Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Clinical Research Award van het First Affiliated Hospital van Xi'an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), het Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), het Key Research and Development Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), het Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002), en het medisch onderzoeksproject van Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF /YX011-3). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
We bedanken de collega's van de afdeling Gynaecologie van het First Affiliated Hospital van de Xi'an Jiaotong University voor hun bijdragen aan het verzamelen van monsters.

Deze studie werd goedgekeurd door de Medisch Institutionele Ethische Commissie van het Eerste Aangesloten Ziekenhuis van Xi'an Jiaotong University (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle ingeschreven patiënten.
1. Criteria voor het invoeren van de kankergroep en de controlegroep
<ol><li>Voor de kankergroep, inschrijven patiënten die voornamelijk worden gediagnosticeerd met eierstokkanker, en na laparotomie is bewezen dat ze sereuze eier...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

Eierstokkanker heeft een opmerkelijke invloed op de vruchtbaarheid van vrouwen25. De meeste patiënten met eierstokkanker worden in een laat stadium gediagnosticeerd en de 5-jaarsoverleving is minder dan 30%18. Bevestiging van bacteriën in de abdominale vaste ingewanden, waaronder de lever, pancreas en milt, is gepubliceerd. Het bestaan van bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal treedt op omdat de baarmoederhals niet is ingesloten2,</...

Onlangs zijn er steeds meer artikelen gepubliceerd die het bestaan van bacteriën in abdominale vaste ingewanden bewijzen, zoals de nier, milt, lever en eierstok1,2. Geller et al. vonden bacteriën in pancreastumoren en deze bacteriën waren resistent tegen gemcitabine, een chemotherapeutisch medicijn2. S. Manfredo Vieira et al. concludeerden dat Enterococcus gallinarum draagbaar was naar de lymfeklieren, lever en milt, en het kon auto-immuniteitstimuleren 3.
Omdat de baarmoederhals een rol speelt als verdediger, zijn bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal, dat de baarmoeder, eileiders en eierstokken bevat, minimaal onderzocht. De laatste jaren zijn er echter enkele nieuwe theorieën gevestigd. Bacteriën kunnen toegang hebben tot de baarmoederholte tijdens de menstruatiecyclus als gevolg van veranderingen in mucines4,5. Bovendien bevestigden Zervomanolakis et al. dat de baarmoeder, samen met de eileiders, een peristaltische pomp is die wordt bestuurd door het endocriene systeem van de eierstokken, en deze opstelling stelt bacteriën in staat om het baarmoederslijmvlies, de eileiders en de eierstokken binnen te dringen6.
Het bovenste voortplantingskanaal is niet langer een mysterie meer dankzij de ontwikkeling van bacteriële detectiemethoden. Verstraelen et al. gebruikten een barcoded paired-end sequencing methode om baarmoederbacteriën te ontdekken door zich te richten op het V1-2 hypervariabele gebied van het 16S RNA gen7. Fang et al. gebruikten barcode-sequencing bij patiënten met endometriumpoliepen en onthulden de aanwezigheid van diverse intra-uteriene bacteriën8. Bovendien vonden Miles et al. en Chen et al. door het 16S RNA-gen te gebruiken bacteriën in het genitale systeem van vrouwen die salpingo-oöforectomie en hysterectomie hadden ondergaan, respectievelijk5,9.
Bacteriën in tumorweefsels hebben de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen. Banerjee et al. ontdekten dat de microbioomsignatuur verschilde tussen eierstokkankerpatiënten en controles10. Eennoxynatronum sibiricum was geassocieerd met tumorstadium en Methanosarcina vacuolata kan worden gebruikt om eierstokkanker te diagnosticeren11. Naast eierstokkanker is bewezen dat andere kankers, zoals maag-, long-, prostaat-, borst-, baarmoederhals- en baarmoederslijmvlies, geassocieerd zijn met bacteriën12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. stelden een nieuwe klasse van microbiële oncologische diagnostiek voor, met een vroeg stadium van kankerscreening19. In dit protocol onderzochten we de verschillen tussen kankerachtige en normale eierstokweefsels door de samenstelling en functie van bacteriën in deze twee weefsels te vergelijken.
Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-gensequencing werden uitgevoerd om de aanwezigheid van bacteriën in de eierstokken te bevestigen. De verschillen en voorspelde functies van de eierstokbacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels werden bestudeerd. De resultaten toonden het bestaan van bacteriën in eierstokweefsels. Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata waren gerelateerd aan respectievelijk het stadium en de diagnose van eierstokkanker. Zesenveertig significant verschillende KEGG-routes die in beide groepen aanwezig waren, werden vergeleken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

De theorie van een "steriel" vrouwelijk bovenste voortplantingskanaal stuit op toenemende weerstand als gevolg van vooruitgang in bacteriële detectie. Of eierstokken bacteriën bevatten, is echter nog niet bevestigd. Hierin werd een experiment geïntroduceerd om bacteriën in eierstokweefsels te detecteren. We kozen eierstokkankerpatiënten in de kankergroep en niet-kankerachtige patiënten in de controlegroep. 16S rRNA-gensequencing werd gebruikt om bacteriën in eierstokweefsels te onderscheiden van de kanker- en controlegroepen. Verder voorspelden we de functionele samenstelling van de geïdentificeerde bacteriën met behulp van BugBase en PICRUSt. Deze methode kan ook worden gebruikt in andere ingewanden en weefsels, omdat de afgelopen jaren is bewezen dat veel organen bacteriën herbergen. De aanwezigheid van bacteriën in ingewanden en weefsels kan wetenschappers helpen bij het evalueren van kankerachtige en normale weefsels en kan helpen bij de behandeling van kanker.

Patiënten In totaal werden 16 gekwalificeerde patiënten geïncludeerd in de studie. De controlegroep omvatte 10 vrouwen met een diagnose van goedaardige baarmoedertumor (onder hen werden 3 patiënten gediagnosticeerd met baarmoeder myoma en 7 patiënten werden gediagnosticeerd met baarmoederadenoom). Ondertussen bevatte de kankergroep 6 vrouwen met een diagnose van sereuze eierstokkanker (onder hen werden 2 patiënten gediagnosticeerd met stadium II en 2 van hen werden gediagnosticeerd met stadium I...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Dit protocol is ontworpen om bacteriën in eierstokweefsels te ontdekken en hun functies te voorspellen. Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-sequencing werden gebruikt om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De compenserende en functionele verschillen van de bacteriën worden voorspeld met behulp van BoPs en cellulair-genetisch onderzoek van gemeenschappen door reconstructie van niet-geobserveerde dagen.Ons protocol is gericht op het extraheren van bacteriën uit eierstokweefsels in situ. Het kan ook worden gebruikt om bacteriën in tumoren van welke aard dan ook te ontdekken. De belangrijkste voordelen van ons protocol zijn dat het gemakkelijk en handig is, dat het in bijna elk lab kan worden gerealiseerd.Het is ook snel om de resultaten te krijgen. Tijdens het oefenen in het protocol is het belangrijk om bacteriën off-site tumorweefsels uit te sluiten. Alle procedures in dit protocol moeten dus steriel zijn.Tijdens de operatie worden de eierstokken gescheiden in ongeveer een centimeter dikke weefselmonsters met een nieuw steriel pincet. Vermijd het aanraken van iets anders tijdens de hele procedure. Verwijder na scheiding het monster in een steriele buis en doe het in vloeibare stikstof voor overdracht.Bewaar monsters in min 80 graden Celsius. Fixeer weefsels door formaline en sluit ze vervolgens in door paraffine. Dit protocol kan hier worden gepauzeerd.De weefsels kunnen op kamertemperatuur worden gehouden voor een langere conservering. Om verdere stappen uit te voeren, snijdt u de monsters in vijf micrometer seriële secties. Droog vervolgens de monsters.Doe de-paraffine en rehydratatie naar de monsters. Om antigeen terug te halen, is een microgolfbehandeling van 10 minuten in EDTA-buffer nodig. Dompel de monsters in PBS dat 0,3% waterstof bevat.Peroxideer gedurende 20 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te stoppen. Voer het antilichaam EMA uit in de LPS-kern, in een concentratie van 1 boven de 300. En houd het een nacht vol bij vier graden Celsius.Om de bacteriën te ontdekken, gebruikt u een DAP-substraatkit om het bestaan van HRP te detecteren. Gebruik op basis van de instructies van een fabrikant HRP-polymeer, anti-konijnantilichaam. Gebruik de tafelconcentrator om antilichamen volledig te laten combineren.Gebruik PBS om ongecombineerde antilichamen te elimineren. Voer uw chemische kleuring uit volgens de instructies van de fabrikant en spoel de monsters vervolgens onder water. Doe uitdroging aan de monsters.Pakmonsters door ondertekening. En voer in als een voorbeeld met behulp van imaging Pro Plus Prepare-bibliotheek op basis van het protocol van de fabrikant. Oefen het primerpatroon, dat bestaat uit de genspecifieke sequenties en de Illumina-adapter overhang nucleotidesequenties.Om de geboortecijfers voor het V4-gebied van bacteriële 16's op rRNA-gensequenties te versterken, versterkt u de sjabloon van de DNA-monsterinvoer met behulp van amplicon PCR. Gebruik Mag-Bind RxNPure Plus magnetische kralen om de reactiemix uit het PCR-product te verwijderen. Voer geïndexeerde PCR-versterking voor een tweede keer uit.Gebruik Agilent 2200 TapeStation om de bibliotheek te controleren. Gebruik QuantiFluor dsDNA System om de bibliotheek te kwantificeren. Met een 600-cyclus produceert de v3-standaardstroomcel ongeveer 100.000 gepaarde uiteinden.2 keer 300 basis 3. Bibliotheken worden gedenormaliseerd, gepoold en gesequenced. De ruwe snelheden van elk monster worden gefiltreerd op basis van sequencingkwaliteit door Trimmomatic.De primer- en adaptersequenties moeten beide worden verwijderd. Sequentiele afgelezen met zowel paar als kwaliteiten lager dan 25 moeten worden ingekort. Analyseer het 16s rRNA door het softwarepakket QIIME.Verzamel sequenties om OTA's te vormen met een gelijkenis-cutoff bij 97% Voor OTA's moet de relatieve abundantie in elk monster worden berekend. Gebruik een Bayesiaanse classificator, die in de RDP-trainingsset zit om alle sequenties te sorteren. Met gegeven OTU wordt een classificatie die de belangrijkste samenhang van de sequenties heeft, toegewezen aan OTU's.De OTA's zijn afgestemd op de Silva-database en zijn gebaseerd op een voorbeeldgroepinformatie. Voer alfadiversiteit en de uniFrac-gebaseerde hoofdcoördinatenanalyse uit. Om de presentatie van de kenmerken van de bacteriën te voorspellen, gebruikt u BugBase.Voorspel de functionele samenstelling van een metagenoom bij PICRUSt. Met behulp van monitoringgegevens en een database met referentiegenomen, analyseert u de verschillende functies tussen elke groep met behulp van STAMP-software. Gebruik één statistische software om het resultaat te berekenen.De indicatie van statistische significantie moet worden vastgesteld op p minder dan 0,05. Bereken verstorende factoren, waaronder leeftijd en pariteit, door de t-test van student. Bereken de menopauzale status, geschiedenis van hypertensie en diabetes door de Chi-kwadraattest.Bereken het aantal taxa van eierstokbacteriën met de Mann-Whitney U-test. 16 patiënten werden opgenomen in deze studie. BugBase werd gebruikt om de analyse van voorspelde metagenomen te oefenen.De potentieel pathogenetische en immunohistochemie van eierstokken met behulp van antibacterieel LPS-antilichaam. Deze figuur toont bacteriële rijkdom en diversiteit in de kanker- en controlegroepen. Onthuld door 16S rRNA sequencing.De cijfers zijn geobserveerde soortenindex. Chao1 index, ACE index, Shannon index, Evenness index, Simpson index, respectievelijk. De relatieve abundantie van phyla en de 12 meest voorkomende bacteriesoorten in de ovariële monsters wordt weergegeven in deze figuur.Figuur A, B, C en D.Betekent de relatieve abundantie van het panel in de eierstokken van de patiënten in de controlegroep en de eierstokkankergroep. De relatieve abundanties van de twaalf meest voorkomende bacteriesoorten in de eierstokken van de controlepatiënten en eierstokkankergroep. Dit komt vaak voor, geclusterd met behulp van PCoA en de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata.Figuur A toont de commonests, die werden geclusterd met behulp van PCoA. PC1 en PC2 zijn uitgezet op x en de y-as. Het rode blok is gelijk aan het monster in de groep eierstokkanker.De blauwe cirkel is gelijk aan een steekproef in de controlegroep. De monsters van de eierstokkankergroep kunnen worden gescheiden van andere monsters in de controlegroep. Figuur B toont commonests die geclusterd waren met behulp van PCoA.PC1 en PC2 zijn uitgezet op de x- en y-as. Het rode blok is gelijk aan een monster in de groep eierstokkanker. De blauwe ononderbroken cirkel is gelijk aan een monster van de patiënt met baarmoeder myoma.En de blauwe holle cirkel is gelijk aan een monster van een patiënt met baarmoederade-adenomyose. Figuur C toont de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum. Figuur D is Methanosarcina vacuolata.Dit cijfer is de BugBase-analyse van voorspelde metagenomica. Het potentieel pathogenetische en oxidatieve stresstolerantiefenotype van de eierstokken in de kankergroep was sterker dan dat van de controlegroep. Dit cijfer is significant verschillend KEGG pad ruimte tussen de kanker en controlegroepen door PICRUSt analyse.Wanneer we onze monsters krijgen, is een nieuw steriel pincet nodig. Let op mogelijke besmetting van de monsters. Dat bacteriën off-site tumorweefsels de oplossing sterk kunnen beïnvloeden.Het instellen van de controlegroep voor elke stap heeft de voorkeur. Om het effect van mogelijke besmetting te verminderen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale analyse van immunokleuring van ZW10 interactie eiwit in menselijke Long weefsels

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integratie van bioinformatica benaderingen en experimentele validaties om de rol van Inkeping signalering in ovariële kanker te begrijpen

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kwantificering van replicatiestress in eierstokkankercellen met behulp van enkelstrengs DNA-immunofluorescentie

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...