Name: preparing adult drosophila melanogaster for whole brain imaging during behavior and stimuli responses
Uploaded: 2021-04-27T13:30:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses at JoVE.com

Vi takker Heidi Miller-Mommerskamp for teknisk hjelp og Iveth Melissa Guatibonza Arevalo for nyttige kommentarer til manuskriptet. Innledende versjoner av protokollen ble utviklet i laboratoriet til Ralph Greenspan. Dette arbeidet ble støttet av den tyske forskningsstiftelsen (DFG), spesielt gjennom et tilskudd FOR2705 (TP3) til IGK, og av Simons foundation (Aimon – 414701) og Kavli Institute for Brain and Mind (tilskuddsnummer #2017-954) mottatt av SA.

Alle trinn utføres under et stereomikroskop.
1. Klargjøring av holderen
<ol><li>Skriv ut holderen 'FlyholderVJove.stl' (se Tilleggsmateriale) med en 3D-skriver eller få den skrevet ut ved hjelp av elektroniske tjenester (Figur 1A). Både SLS (Nylon PA12) og multijet fusion (PA12) er egnet.</li>
	<li>Opprett hodesporet.<ol>
<li>Legg et stykke klebrig tape rektangulært på en flat overflate. Klipp en skive på ca. 5 mm x 1 cm. Klipp nakkesporet (~400 x 400 μm) midt på den lengre siden av båndet med faste parallelle kniver (to skalpellblader som sitter fast sammen) for å sikre samme bredde i hver holder (Figur 1B).</li>
		<li>Plasser tapen over den flatere siden av hullet i holderen på undersiden (se figur 1C og figur 1D). Båndet kan deformeres ved å skyve det ned med tang ~ 500 μm rundt hullet; Dette vil ytterligere minimere hindre senere flybevegelser.</li>
		<li>Dekk båndet og holderen fra toppen med svart neglelakk for å forhindre at bufferen lekker ut. Den svarte neglelakken vil også beskytte flyets øyne mot mikroskopets eksitasjonslys. La neglelakken tørke minst en time før du bruker holderen.</li>
		<li>Når neglelakken er tørr, tilsett ~1 μL fett i hodesporet ved hjelp av et rullet vev for å sikre at limet ikke vil fukte baksiden av flyets hode (Figur 2A). Pass på at du ikke legger fett utenfor sporet som hindrer limet i å stikke.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opprette karosseriet (Figur 2B).<ol>
<li>Eventuelt, forbered båndet som skal brukes til å plassere flyets kropp (se nedenfor) på forhånd. Bruk designet vist i figur 2B (øverst) for å kutte et stykke ~ 2 cm bredt tape i to og kutte 1,5 mm brede skiver. Skjær ut 0,3 mm dype skuldre og karosserispor. Pass på at den passer til holderen. MERK: Variasjonen mellom flystørrelser (spesielt med kjønn, alder, genotype eller art) kan gjøre det nødvendig å justere bånddesignet. Hvis hodet har en tendens til å være dårlig sentrert, kan det være nyttig å legge til et V-formet stykke tape midlertidig over nakkesporet (Figur 3). Påfør også noen mikroliter fett inne i nakkesporet og på det V-formede båndet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Plassere fluen
MERK: En til fire dager gamle kvinnelige fluer er ideelle fordi det kvinnelige hodet er større og dermed lettere å dissekere enn det mannlige hodet, og yngre fluer har mykere kutikol. For gåeksperimenter kan flyaktiviteten økes ved å matche forsøkene med tider med høyere døgnaktivitet (ZT0 eller ZT11), ved å bruke saltvann som inneholder glukose (for eksempel 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H2O, 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3,1 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2·2 H2O, 4 mM MgCl2·6 H2O), ved å sulte flyet opp til 24 timer med et vann bare miljø, og ved å varme miljøet til ~ 28 ° C under eksperimentet. Klipping av vingene minst en dag i forveien bidrar også til å redusere forsøk på å fly og dermed øke hyppigheten av å gå kamper7,29,30.
<ol><li>Fyll en Petri-tallerken eller pipettespissbokslokk med is, legg et laboratorievev på toppen av isen og sett holderen opp ned på den.</li>
	<li>Overfør en flue på is for å lamme den ved å suge den fra hetteglasset til et rør og blåse det på isen (sørg for at isen ikke smelter som vil drukne flyet).</li>
	<li>Når flyet slutter å bevege seg, bruk kjedelige tang for å skyve den inn i holderen med nakken inne i sporet (flyet kan holdes på grunnlag av vingen) som i figur 4 (venstre). Øynene skal være i like posisjoner i forhold til sidene av sporet (Figur 4, midten). Om nødvendig, tilsett 1 μL fett på toppen av hodet for å forhindre at limet (se neste trinn) når baksiden av hodet og fjern senere.</li>
	<li>Dekk kroppen med et vev og litt is for å sikre at flyet ikke beveger seg i løpet av dette trinnet og det neste (Figur 4, høyre). Et annet alternativ for å forhindre at bena når hodet, er å bruke et stykke tape like under hodet (se figur 6).</li>
</ol>3. Sikring av hodet
<ol><li>Plasser hodet i en vinkel på ~20° fra en helt bakre visning (rundt sideaksen, se figur 5A). Dette er et kompromiss mellom å redusere dybden til bildet og på den andre siden opprettholde det fremre benet fritt til å bevege seg og minimere strekningen av nakken.</li>
	<li>Med et opprullet vev (Figur 5B) legger du UV-lim rundt hodet samtidig som du unngår å skitne til det sensoriske interesseområdet (antenner, proboscis og/eller øyne). For smakseksperimenter, trekk proboscis ut og legg lim ved basen for å forhindre bevegelse. Hvis det ikke planlegges noe smakseksperiment, skyves proboscis best inn i hodet og festes med lim for å minimere bevegelse (figur 6).</li>
	<li>Herd limet med UV-lys i 5 s. Rengjør forsiktig omgivelsene til hodet med et opprullet vev for å fjerne gjenværende flytende lim som kan holde seg til bena og / eller jordsensoriske områder. MERK: Båndet kan groves med sandpapir for å øke limadhesjonen om nødvendig.</li>
	<li>Bruk en tynn stripe tape eller et rullet vev for å flytte bena til forsiden (hvis de ikke allerede er), slik at de ikke blir skadet av neste trinn.</li>
</ol>4. Plassering av kroppen
MERK: Dette trinnet må utføres raskt; før flyet gjenoppretter fra anestesi.
<ol><li>Fjern isbeholderen og snu holderen. Fjern vannet rundt fluen med et vev.</li>
	<li>Plasser karosseriets tape (opprettet i trinn 1) over hullet og skyv forsiktig flyets kropp ned (figur 7). Pass på at du ikke strekker nakken for mye.</li>
</ol>5. Tetting av hullet
<ol><li>Dekk eventuelle gjenværende store hull med tape.</li>
	<li>Tilsett ~1 μL fett på baksiden av hodet og i nakkeområdet for å sikre at det ikke blir vått lim der.</li>
	<li>Med et opprullet vev, mal UV-lim rundt og på toppen av båndet og på thoraxen (øvre dorsal del av mesonotumet) for å fikse det. Herd limet med UV-lys i ~ 5 s. MERK: Det er viktig å minimere bruken av UV-lys, da det kan ha stor innvirkning på flyets helse.</li>
	<li>Rengjør forsiktig fett og usikret lim med et laboratorievev.</li>
	<li>Sett ~1 ml saltvann på toppen av hodet. Skyv luftbobler til side med tang. Se etter lekkasjer ved å plassere en deksle over saltvannsslipen og vri holderen rundt for å se etter saltvann på forsiden. Hvis det er noen lekkasjer, fjern saltvannsvann og fest hullet (enten ved å legge til mer lim eller mer fett). MERK: Dette kan være et godt tidspunkt å pause om nødvendig. Flyet kan tilbys et lite stykke vev eller Styrofoam ball å gå på for å forhindre flailing og roe flyet ned.</li>
</ol>6. Dissekere hodet
MERK: Bruk skarpe tang for følgende trinn. Svært fine tang er kritiske, da kjedelige tang vil gjøre det vanskeligere å åpne hodesekken og kan føre til ytterligere skader på flyets hode eller hjerne. Sterk forstørrelse kan hjelpe på dette stadiet. Til det målet kan man erstatte okularet til kikkertmikroskopet med 30x okularer.
<ol><li>Lag to kutt ved foten av den sentrale mørke kutikulære trekanten på hver side av nakken (se kryss i figur 8A).</li>
	<li>Klipp rundt den mørke trekanten og fjern denne delen av kutiklen.</li>
	<li>Hullet i hjernen som muskel 16 og spiserøret går gjennom, skal nå være synlig og bevege seg rytmisk (Video 1 presenterer denne rytmiske bevegelsen i en flue med fluorescerende muskler). Klem forsiktig toppen av dette området for å kutte muskel 16 uten å punktere spiserøret. Hvis den rytmiske bevegelsen i hjernen stoppet, ble muskel 16 sannsynligvis fjernet, men bevegelsen stopper noen ganger og starter på nytt senere. Det er derfor viktig å være oppmerksom på rytmiske bevegelser og utføre dette trinnet igjen om nødvendig.</li>
	<li>Klipp den gjenværende kutiklen i små biter og fjern dem forsiktig. Prøv å ikke trekke på kutikalen for mye. Bruk i stedet tang som en saks, for å kutte biter av vev. Man kan starte på medialkantene, hvor den mørke trekanten ble fjernet før og jobbe ens vei til sidene. MERK: Biter av kutikel kan brukes til å skrape forsiktig av fettlegemer hvis de er til stede.</li>
	<li>Fjern luftsekkene etter hverandre ved å gripe dem med tangene og trekke sakte og jevnt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Papanicolaou, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Oxford Handbook of Functional Brain Imaging in Neuropsychology and Cognitive Neurosciences. , (2017).</li><li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+high-resolution+miniature+two-photon+microscopy+for+brain+imaging+in+freely+behaving+mice.">Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice.</a> Nature Methods. 14, 713-719 (2017).</li><li>Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-trial+neural+dynamics+are+dominated+by+richly+varied+movements.">Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements.</a> Nature Neuroscience. 22, 1677-1686 (2019).</li><li>Ahrens, M. B., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+imaging+in+small+brains.">Large-scale imaging in small brains.</a> Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).</li><li>Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+Genetics+meets+behaviour.">Drosophila: Genetics meets behaviour.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 879-890 (2001).</li><li>Venken, K. J. T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+gene+manipulation+in+Drosophila+melanogaster.">Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 6, 167-178 (2005).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complete+Electron+Microscopy+Volume+of+the+Brain+of+Adult+Drosophila+melanogaster.">A Complete Electron Microscopy Volume of the Brain of Adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174, 730-743 (2018).</li><li>Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+complex+brain+dynamics+using+Drosophila.">Studying complex brain dynamics using Drosophila.</a> Journal of Neurogenetics. 34, 171-177 (2020).</li><li>Fiala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Expressed+Cameleon+in+Drosophila+melanogaster+Is+Used+to+Visualize+Olfactory+Information+in+Projection+Neurons.">Genetically Expressed Cameleon in Drosophila melanogaster Is Used to Visualize Olfactory Information in Projection Neurons.</a> Current Biology. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Calcium+Imaging+Reveals+an+Odor-Evoked+Map+of+Activity+in+the+Fly+Brain.">Two-Photon Calcium Imaging Reveals an Odor-Evoked Map of Activity in the Fly Brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Mann, K., Gallen, C. L., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Brain+Calcium+Imaging+Reveals+an+Intrinsic+Functional+Network+in+Drosophila.">Whole-Brain Calcium Imaging Reveals an Intrinsic Functional Network in Drosophila.</a> Current Biology. 27, 2389-2396 (2017).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca2++rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca2+ rhythms in vivo.</a> Science. 351, 976-981 (2016).</li><li>Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representations+of+Taste+Modality+in+the+Drosophila+Brain.">Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain.</a> Neuron. 86, 1449-1460 (2015).</li><li>Yoshihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+calcium+signals+from+identified+neurons+and+feeding+behavior+of+Drosophila+melanogaster.">Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1 (2012).</li><li>Strutz, A., V&#246;ller, T., Riemensperger, T., Fiala, A., Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+neural+activity+in+the+olfactory+system+of+Drosophila.">Calcium imaging of neural activity in the olfactory system of Drosophila.</a> Neuromethods. 72, 43-70 (2012).</li><li>Seelig, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+from+head-fixed+Drosophila+during+optomotor+walking+behavior.">Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior.</a> Nature Methods. 7, 535-540 (2010).</li><li>Fisher, Y. E., Lu, J., D'Alessandro, I., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+experience+remaps+visual+input+to+a+heading-direction+network.">Sensorimotor experience remaps visual input to a heading-direction network.</a> Nature. 576, 121-125 (2019).</li><li>Green, J., Vijayan, V., Mussells Pires, P., Adachi, A., Maimon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+heading+estimate+is+compared+with+an+internal+goal+to+guide+oriented+navigation.">A neural heading estimate is compared with an internal goal to guide oriented navigation.</a> Nature Neuroscience. 22, 1460-1468 (2019).</li><li>Shiozaki, H. M., Ohta, K., Kazama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-regional+Network+Encoding+Heading+and+Steering+Maneuvers+in+Drosophila.">A Multi-regional Network Encoding Heading and Steering Maneuvers in Drosophila.</a> Neuron. 106, 126-141 (2020).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+optical+brain+imaging+in+live+adult+fruit+flies.">Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies.</a> Nature Communications. 9, 872 (2018).</li><li>Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+contact+activates+male-specific+interneurons+that+trigger+stereotypic+courtship+behavior+in+Drosophila.">Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila.</a> Neuron. 69, 498-508 (2011).</li><li>Grover, D., Katsuki, T., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyception:+imaging+brain+activity+in+freely+walking+fruit+flies.">Flyception: imaging brain activity in freely walking fruit flies.</a> Nature Methods. 13, 569-572 (2016).</li><li>Cohn, R., Morantte, I., Ruta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+and+Compartmentalized+Neuromodulation+Shapes+Sensory+Processing+in+Drosophila.">Coordinated and Compartmentalized Neuromodulation Shapes Sensory Processing in Drosophila.</a> Cell. 163, 1742-1755 (2015).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Calcium+Imaging+of+Brain+Activity+in+Drosophila+by+Transgenic+Cameleon+Expression.">In Vivo Calcium Imaging of Brain Activity in Drosophila by Transgenic Cameleon Expression.</a> Science Signaling. 2003, (2003).</li><li>Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+odor-evoked+responses+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Calcium imaging of odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Bilz, F., Geurten, B. R. H., Hancock, C. E., Widmann, A., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+Distributed+Synaptic+Memory+Code+in+the+Drosophila+Brain.">Visualization of a Distributed Synaptic Memory Code in the Drosophila Brain.</a> Neuron. 106, 963-976 (2020).</li><li>Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Facilitates+Memory+by+Blocking+Dopamine+Neuron-Mediated+Forgetting.">Sleep Facilitates Memory by Blocking Dopamine Neuron-Mediated Forgetting.</a> Cell. 161, 1656-1667 (2015).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+near-whole-brain+imaging+in+adult+Drosophila+during+responses+to+stimuli+and+behavior.">Fast near-whole-brain imaging in adult Drosophila during responses to stimuli and behavior.</a> PLOS Biology. 17, 2006732 (2019).</li><li>Azevedo, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+size+principle+for+recruitment+of+Drosophila+leg+motor+neurons.">A size principle for recruitment of Drosophila leg motor neurons.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Haberkern, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+Guided+Behavior+and+Optogenetically+Induced+Learning+in+Head-Fixed+Flies+Exploring+a+Virtual+Landscape.">Visually Guided Behavior and Optogenetically Induced Learning in Head-Fixed Flies Exploring a Virtual Landscape.</a> Current Biology. 29, 1647-1659 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCAPE+Microscopy+for+High+Speed+,+3D+Whole-Brain+Imaging+in+Drosophila+Melanogaster.">SCAPE Microscopy for High Speed , 3D Whole-Brain Imaging in Drosophila Melanogaster.</a> Biomed. Opt. Congr. 2016, 4-6 (2016).</li><li>Wu, Y., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster,+sharper,+and+deeper:+structured+illumination+microscopy+for+biological+imaging.">Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging.</a> Nature Methods. 15, 1011-1019 (2018).</li><li>Bando, Y., Grimm, C., Cornejo, V. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+voltage+indicators.">Genetic voltage indicators.</a> BMC Biology. 17, 71 (2019).</li><li>Pla&#231;ais, P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulated+energy+metabolism+in+the+Drosophila+mushroom+body+is+the+trigger+for+long-term+memory.">Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory.</a> Nature Communications. 8, 15510 (2017).</li><li>G&#225;ndara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+toolkit+for+the+analysis+of+metabolic+changes+in+Drosophila+provides+new+insights+into+metabolic+responses+to+stress+and+malignant+transformation.">A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation.</a> Scientific Reports. 9, 19945 (2019).</li><li>Andreoni, A., Davis, C. M. O., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+brain+chemistry+using+genetically+encoded+fluorescent+sensors.">Measuring brain chemistry using genetically encoded fluorescent sensors.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 12, 59-67 (2019).</li><li>Broxton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+optics+theory+and+3-D+deconvolution+for+the+light+field+microscope.">Wave optics theory and 3-D deconvolution for the light field microscope.</a> Optics Express. 21, 25418-25439 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Drosophila er et av de sjeldne voksne dyrene der hele hjernen kan avbildes under kompleks atferd. Her presenterer vi en metode for å forberede fluen og utsette hele hjernen for å avbilde pågående hele hjerneaktivitet. Flere viktige punkter bør noterres.
Dissekering av et lite dyr som D. melanogaster er utfordrende. Metoden krever dermed mye øvelse og tålmodighet for å mestre den. Men etter trening tar prosedyren mindre enn 30 minutter og gir reproduserbare resultater.
Metoden vi presenterte har ytterligere begrensninger. For det første fører vippehodet fra sin naturlige posisjon til å strekke nakken som kan være skadelig for bindevev, nerver eller muskler. For det andre, selv om ventral subesophageal zone (SEZ) er optisk tilgjengelig, er den under den halvgjennomsiktige spiserøret, noe som reduserer intensiteten og oppløsningen i dette området. Til slutt, selv om holderen er utenfor rekkevidde i de fleste retninger, innser flyet fortsatt noen ganger sin tilstedeværelse og skyver på den for å prøve å unnslippe.
Til tross for disse begrensningene vil de omfattende dataene hentet fra hele hjerneavbildning under atferd og respons på stimuli gjøre det mulig å dechiffrere hjernefunksjonen på nivået av hele nettverket når dyret samhandler med og navigerer i komplekse, naturalistiske miljøer.

Avbildning av hjerneaktivitet ved hjelp av ulike teknikker har forsterket forståelsen av hjernefunksjon. Hos mennesker har hjerneavbildningsteknikker viktige begrensninger: mens funksjonell magnetisk resonansavbildning (fMRI) tilbyr romlig-temporal oppløsning langt under enkel nevronoppløsning, tillater raske teknikker som elektroencefalografi (EEG) bare indirekte og delvis tilgang til hjernen1. I tilstrekkelig store dyremodeller som gnagere tillater registrering av fluorescerende aktivitetssensorer (f.eks. GCaMP) ved hjelp av hodemonterte mikroskoper å observere hjerneaktivitet mens dyret beveger seg i sitt miljø2. Likevel gir disse teknikkene for tiden bare tilgang til en liten del av hjernen. Hodefaste dyr kan avbildes mer omfattende, men dekningen er fortsatt delvis (f.eks. cortex-overflaten3). Det er bare hos små dyr, som sebrafisk larver, C. elegans og Drosophila at hele hjernen kan avbildes med tidsmessig og romlig oppløsning på nivået av eller nær enkelt nevroner4.
D. melanogaster er spesielt lovende fordi den lenge har blitt brukt som en genetisk modellorganisme5 og kraftige genetiske verktøy er utviklet6. Supplert med det nye anatomiske nettverket i stor skala avledet fra elektronmikroskopi7, kan flyet gi unike muligheter til å studere kompleks hjernedynamikk generert på et stort nettverk8. Selv om kutiklet ikke er gjennomsiktig, og dermed må fjernes for å avbilde hjernen, har in vivo funksjonell avbildning blitt mer og mer vanlig siden den første studien i 20029 og flere protokoller er allerede publisert. Det er imidlertid Disse metodene innebærer enten å skille flyhodet fra kroppen10, sterkt begrense flyets bevegelser og / eller svar på stimuli11,12,13,14,15, eller bare tillate en liten del av hjernen som skal avbildes9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. For å utfylle disse likevel kraftige tilnærmingene, utviklet vi nylig et preparat for å avbilde hele hjernen under oppførsel og respons på ulike stimuli28.
Her bygger vi videre på denne studien for å presentere en metode som er spesielt utviklet for å avbilde hele hjernen mens fluen utfører semi-naturalistisk oppførsel (dvs. gange og grooming) og reagerer på sensoriske stimuli. Dette oppnås ved å bruke en observasjonsholder designet for å gi tilgang til hele hjernen fra dorsal-posterior-siden, samtidig som antennene og proboscis er intakte, og tillater flyet å bevege bena for å gå (f.eks. på en luftdempingskule). Trinn for dissekering av baksiden av hodet har blitt raffinert for hastighet, reproduserbarhet, og for å minimere effekten på flyets levedyktighet og mobilitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 forceps</td>
			<td>FST by DUMONT</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 forceps</td>
			<td>FST by DUMONT</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30x oculars</td>
			<td>yegren</td>
			<td>WF30-9-30-H</td>
			<td>WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHOME/UV flashlight</td>
			<td>Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd</td>
			<td>B07V2W9543 (ASIN)</td>
			<td>365 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fotoplast Gel/UV Glue</td>
			<td>Dreve Otoplastik GmbH</td>
			<td>44791</td>
			<td>GHS07, GHS08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Finish Transparent Tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH Science/Precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>7552</td>
			<td>11 x 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1500 LCD/Microscope light</td>
			<td>Schott</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MS5 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>WF30X/9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Lacqueur</td>
			<td>Opi Products Inc., N. Hollywood</td>
			<td>6306585338</td>
			<td>black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Werner Dorsch GmbH</td>
			<td>78 621; B07SXCXWFS (ASIN)</td>
			<td>soft handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>0020080 /100 gr</td>
			<td>Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adult drosophila melanogaster for whole brain imaging during behavior and stimuli responses

Vi presenterer en metode utviklet spesielt for å avbilde hele Drosophila-hjernen under pågående oppførsel som å gå. Hodefiksering og avhandling er optimalisert for å minimere deres innvirkning på atferd. Dette oppnås først ved å bruke en holder som minimerer bevegelseshindringer. Baksiden av flyets hode limes til denne holderen i en vinkel som gir optisk tilgang til hele hjernen mens du beholder flyets evne til å gå, brudgommen, lukten, smaken og se. Baksiden av hodet er dissekert for å fjerne vev i den optiske banen og muskler som er ansvarlige for hodebevegelsesgjenstander. Flyhjernen kan deretter avbildes for å registrere hjerneaktivitet, for eksempel ved hjelp av kalsium- eller spenningsindikatorer, under spesifikke atferd som å gå eller stelle, og som svar på forskjellige stimuli. Når den utfordrende disseksjonen, som krever betydelig praksis, har blitt mestret, gjør denne teknikken det mulig å registrere rike datasett relatert til hele hjerneaktivitet til atferd og stimulansresponser.

Preparatet beskrevet ovenfor tillater observasjon av hele hjernen under et mikroskop for 3D-avbildning i stor skala, for eksempel klassiske 2 fotoner eller konfokal mikroskopi, men også raskere teknikker som lysark31 og andre strukturerte belysningsmikroskopiteknikker (gjennomgått i32), eller lysfeltmikroskopi28.
Tilgangen til hele hjernen mens du observerer oppførselen og opprettholder funksjonelle sensoriske organer gjør det mulig å svare på flere spørsmål.
For det første, hva er den generelle hjerneaktiviteten når flyet er i ro, under atferd og når det reagerer på stimuli? Som et eksempel inkluderer vi data innhentet med et lysfeltmikroskop som viser hjerneaktivering under respons på stimuli og oppførsel. For eksempel, i Video 2, ble en kalsiumsonde uttrykt i alle nevroner (nsyb-GAL4 og UAS-syt-GCaMP6s (venstre) eller UAS-GCaMP6M (høyre)) og en luktpust ble presentert. Legg merke til hvordan preparatet gjør det mulig å få oversikt over hjerneaktivitet under responsen på stimulansen. De kraftige genetiske verktøyene i Drosophila kan brukes til å begrense uttrykket av disse sensorene til spesifikke nevronale undertyper. I video 3begrenset vi uttrykket av en kalsiumsensor til dopaminerge og serotonerge nevroner (TH-GAL4, DDC-GAL4 og UAS-GCaMP6M). Legg merke til den sterke synkrone aktiviteten over hjernen tett korrelert med fluen som går, tillatt ved å observere hele hjernen under oppførsel. I tillegg til kalsiumaktivitet kan andre fysiske eller kjemiske signaler avbildes (ved hjelp av for eksempel sensorer for spenning28,33, metabolismeprodukter34,35 eller spesifikke nevromodulatorer36).
For å forstå hjerneaktivitetens rolle mer spesifikt, kan vi spørre hvilke regioner som er involvert i hvilken oppførsel, respons på stimuli eller spontane aktivitetsmønstre. Dataene kan faktisk brukes som en objektiv skjerm for å trekke ut funksjonelle regioner ved hjelp av teknikker som hovedkomponentanalyse og uavhengig komponentanalyse. Figur 9A viser forskjellige funksjonsområder i forskjellige farger. Formen og lokaliseringen av de funksjonelle områdene gjør det mulig å kartlegge dem til anatomiske maler for å identifisere hjerneregioner og i noen tilfeller nevrontype. Videre, når fluorescensverdiene er justert etter den anatomiske malen, kan fluorescensverdiene beregnes i anatomiske hjerneregioner for kvantitativ analyse (se figur 9B). En hierarkisk gaussisk modell som brukes på data i figur 9B, viser for eksempel at regioner er mer aktive under gange (med en ΔF/F-median på 0,029, 95 % troverdig intervall=[0,017 0,041]), men ikke under brudgommen (ΔF/F median = -0,0049 med 95 % troverdig intervall=[-0,016 0,0059]).
Ved å legge til forståelsesdybden, kan de samtidige opptakene av de forskjellige funksjonelle områdene som er tillatt av preparatet, brukes til å studere de dynamiske egenskapene til det funksjonelle nettverket. Dette er viktig fordi hjerneregioner i alle hjerner som er studert så langt, er svært tilbakevendende sammenkoblet og flere og flere studier viser at selv sensoriske områder reagerer på dyrets atferdstilstand. Flere aspekter kan ses på, for eksempel funksjonelle grafegenskaper (f.eks. moduler) og romlige temporale mønstre som kan passe med dynamiske systemer (se8 for eksempler).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig01.jpg"> Figur 1: Klargjøre holderen (trinn 1). A) Holder design (utsikt fra toppen). B) Klargjøring av halsspor. topp: tape design, bunn: parallelle kniver som brukes til å kutte nakkesporet. C) Se holderen nedenfra. D) Sett nedenfra og indikerer hvor du skal legge til nakkesporbåndet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig02.jpg"> Figur 2: Ytterligere preparater (trinn 1). A) Tilsett fett i nakkesporet for å hindre lim for å dekke baksiden av hodet og for å forhindre saltvannslekkasjer. Skalastenger, 1 mm. B) Topp: formen på tapestykket som skal brukes til å skyve kroppen ned. Bunn: Pass på at tapen passer til holderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig03.jpg"> Figur 3: Plassering av et v-formet stykke tape for å hjelpe til med sentrering. (A) Nederste visning. (B) Sett ovenfra. Skalastang, 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig04.jpg"> Figur 4: Plasser fluen (trinn 2). Venstre, bruk to kjedelige tang for å plassere kroppen slik at nakken er i nakkesporet. Midtstilt, juster hodet. Øynene ligger på begge sider på kantene av sporet. Fluens hode er rett. Ja, legg fluen med et vev dekket med is for å hindre at den beveger seg. Skalastang, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig05.jpg"> Figur 5: Fest hodet (trinn 3). A) Ideell vinkel på hodet. B) Tilsett UV-lim rundt hodet, og unngå sensoriske interesseområder. Skalastang, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig06.jpg"> Figur 6: Proboscis' spiss og antennene kan holdes fri for lim (trinn 3). Den hvite sirkelen angir området der UV-limet er påført. Pilen viser hvilke deler som er igjen fri for lim for olfaktoriske og gustatory eksperimenter. Legg merke til det valgfrie båndet som hindrer bena i å berøre limområdet. Skalalinje, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig07.jpg"> Figur 7: Plasser bakbåndet (trinn 4.2). Båndet som er opprettet i trinn 1 (se figur 2, venstre) brukes til å plassere kroppen og dekke det store hullet i holderen. Skalastang, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2.jpg"> Figur 8: Disseksjonstrinn (trinn 6). A-B) Klipp på hver side ved foten av den mørke trekanten (kryss) og fjern denne delen av kutikalen C). D) og E) fjerner muskel 16. Fjern deretter forsiktig resten av kutikalen F), luftsekkene G) og musklene. H) Dissekert hode. Skalalinje, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig09.jpg"> Figur 9: Representative resultater. A) Funksjonelle områder (ekstrahert ved hjelp av PCA og ICA som i28) for en flue som uttrykker GCaMP6 pan-neuronally avbildet med et lysfeltmikroskop (25x, NA = 0,95 med en matchende f / 12 mikrolinsematrise). Skala bar, 100 μm. B) Gjennomsnittlig kalsiumaktivitet i store hjerneregioner under respons på stimuli og oppførsel (reprodusert fra28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 1: Muskel 16 bevegelser (trinn 6.3). GFP ble uttrykt i muskler. Legg merke til pumpebevegelsen som kommer fra hullet like over luftrøret. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Muscle16_Movie.avi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 2: Pan-neuronal kalsiumaktivitet under respons på lukt for to forskjellige preparater. Balsamicoeddik ble puffet på fluen. Pan-neuronal kalsiumaktivitet (nsyb-GAL4-driver, UAS-syt-GCaMP6s venstre og UAS-GCaMP6M høyre) ble avbildet med et lysfeltmikroskop (25x, NA = 0,95 med en matchende f / 12 mikrolens array). Lysfeltbilder ble deretter rekonstruert som beskrevet i referanse28,37. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/B9_B10CombinedStacks.avi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 3: Kalsiumaktivitet i en neuron type undergruppe under atferd. GCaMP6 ble uttrykt i dopaminerge og serotoninergiske nevroner (med TH-GAL4 og DDC-GAL4). I kombinasjon med flygenetiske verktøy gjør preparatet det mulig å observere en sterk økning i aktiviteten i mange regioner under tur. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Video3.avi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Tilleggsmateriale. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/FlyHolderVJove.stl" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses at JoVE.com

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Vi presenterer en metode spesielt skreddersydd for å avbilde hele hjernen til voksen Drosophila under atferd og som svar på stimuli. Hodet er plassert for å tillate optisk tilgang til hele hjernen, mens flyet kan bevege bena og antennene, spissen av proboscis, og øynene kan motta sensoriske stimuli.

Forbereder voksen drosophila melanogaster for hele hjerneavbildning under atferd og stimuli responser

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Vår protokoll tillater avbildning av hele fluehjernen under atferd, noe som er viktig for å forstå hvordan nevroner i forskjellige hjerneområder samhandler for å forme atferd. I motsetning til andre publiserte protokoller ble dette utviklet spesielt for å få tilgang til hele hjernen mens flyet oppfører seg og føler av lukt, smak eller visuell stimulering. For å opprette et hodespor.Når du har trykket holderen med en 3D-skriver, plasserer du et stykke klebrig tape rektangulært på en flat overflate under et stereomikroskop. Og kutt en omtrent fem millimeter med en centimeter stykke. Bruk to skalpeller festet parallelt for å kutte et 400 x 400 mikrometer neste spor midt på den lengre siden av båndet, og plasser båndet over den flatere siden av hullet på bunnen av holderen.Bruk tang til å skyve båndet ca. 500 mikrometer rundt hullet. Og bruk svart neglelakk for å dekke toppen av båndet og holderen. Etter å ha latt neglelakken tørke i minst en time, bruk et rullet vev for å legge til omtrent en mikroliter fett til hodesporet.For å forberede karosseriet, kutt et omtrent to centimeter bredt tape i to stykker og kutt 1,5 millimeter brede skiver. Klipp deretter ut en 0,3 millimeter dyp skulder og karosserispor og sørg for at båndet passer til holderen. For å fikse en flue inn i holderen, plasser først en grunn beholder med is under dissekeringsmikroskopet, og plasser holderen opp ned på et stykke laboratorievev plassert over isen.Aspirer en en til fire dager gammel kvinnelig frukt fly fra sin sjofel, og blåse flyet på unmelted is. Når fluen slutter å bevege seg, bruk Dell-tang til å gripe fluen ved foten av vingene, og skyv flyet inn i holderen med nakken inne i sporet. Øynene skal være like plassert på hver side av sporet.Om nødvendig, legg til en mikroliter fett til toppen av hodet for å forhindre at limet når baksiden av hodet. Dekk deretter kroppen med et vev og litt is for å sikre at flyet ikke beveger seg. For å feste hodet, plasser det i en omtrent 20 graders vinkel fra en helt bakre visning.Og bruk et rullet vev for å påføre UV-lim rundt hodet samtidig som du unngår å skitne til det sensoriske interesseområdet. For smakseksperimenter, bruk tang for å trekke ut proboscis og tilsett lim på proboscis-basen for å forhindre bevegelse. Hvis ingen smakseksperiment er planlagt, skyv og lim proboscis inn i hodet.Herd limet med UV-lys i fem sekunder, og bruk et rullet vev for å forsiktig rengjøre områdene rundt hodet, for å fjerne gjenværende flytende lim som kan holde seg til bena og dørene jord, sensoriske områder. Bruk deretter en tynn stripe tape eller et vev for å flytte bena til forsiden etter behov. For å plassere kroppen, fjern isbeholderen og snu holderen rundt.Fjern vannet rundt fluen og handle raskt før flyet gjenoppretter fra anestesi plassere kroppen slot tape over hullet og forsiktig presset flyets kropp ned, pass på ikke å overstretch nakken. Dekk eventuelle gjenværende store hull med tape og tilsett omtrent en mikroliter fett på baksiden av hodet, for å forhindre at lim stikker på det stedet. Bruk et opprullet vev til å male UV-lim rundt thoraxen og på toppen av båndet og thoraxen, og herd limet med UV-lys i omtrent fem sekunder.Fjern forsiktig fett og usikret lim med et laboratorievev og tilsett omtrent en milliliter saltvann til toppen av hodet. Bruk tang til å skyve til side eventuelle luftbobler og se etter lekkasjer ved å plassere en dekselglidning over saltvannslinjen og snu holderen rundt for å se etter saltvann på forsiden. Hvis saltvann observeres, fjern saltvannsvann og fest hullet med mer lim eller mer fett.For å dissekere hodet, velg den høyeste forstørrelsen og bruk skjerpede veldig fine tang for å lage to kutt ved foten av den sentrale mørke neglebåndtriangelen på hver side av nakken. Klipp rundt den mørke trekanten, og fjern denne delen av neglebåndet. Muskel 16 og spiserøret skal være synlige gjennom dette hullet og bevege seg rytmisk.Bruk svært fine tang for å forsiktig klemme toppen av dette området for å kutte muskel 16 uten å punktere spiserøret. Hvis den rytmiske bevegelsen stopper muskelen 16 ble sannsynligvis fjernet. Når muskelen har blitt utskilt fra medialkanten av den mørke trekantregionen, bruk tangene som et par saks for å forsiktig kutte og fjerne den gjenværende kutiklen i små biter.Bruk deretter tangene til å gripe og sakte og trekke bort en luftsekk om gangen. I denne videoen ble en kalsiumsonde uttrykt i alle nevronene til disse to fruktfluehjernene. Og en luktpust ble presentert.I dette eksperimentet var kalsiumsensoruttrykk begrenset til dopaminerge og serotonerge nevroner. Legg merke til den tette sammenhengen mellom den sterke synkrone aktiviteten over hjernen og fluene som går atferd som illustrerer hvordan hele hjernen kan observeres under en bestemt oppførsel. Ved hjelp av prinsippkomponentanalyse og uavhengig komponentanalyse kan forskjellige funksjonsregioner uthevet i forskjellige farger trekkes ut.Formen og lokaliseringen av funksjonsområdene gjør at regionene kan tilordnes anatomiske maler. For å identifisere hjerneregioner og i noen tilfeller nevrontyper. Når fluorescensverdiene er justert etter riktig anatomisk mal, kan de beregnes i gjennomsnitt innenfor spesifikke anatomiske hjerneregioner for kvantitativ analyse.For eksempel kan vi i denne analysen observere at alle regioner er mer aktive under turgåing enn under grooming. Vær tålmodig. Å lære denne hjerte disseksjonsteknikken er vanskelig.I laboratoriet mitt trenger folk i gjennomsnitt tre til fire måneder før de mestrer det og får sine første nyttige forberedelser. Etter denne protokollen kan vi registrere storskala hjerneaktivitet ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Raske metoder som lysfeltmikroskopi er spesielt indikert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Samtidig opptak av kalsium signaler fra Identifiserte Nerveceller og fôring atferd Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulering av Escape Behavior i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling av olfactory Receptor nevroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Høyoppløselig Kvantifisering av Lukt styrt Atferd<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bruke<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Sti lengde Protokoll for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metode for opptak Intracellulær spenningsreaksjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer og interneurons til lys stimuli<em&gt; I Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

En enkel måte å måle endringer i Reward-søkende atferd med<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analysere Synaptic Modulation av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreseptorer etter eksponering for Langvarig lys

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...