Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Clinical Research Award fra det første tilknyttede hospital i Xi'an Jiaotong University, Kina (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), det store grundforskningsprojekt for naturvidenskab i Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), det centrale forsknings- og udviklingsprojekt i Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) og Det Medicinske Forskningsprojekt af Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF/YX011-3). Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og -analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberede manuskriptet.
Vi takker kollegerne i Gynækologisk Afdeling for Første tilknyttet Hospital i Xi'an Jiaotong University for deres bidrag til indsamling af prøver.

Denne undersøgelse blev godkendt af Medical Institutional Ethics Committee på det første tilknyttede hospital i Xi'an Jiaotong University (nr. XJTUIAF2018LSK-139). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle tilmeldte patienter.
1. Kriterier for indtræden i kræftgruppen og kontrolgruppen
<ol><li>For kræftgruppen, tilmelde patienter, der primært diagnosticeres med kræft i æggestokkene, og efter laparotomi, de har vist sig at have serøs kræft i æggestokkene ved...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

Kræft i æggestokkene har en bemærkelsesværdig indflydelse på kvinders fertilitet25. De fleste kræftpatienter i æggestokkene diagnosticeres i sene stadier, og den 5-årige overlevelsesrate er mindre end 30%18. Bekræftelse af bakterier i abdominal fast indvolde, herunder leveren, bugspytkirtlen og milten, er blevet offentliggjort. Eksistensen af bakterier i den øvre kvindelige reproduktive tarmkanalen opstår, fordi livmoderhalsen ikke er lukket2,</...

For nylig er et stigende antal artikler blevet offentliggjort, der beviser eksistensen af bakterier i abdominal fast indvolde, såsom nyre, milt, lever og æggestokken1,2. Geller et al. fundet bakterier i bugspytkirtel tumorer, og disse bakterier var resistente over for gemcitabin, en kemoterapeutisk stof2. S. Manfredo Vieira et al. konkluderede, at Enterococcus gallinarum var bærbar til lymfeknuder, lever og milt, og det kunne køre autoimmunitet3.
Da livmoderhalsen spiller en rolle som forsvarer, bakterier i den øvre kvindelige reproduktive tarmkanalen, som indeholder livmoderen, æggelederne, og æggestokkene, er blevet minimalt undersøgt. Der er dog blevet etableret nogle nye teorier i de senere år. Bakterier kan have adgang til livmoderhulen under menstruationscyklussen på grund af ændringer i muciner4,5. Derudover bekræftede Zervomanolakis et al. at livmoderen sammen med æggelederne er en peristaltisk pumpe kontrolleret af æggestokkenes endokrine system, og dette arrangement gør det muligt for bakterier at komme ind i endometrium, æggelederne og æggestokkene6.
Den øvre reproduktive tarmkanalen er ikke længere et mysterium længere takket være udviklingen af bakterielle detektionsmetoder. Verstraelen et al. brugte en stregkodet parret ende sekventering metode til at opdage livmoderbakterier ved at målrette på V1-2 hypervariable region af 16S RNAgenet 7. Fang et al. ansat stregkodet sekventering hos patienter med endometrie polypper og afslørede tilstedeværelsen af forskellige intrauterin bakterier8. Derudover, ved hjælp af 16S RNA genet, Miles et al. og Chen et al. fundet bakterier i kønsorganerne hos kvinder, der havde gennemgået salpingo-oophorectomy og hysterektomi, henholdsvis5,9.
Bakterier i tumorvæv har fået stigende opmærksomhed i de senere år. Banerjee et al. opdagede, at mikrobiom signatur afveg mellem kræft i æggestokkene patienter og kontrollerer10. Ennoxynatronum sibiricum var forbundet med tumor fase, og Methanosarcina vacuolata kan bruges til at diagnosticere kræft i æggestokkene11. Ud over kræft i æggestokkene, andre kræftformer, såsom mave, lunge, prostata, bryst, livmoderhalsen, og endometrium, har vist sig at være forbundet med bakterier12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. foreslog en ny klasse af mikrobiel-baseret onkologi diagnostik, forudser tidlig fase kræftscreening19. I denne protokol undersøgte vi forskellene mellem kræft og normalt ovarievæv ved at sammenligne sammensætningen og funktionen af bakterier i disse to væv.
Immunohistochemistry farvning og 16S rRNA gen sekventering blev udført for at bekræfte tilstedeværelsen af bakterier i æggestokkene. Forskellene og de forudsagte funktioner af æggestokkene bakterier i kræft og noncancerous ovarievæv blev undersøgt. Resultaterne viste eksistensen af bakterier i æggestokkene væv. Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata var relateret til scenen og diagnosen af kræft i æggestokkene, henholdsvis. 46 signifikant forskellige KEGG-veje, der var til stede i begge grupper, blev sammenlignet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

Teorien om en "steril" kvindelige øvre reproduktive tarmkanalen har mødt stigende modstand på grund af fremskridt i bakteriel påvisning. Men om æggestokkene indeholder bakterier er endnu ikke bekræftet. Heri blev der indført et eksperiment til påvisning af bakterier i ovarievæv. Vi valgte kræftpatienter i kræftgruppen og ikke-kræftpatienter i kontrolgruppen. 16S rRNA gen sekventering blev brugt til at skelne bakterier i æggestokkene væv fra kræft og kontrol grupper. Desuden forudsagde vi den funktionelle sammensætning af de identificerede bakterier ved hjælp af BugBase og PICRUSt. Denne metode kan også anvendes i andre indvolde og væv, da mange organer har vist sig at huse bakterier i de seneste år. Tilstedeværelsen af bakterier i indvolde og væv kan hjælpe forskere evaluere kræft og normale væv og kan være støtte i behandlingen af kræft.

Patienter I alt 16 kvalificerede patienter blev inkluderet i undersøgelsen. Kontrolgruppen omfattede 10 kvinder med en diagnose af godartet livmodertumor (blandt dem blev 3 patienter diagnosticeret med livmoder myom, og 7 patienter blev diagnosticeret med livmoder adenomyose). I mellemtiden indeholdt kræftgruppen 6 kvinder med en diagnose af serøs kræft i æggestokkene (blandt dem blev 2 patienter diagnosticeret med fase II, og 2 af dem blev diagnosticeret med fase III). Følgende egenskaber viste...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Immunohistochemistry farvning og 16S ribosomale RNA gen (16S rRNA gen) sekventering blev udført for at opdage og skelne bakterier i kræft og ikkecancerous ovarievæv in situ. De kompositoriske og funktionelle forskelle i bakterierne blev forudsagt ved hjælp af BugBase og fylogenetisk undersøgelse af Fællesskaber ved genopbygning af ubemærket stater (PICRUSt).

Karakterisering og funktionel forudsigelse af bakterier i æggestokkene væv

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Denne protokol er designet til at opdage bakterier i æggestokkene væv og forudsige deres funktioner. Immunohistochemistry farvning og 16S rRNA sekventering, blev brugt til at opdage og skelne bakterier i kræft og ikke-kræft ovarievæv in situ. De kompenserende og de funktionelle forskelle i bakterierne forudsiges ved hjælp af BoPs og cellulær-genetisk undersøgelse af samfund ved genopbygning af ubemærket dage.Vores protokol har til formål at udvinde bakterier fra æggestokkene væv in situ. Det kan også bruges til at opdage bakterier i tumorer af enhver art. De vigtigste fordele ved vores protokol er, at det er nemt og bekvemt, at det kan realiseres i næsten alle laboratorier.Det er også hurtigt at få resultaterne. Under praksis i protokollen, Det er vigtigt at udelukke eventuelle bakterier off-site tumor væv. Således skal alle procedurer i denne protokol være sterile.Under operationen, separate resected æggestokke i omkring en centimeter tyk vævsprøver med et par nye sterile pincet. Undgå at røre ved noget andet under hele proceduren. Efter adskillelsen fjernes prøven i et sterilt rør og sættes i flydende nitrogen til transmission.Bevar prøver i minus 80 grader Celsius. Fix væv ved formalin, og derefter integrere dem ved paraffin. Denne protokol kan sættes på pause her.Vævene kan opbevares i stuetemperatur for længere konservering. For at kunne betjene yderligere trin skæres prøverne i fem serielle mikrometersektioner. Tør derefter prøverne.Gør de-paraffin og rehydrering til prøverne. For at hente antigen er der behov for en 10 minutters mikrobølgebehandling i EDTA-buffer. Dyp prøverne i PBS, som indeholder 0,3% brint.Peroxidere i 20 minutter for at stoppe endogene peroxidaseaktivitet. Udrjen antistoffet EMA ved LPS-kernen i en koncentration på 1 over 300. Og opretholde det for en nat på fire grader Celsius.For at opdage bakterierne, anvende en DAP substrat kit til at opdage eksistensen af HRP. Baseret på en producents anvisninger skal du bruge HRP polymer, anti-kanin antistof. Brug bordkoncentratoren til at lade antistoffet blive helt kombineret.Brug PBS til at fjerne ukombinerede antistoffer. Gør din kemiske farvning i henhold til producentens anvisninger, og skyl derefter prøverne under vand. Gør dehydrering til prøverne.Passer prøver ved at underskrive. Og indtast som et eksempel ved hjælp af billedbehandling Pro Plus Prepare bibliotek baseret på producentens protokol. Øv grundermønsteret, som består af de genspecifikke sekvenser og Illumina-adapteren udhæng nukleotidsekvenser.For at forstærke fødselsraterne for V4-regionen af bakterielle 16'ere på rRNA-gensekvenser skal skabelonen forstærkes fra DNA-prøveinputtet ved hjælp af amplicon PCR. Brug Mag-Bind RxNPure Plus magnetiske perler til at fjerne reaktionsblandingen fra PCR-produktet. Udfør indekseret PCR-forstærkning for anden gang.Brug Agilent 2200 TapeStation til at tjekke biblioteket. Brug QuantiFluor dsDNA System til at kvantificere biblioteket. Med en 600 cyklus producerer v3 standard flow celle ca. 100.000 parrede ender.2 gange 300 base 3. Biblioteker er denormaliserede, grupperede og sekvenserede. Råsatserne for hver prøve filtreres på grundlag af sekventeringskvalitet af Trimmomatic.Primer- og adaptersekvenserne skal begge fjernes. Sekvenslæsninger med både par og kvaliteter under 25 bør forkortes. Analysere 16s rRNA af softwarepakken QIIME.Saml sekvenser for at danne OTUs med en lighed cutoff på 97%For OTUs, den relative overflod skal beregnes i hver prøve. Ansæt en bayesisk klassificering, som er i RDP-træningen, der er indstillet til at sortere alle sekvenserne. Med givet OTU tildeles en klassificering, der har den største sammenhæng i sekvenserne, otus.OtUs er justeret til Silva-databasen og baserer sig på en eksempelgruppeoplysninger. Udfør alfadiversitet og den UniFrac-baserede hovedkoordinatanalyse. For at forudsige den relaterede præsentation af bakteriernes egenskaber bruger BugBase.Forudsige den funktionelle sammensætning af en metagenom på PICRUSt. Ved brug af overvågningsdata og en database, der indeholder referencegenomer, analysere de forskellige funktioner mellem hver gruppe ved hjælp af STAMP-software. Brug én statistiksoftware til at beregne resultatet.Angivelsen af statistisk signifikans bør fastsættes til p mindre end 0,05. Beregn forvirrende faktorer, som omfatter alder og paritet, ved Student's t-test. Beregn menopausal status, historie hypertension og diabetes ved Chi-square test.Beregn antallet af æggebakterier taxa af Mann-Whitney U-testen. 16 patienter blev indskrevet i denne undersøgelse. BugBase blev brugt til at øve analyse af forudsagte metagenomer.Den potentielt patogenetiske og immunohistochemistry af æggestokke ved hjælp af anti-bakteriel LPS antistof. Denne figur viser bakteriel rigdom og mangfoldighed i kræft- og kontrolgrupperne. Afsløret af 16S rRNA sekventering.Tallene er observeret arter indeks. Chao1 indeks, ACE indeks, Shannon indeks, Evenness indeks, Simpson indeks, henholdsvis. Den relative overflod af phyla og de 12 mest rigelige bakteriearter i æggestokkene prøver er vist i dette tal.Figur A, B, C og D.Betyder den relative overflod af panelet i æggestokkene af patienterne i kontrolgruppen og kræft i æggestokkene gruppe. Den relative overflod af de tolv mest rigelige bakterier arter i æggestokkene af kontrol patienter og kræft i æggestokkene gruppe. Dette er almindelige, grupperet ved hjælp af PCoA og den relative overflod af Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata.Figur A viser de mest almindelige, som blev grupperet ved hjælp af PCoA. PC1 og PC2 er afbildet på x og y-aksen. Rød blok er lig med prøven i kræft i æggestokkene.Den blå cirkel er lig med en prøve i kontrolgruppen. Prøverne fra kræft i æggestokkene gruppe kan adskilles fra andre prøver i kontrolgruppen. Figur B viser de mest almindelige, som blev grupperet ved hjælp af PCoA.PC1 og PC2 er afbildet på x- og y-aksen. Rød blok er lig med en prøve i kræftgruppen i æggestokkene. Den blå faste cirkel er lig med en prøve fra patienten med livmoder myom.Og den blå hule cirkel er lig med en prøve af en patient med livmoder adenomyose. Figur C viser den relative overflod af Anoxynatronum sibiricum. Figur D er Methanosarcina vacuolata.Dette tal er BugBase analyse af forudsagt metagenomics. Den potentielt patogenetiske og oxidative stress-tolerance fænotype af æggestokkene i kræftgruppen var stærkere end i kontrolgruppen. Dette tal er signifikant forskellige KEGG stirum mellem kræft og kontrolgrupper ved PICRUSt analyse.Når vi får vores prøver, er der brug for et par nye sterile pincet. Vær opmærksom på potentiel forurening af prøverne. At bakterier off-site tumor væv kan påvirke løse i høj grad.Det foretrækkes at indstille kontrolgruppen til hvert trin. For at reducere effekten af potentiel forurening.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Berigelse og karakterisering af Tumor immun- og ikke-immune Microenvironments i etablerede subkutane Murine tumorer

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analyse af immun farvning af ZW10 interagerende protein i humant lunge væv

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Fremstilling af mitokondrier fra æggestokkene Cancer væv og kontrol ovarie væv til kvantitativ proteomics analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integrering af Bioinformatik tilgange og eksperimentelle valideringer for at forstå rollen af notch signalering i kræft i æggestokkene

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Cirkulerende tumorcellelinjer: et innovativt værktøj til grundlæggende og translationel forskning

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer patientafledte organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kvantificering af replikationsstress i ovariecancerceller ved hjælp af enkeltstrenget DNA-immunofluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisering af DNA-skadereparationsproteiner i patientafledte ovariecancerorganoider via immunofluorescensassays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...