı farelerin periferik kanında ve kalplerinde tespit edilebilirdi.Ek olarak, Tet2 eksik donör hücreleri zamanla yavaş yavaş genişledi. Buna karşılık, vahşi tip donör hücreleri ile kaplanmış alıcı fareler, donör hücrelerde minimum klonal genişleme gösterdi. Bu deneysel modellerin optimizasyonu, kardiyo-metabolik hastalık ve kanser gibi mortaliteye neden olan klonal hematopoez sürücü genlerinin daha titiz çalışmalarını sağlayacaktır.Protokollerimizin araştırmacıların kardiyovasküler hastalıklara ve diğer hastalık durumlarına nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için klonal hematopoez çalışmasına izin vereceğini umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...