Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch den Clinical Research Award des First Affiliated Hospital der Xi'an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), das Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), das Key Research and Development Project der Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), das Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) und das medizinische Forschungsprojekt des Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF/ YX011-3). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Wir danken den Kollegen in der Abteilung für Gynäkologie des First Affiliated Hospital der Xi'an Jiaotong University für ihre Beiträge zur Probensammlung.

Diese Studie wurde von der Medizinischen Institutionellen Ethikkommission des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Xi'an Jiaotong Universität (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Von allen eingeschlossenen Patienten wurde eine Einwilligung nach Aufklärung eingeholt.
1. Kriterien für den Eintritt in die Krebsgruppe und die Kontrollgruppe
<ol><li>Für die Krebsgruppe werden Patientinnen aufgenommen, bei denen hauptsächlich Eierstockkrebs diagnostiziert wird, und nach einer Laparo...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

Eierstockkrebs hat einen bemerkenswerten Einfluss auf die Fruchtbarkeit von Frauen25. Die meisten Eierstockkrebspatientinnen werden in späten Stadien diagnostiziert, und die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt weniger als 30%18. Die Bestätigung von Bakterien in den abdominalen festen Eingeweiden, einschließlich Leber, Bauchspeicheldrüse und Milz, wurde veröffentlicht. Die Existenz von Bakterien im oberen weiblichen Fortpflanzungstrakt tritt auf, weil der Gebärmutterhals...

In letzter Zeit wurde eine zunehmende Anzahl von Artikeln veröffentlicht, die die Existenz von Bakterien in abdominalen festen Eingeweiden wie Niere, Milz, Leber und Eierstockbelegen 1,2. Geller et al. fanden Bakterien in Pankreastumoren, und diese Bakterien waren resistent gegen Gemcitabin, ein Chemotherapeutikum2. S. Manfredo Vieira et al. kamen zu dem Schluss, dass Enterococcus gallinarum auf die Lymphknoten, Leber und Milz übertragbar ist und die Autoimmunität antreiben kann3.
Da der Gebärmutterhals eine Rolle als Verteidiger spielt, sind Bakterien im oberen weiblichen Fortpflanzungstrakt, der Gebärmutter, Eileiter und Eierstöcke enthält, nur minimal erforscht. In den letzten Jahren haben sich jedoch einige neue Theorien etabliert. Bakterien können während des Menstruationszyklus aufgrund von Veränderungen der Schleimhäute Zugang zur Gebärmutterhöhle haben4,5. Darüber hinaus bestätigten Zervomanolakis et al., dass der Uterus zusammen mit den Eileitern eine Peristaltikpumpe ist, die vom endokrinen System der Eierstöcke gesteuert wird, und diese Anordnung ermöglicht es Bakterien, in das Endometrium, die Eileiter und die Eierstöcke einzudringen6.
Der obere Fortpflanzungstrakt ist dank der Entwicklung bakterieller Nachweismethoden kein Rätsel mehr. Verstraelen et al. verwendeten eine barcoded paired-end Sequenzierungsmethode, um Uterusbakterien zu entdecken, indem sie auf die hypervariable V1-2-Region des 16S-RNA-Gens7abzielten. Fang et al. verwendeten barcoded sequencing bei Patienten mit Endometriumpolypen und zeigten das Vorhandensein verschiedener intrauteriner Bakterien8. Darüber hinaus fanden Miles et al. und Chen et al. unter Verwendung des 16S-RNA-Gens Bakterien im Genitalsystem von Frauen, die sich einer Salpingo-Oophorektomie und Hysterektomie unterzogen hatten, bzw.5,9.
Bakterien im Tumorgewebe haben in den letzten Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Banerjee et al. entdeckten, dass sich die Mikrobiomsignatur zwischen Eierstockkrebspatientinnen und Kontrollpersonen unterschied10. EinNoxynatronum sibiricum war mit dem Tumorstadium assoziiert, und Methanosarcina vacuolata könnte verwendet werden, um Eierstockkrebs zu diagnostizieren11. Neben Eierstockkrebs wurden andere Krebsarten wie Magen, Lunge, Prostata, Brust, Gebärmutterhals und Endometrium nachweislich mit Bakterienassoziiert 12 , 13,14,15,16,17,18. Poore et al. schlugen eine neue Klasse mikrobiell basierter onkologischer Diagnostik vor, die ein Krebsfrüherkennung im Frühstadium vorsieht19. In diesem Protokoll untersuchten wir die Unterschiede zwischen krebsösen und normalen Eierstockgeweben, indem wir die Zusammensetzung und Funktion von Bakterien in diesen beiden Geweben verglichen.
Immunhistochemische Färbung und 16S rRNA-Gensequenzierung wurden durchgeführt, um das Vorhandensein von Bakterien in den Eierstöcken zu bestätigen. Die Unterschiede und vorhergesagten Funktionen der Ovarialbakterien in krebsartigen und nicht-krebsartigen Eierstockgeweben wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten die Existenz von Bakterien im Eierstockgewebe. Anoxynatronum sibiricum und Methanosarcina vacuolata waren mit dem Stadium bzw. der Diagnose von Eierstockkrebs verbunden. Sechsundvierzig signifikant unterschiedliche KEGG-Signalwege, die in beiden Gruppen vorhanden waren, wurden verglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

Die Theorie eines "sterilen" weiblichen oberen Fortpflanzungstraktes stößt aufgrund von Fortschritten beim Bakteriennachweis auf zunehmenden Widerstand. Ob Eierstöcke Bakterien enthalten, ist jedoch noch nicht bestätigt. Hierin wurde ein Experiment zum Nachweis von Bakterien im Eierstockgewebe eingeführt. Wir wählten Eierstockkrebspatientinnen in der Krebsgruppe und nicht-krebserregende Patientinnen in der Kontrollgruppe aus. Die 16S rRNA-Gensequenzierung wurde verwendet, um Bakterien im Eierstockgewebe von den Krebs- und Kontrollgruppen zu unterscheiden. Darüber hinaus haben wir die funktionelle Zusammensetzung der identifizierten Bakterien mitHilfe von BugBase und PICRUSt vorhergesagt. Diese Methode kann auch in anderen Eingeweiden und Geweben eingesetzt werden, da in den letzten Jahren nachgewiesen wurde, dass viele Organe Bakterien beherbergen. Das Vorhandensein von Bakterien in Eingeweiden und Geweben kann Wissenschaftlern helfen, krebshaftes und normales Gewebe zu bewerten und kann bei der Behandlung von Krebs helfen.

Patienten Insgesamt wurden 16 qualifizierte Patienten in die Studie eingeschlossen. Die Kontrollgruppe umfasste 10 Frauen mit der Diagnose eines gutartigen Uterustumors (unter ihnen wurde bei 3 Patienten ein Uterusmyom und bei 7 Patienten eine Uterusadenomyose diagnostiziert). In der Zwischenzeit umfasste die Krebsgruppe 6 Frauen mit der Diagnose serösen Eierstockkrebs (unter ihnen wurden 2 Patienten mit Stadium II und 2 von ihnen mit Stadium III diagnostiziert). Die folgenden Merkmale zeigten keine ...

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Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Immunhistochemische Färbung und 16S ribosomale RNA-Gensequenzierung (16S rRNA-Gen) wurden durchgeführt, um Bakterien in krebsartigen und nicht krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die kompositorischen und funktionellen Unterschiede der Bakterien wurden mit Hilfe von BugBase und Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) vorhergesagt.

Charakterisierung und funktionelle Vorhersage von Bakterien im Eierstockgewebe

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Bakterien im Eierstockgewebe zu entdecken und ihre Funktionen vorherzusagen. Immunhistochemische Färbung und 16S rRNA-Sequenzierung wurden verwendet, um Bakterien in krebsartigen und nicht-krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die Kompensations- und Funktionsunterschiede der Bakterien werden durch BoPs und zellgenetische Untersuchung von Gemeinschaften durch Rekonstruktion unbeobachteter Tage vorhergesagt.Unser Protokoll zielt darauf ab, Bakterien aus Eierstockgewebe in situ zu extrahieren. Es kann auch verwendet werden, um Bakterien in Tumoren jeglicher Art zu entdecken. Die Hauptvorteile unseres Protokolls sind, dass es einfach und bequem ist, dass es in fast jedem Labor realisiert werden kann.Es ist auch schnell, die Ergebnisse zu erhalten. Während der Praxis im Protokoll ist es wichtig, Bakterien außerhalb des Tumorgewebes auszuschließen. Daher müssen alle Verfahren in diesem Protokoll steril sein.Trennen Sie während der Operation die resezierten Eierstöcke mit einer neuen sterilen Pinzette in etwa einen Zentimeter dicke Gewebeproben. Vermeiden Sie es, während des gesamten Verfahrens etwas anderes zu berühren. Nach der Trennung die Probe in ein steriles Röhrchen geben und zur Übertragung in flüssigen Stickstoff geben.Proben bei minus 80 Grad Celsius konservieren. Fixieren Sie Gewebe durch Formalin und betten Sie sie dann durch Paraffin ein. Dieses Protokoll kann hier pausiert werden.Die Gewebe können für eine längere Konservierung bei Raumtemperatur gehalten werden. Um weitere Schritte zu bedienen, schneiden Sie die Proben in fünf Mikrometer serielle Abschnitte. Dann trocknen Sie die Proben.Machen Sie Deparaffin und Rehydratation zu den Proben. Um Antigene abzurufen, ist eine 10-minütige Mikrowellenbehandlung im EDTA-Puffer erforderlich. Tauchen Sie die Proben in PBS, das 0,3% Wasserstoff enthält.Peroxidieren Sie für 20 Minuten, um die endogene Peroxidaseaktivität zu stoppen. Führen Sie die Antikörper-EMA am LPS-Kern in einer Konzentration von 1 über 300 durch. Und halten Sie es für eine Nacht bei vier Grad Celsius.Um die Bakterien zu entdecken, verwenden Sie ein DAP-Substrat-Kit, um die Existenz von HRP nachzuweisen. Verwenden Sie auf der Grundlage der Anweisungen eines Herstellers HRP-Polymer, Anti-Kaninchen-Antikörper. Verwenden Sie einen Tischkonzentrator, um Antikörper vollständig kombinieren zu lassen.Verwenden Sie PBS, um unkombinierte Antikörper zu eliminieren. Führen Sie Ihre chemische Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und spülen Sie die Proben dann unter Wasser. Dehydrieren Sie die Proben.Anzugproben durch Unterschrift. Und geben Sie als Beispiel mit der Imaging Pro Plus Prepare-Bibliothek basierend auf dem Protokoll des Herstellers ein. Üben Sie das Primermuster, das aus den genspezifischen Sequenzen und den Illumina-Adapter-Überhang-Nukleotidsequenzen besteht.Um die Geburtenraten für die V4-Region bakterieller 16s auf rRNA-Gensequenzen zu amplifizieren, amplifizieren Sie die Vorlage aus der DNA-Probeneingabe mithilfe von Amplicon PCR. Verwenden Sie Magnetperlen Mag-Bind RxNPure Plus, um die Reaktionsmischung aus dem PCR-Produkt zu entfernen. Führen Sie eine indizierte PCR-Amplifikation zum zweiten Mal durch.Verwenden Sie Agilent 2200 TapeStation, um die Bibliothek zu überprüfen. Verwenden Sie das QuantiFluor dsDNA System, um die Bibliothek zu quantifizieren. Mit einem 600-Zyklus produzieren v3-Standard-Durchflusszellen etwa 100.000 gepaarte Enden.2 mal 300 Basis 3. Bibliotheken werden denormalisiert, gepoolt und sequenziert. Die Rohraten jeder Probe werden auf Basis der Sequenzierungsqualität von Trimmomatic filtriert.Die Primer- und Adaptersequenzen sollten beide entfernt werden. Sequenzlesevorgänge mit beiden Paaren und Qualitäten unter 25 sollten verkürzt werden. Analysieren Sie die 16s rRNA mit dem Softwarepaket QIIME.Sammeln Sie Sequenzen, um OTUs mit einem Ähnlichkeits-Cutoff bei 97% zu bilden Bei OTUs sollte die relative Häufigkeit in jeder Stichprobe berechnet werden. Verwenden Sie einen Bayes'schen Klassifikator, der sich im RDP-Trainingssatz befindet, um alle Sequenzen zu sortieren. Mit gegebener OTU wird OTUs eine Klassifikation zugeordnet, die die Hauptkohärenz der Sequenzen aufweist.Die OTUs werden auf der Grundlage einer Beispielgruppeninformation an der Silva-Datenbank ausgerichtet. Führen Sie alphadiversität und die UniFrac-basierte Hauptkoordinatenanalyse durch. Um die beziehungsbezogene Darstellung der Eigenschaften der Bakterien vorherzusagen, verwenden Sie BugBase.Vorhersage der funktionellen Zusammensetzung eines Metagenoms am PICRUSt. Mit der Verwendung von Überwachungsdaten und einer Datenbank mit Referenzgenomen können Sie die verschiedenen Funktionen zwischen jeder Gruppe mit Hilfe der STAMP-Software analysieren. Verwenden Sie eine Statistiksoftware, um das Ergebnis zu berechnen.Die Angabe der statistischen Signifikanz sollte auf p kleiner als 0,05 gesetzt werden. Berechnen Sie Störfaktoren, zu denen Alter und Parität gehören, anhand des t-Tests des Schülers. Berechnen Sie den Wechseljahrsstatus, die Geschichte von Bluthochdruck und Diabetes durch den Chi-Quadrat-Test.Berechnen Sie die Anzahl der Eierstockbakterientaxa durch den Mann-Whitney U-Test. 16 Patienten wurden in diese Studie aufgenommen. BugBase wurde verwendet, um die Analyse vorhergesagter Metagenome zu üben.Die potentiell pathogenetische und immunhistochemische Ovariale unter Verwendung antibakterieller LPS-Antikörper. Diese Abbildung zeigt den bakteriellen Reichtum und die Vielfalt in den Krebs- und Kontrollgruppen. Aufgedeckt durch 16S rRNA-Sequenzierung.Die Zahlen sind beobachteter Artenindex. Chao1 Index, ACE Index, Shannon Index, Evenness Index, Simpson Index, jeweils. Die relative Häufigkeit von Phyla und den 12 häufigsten Bakterienarten in den Eierstockproben ist in dieser Abbildung dargestellt.Abbildung A, B, C und D.Bezeichnet die relative Häufigkeit des Panels in den Eierstöcken der Patientinnen der Kontrollgruppe und der Eierstockkrebsgruppe. Die relativen Häufigkeiten der zwölf häufigsten Bakterienarten in den Eierstöcken der Kontrollpatientinnen und der Eierstockkrebsgruppe. Dies ist commonests, geclustert mit PCoA und der relativen Häufigkeit von Anoxynatronum sibiricum und Methanosarcina vacuolata.Abbildung A zeigt die Commonests, die mit PCoA gruppiert wurden. PC1 und PC2 werden auf x und der y-Achse gezeichnet. Der rote Block ist gleich der Probe in der Eierstockkrebsgruppe.Der blaue Kreis entspricht einer Stichprobe in der Kontrollgruppe. Die Proben aus der Eierstockkrebsgruppe können von anderen Proben in der Kontrollgruppe getrennt werden. Abbildung B zeigt Commonests, die mit PCoA geclustert wurden.PC1 und PC2 werden auf der x- und y-Achse dargestellt. Der rote Block entspricht einer Probe in der Gruppe der Eierstockkrebsgruppen. Der blaue feste Kreis entspricht einer Probe der Patientin mit Uterusmyom.Und der blaue Hohlkreis entspricht einer Probe einer Patientin mit Uterusadenomyose. Abbildung C zeigt die relative Häufigkeit von Anoxynatronum sibiricum. Abbildung D ist Methanosarcina vacuolata.Diese Zahl ist die BugBase-Analyse der vorhergesagten Metagenomik. Der potenziell pathogenetische und oxidative Stresstoleranz-Phänotyp der Eierstöcke in der Krebsgruppe war stärker als der der Kontrollgruppe. Diese Zahl ist signifikant unterschiedlicher KEGG-Pfadraum zwischen der Krebs- und Kontrollgruppe durch PICRUSt-Analyse.Wenn wir unsere Proben erhalten, wird eine neue sterile Pinzette benötigt. Achten Sie auf eine mögliche Kontamination der Proben. Dass Bakterien außerhalb des Tumorgewebes außerhalb des Standorts die Auflösung stark beeinflussen können.Das Festlegen der Kontrollgruppe für jeden Schritt wird bevorzugt. Um die Wirkung einer möglichen Kontamination zu reduzieren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Forschung

Krebsforschung

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale Analyse der Immunostainierung von ZW10 Interacting Protein in menschlichen Lungengeweben

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integration von Bioinformatik-Ansätzen und experimentellen Validierungen, um die Rolle der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs zu verstehen

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...