Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר הקליני של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג, סין (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), פרויקט המחקר הבסיסי העיקרי של מדעי הטבע של מחלקת המדע והטכנולוגיה המחוזית שאאנשי (2018JM7073, 2017ZDJC-11), פרויקט המחקר והפיתוח המרכזי של מחלקת המדע והטכנולוגיה המחוזית שאאנשי (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), פרויקט החדשנות הטכנולוגית השיתופית הפרובינציאלית שאאנשי (2 017XT-026, 2018XT-002), ופרויקט המחקר הרפואי של תוכנית ההנחיה לפיתוח חברתי שיאן (2017117SF/YX011-3). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
אנו מודים לעמיתים במחלקה לגינקולוגיה של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג על תרומתם לאיסוף דגימות.

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית הרפואית של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג (לא. XJTUIAF2018LSK-139). הסכמה מדעת התקבלה מכל המטופלים הרשומים.
1. קריטריונים לכניסה לקבוצת הסרטן וקבוצת הביקורת
<ol><li>עבור קבוצת הסרטן, להירשם חולים המאובחנים בעיקר עם...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

לסרטן השחלות יש השפעה ניכרת על פוריות האישה25. רוב חולי סרטן השחלות מאובחנים בשלבים מאוחרים, ושיעור ההישרדות של 5 שנים הוא פחות מ -30%18. אישור של חיידקים הקרביים מוצק הבטן, כולל הכבד, הלבלב והטחול, פורסם. קיומם של חיידקים במערכת הרבייה הנשית העליונה מתרחשת מכיוון צווא...

לאחרונה, מספר גדל והולך של מאמרים פורסמו המוכיחים את קיומם של חיידקים קרביים מוצקים בבטן, כגון הכליה, הטחול, הכבד והשחלה1,2. גלר ואח ' מצאו חיידקים בגידולים בלבלב, וחיידקים אלה היו עמידים בפני gemcitabine, תרופה כימותרפית2. ס. מנפרדו ויירה ואח ' הגיע למסקנה כי Enterococcus gallinarum היה נייד לבלוטות הלימפה, הכבד והטחול, וזה יכול לנהוג אוטואימוניות3.
מאז צוואר הרחם משחק תפקיד כמגן, חיידקים במערכת הרבייה הנשית העליונה, המכיל את הרחם, החצוצרות והשחלות, נחקרו באופן מינימלי. עם זאת, כמה תיאוריות חדשות הוקמו בשנים האחרונות. חיידקים עשויים להיות גישה לחלל הרחם במהלך המחזור החודשי עקב שינויים mucins4,5. בנוסף, Zervomanolakis ואח 'אישר כי הרחם, יחד עם החצוצרות, היא משאבה peristaltic הנשלטת על ידי המערכת האנדוקרינית של השחלות, וסידור זה מאפשר לחיידקים להיכנס רירית הרחם, החצוצרות, והשחלות6.
מערכת הרבייה העליונה כבר אינה תעלומה הודות להתפתחות שיטות לזיהוי חיידקים. Verstraelen ואח ' השתמש בשיטת רצף מזווג ברקוד כדי לגלות חיידקי הרחם על ידי מיקוד באזור V1-2 hypervariable של 16S RNA גן7. פאנג ואח ' מועסק רצף ברקוד בחולים עם פוליפים רירית הרחם וחשף את נוכחותם של חיידקים תוך רחמיים מגוונים8. בנוסף, באמצעות גן RNA 16S, מיילס ואח 'וחן ואח ' מצאו חיידקים במערכת איברי המין של נשים שעברו salpingo-oophorectomy וכריתת רחם, בהתאמה5,9.
חיידקים ברקמות הגידול זכו לתשומת לב גוברת בשנים האחרונות. בנרג'י ואח ' גילו כי חתימת המיקרוביום שונה בין חולי סרטן השחלות ושליטה10. סיביריקום noxynatronum היה קשור לשלב הגידול, ו Vacuolata מתנוזרצ'ינה עשוי לשמש לאבחון סרטן השחלות11. בנוסף לסרטן השחלות, סוגי סרטן אחרים, כגון קיבה, ריאות, ערמונית, שד, צוואר הרחם ואנדומטריום, הוכחו כקשורים לחיידקים12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. הציע סוג חדש של אבחון אונקולוגי מבוסס מיקרוביאלי, צופה הקרנת סרטן בשלב מוקדם19. בפרוטוקול זה, חקרנו את ההבדלים בין רקמות שחלות סרטניות ונורמליות על ידי השוואת הרכב ותפקוד החיידקים בשתי הרקמות האלה.
כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף גנים rRNA 16S בוצעו כדי לאשר את נוכחותם של חיידקים בשחלות. ההבדלים והתפקודים החזויים של חיידקי השחלות ברקמות השחלות הסרטניות והנוכריות נחקרו. התוצאות הראו את קיומם של חיידקים ברקמות השחלות. Anoxynatronum סיביריקום ומתנוזרצ'ינה vacuolata היו קשורים לשלב ולאבחון של סרטן השחלות, בהתאמה. ארבעים ושישה מסלולי KEGG שונים באופן משמעותי שהיו נוכחים בשתי הקבוצות הושוו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

התיאוריה של מערכת הרבייה העליונה הנשית "סטרילית" נתקלת בהתנגדות גוברת עקב התקדמות בזיהוי חיידקים. עם זאת, אם השחלות מכילות חיידקים עדיין לא אושרה. כאן, ניסוי לזיהוי חיידקים ברקמות השחלות הוצג. בחרנו חולי סרטן השחלות בקבוצת הסרטן וחולים לא זרים בקבוצת הביקורת. ריצוף גנים rRNA 16S שימש כדי להבדיל חיידקים ברקמות השחלות מן הסרטן וקבוצות בקרה. יתר על כן, חזינו את ההרכב התפקודי של החיידקים שזוהו באמצעות BugBase ו- PICRUSt. שיטה זו יכולה לשמש גם קרביים אחרים ורקמות מאז איברים רבים הוכחו מחסה חיידקים בשנים האחרונות. נוכחות של חיידקים קרביים ורקמות עשויה לסייע למדענים להעריך רקמות סרטניות ונורמליות ועשויה לסייע בטיפול בסרטן.

חולים בסך הכל נכללו במחקר 16 חולים מוסמכים. קבוצת הביקורת כללה 10 נשים עם אבחנה של גידול שפיר ברחם (ביניהן, 3 חולים אובחנו עם מיומה ברחם, ו -7 חולים אובחנו עם אדנומיוזיס הרחם). בינתיים, קבוצת הסרטן הכילה 6 נשים עם אבחנה של סרטן השחלות serous (ביניהם, 2 חולים אובחנו עם שלב II, ו 2 מהם אובחנו עם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף גן RNA ריבוזומלי 16S (גן 16S rRNA) בוצעו על מנת לגלות ולהבחין חיידקים ברקמות שחלות סרטניות ולא-ncancerous במקום. ההבדלים הקומפוזיציה והתפקודית של החיידקים היו צפויים באמצעות BugBase וחקירה פילוגנטית של קהילות על ידי שחזור של מדינות ללא הפרעה (PICRUSt).

אפיון וחיזוי תפקודי של חיידקים ברקמות השחלות

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

פרוטוקול זה נועד לגלות חיידקים ברקמות השחלות ולחזות את תפקודם. כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף rRNA 16S, שימשו על מנת לגלות ולהבדיל חיידקים ברקמות שחלות סרטניות ולא סרטניות במקום. ההבדלים התזונתיים והתפקודיים של החיידקים צפויים באמצעות BoPs וחקירה תאית-גנטית של קהילות על ידי שחזור של ימים ללא הפרעה.הפרוטוקול שלנו נועד לחלץ חיידקים מרקמות השחלות במקום. זה יכול לשמש גם כדי לגלות חיידקים בגידולים מכל סוג שהוא. היתרונות העיקריים של הפרוטוקול שלנו הם שזה קל ונוח, כי זה יכול להתממש כמעט בכל מעבדה.זה גם מהיר לקבל את התוצאות. במהלך התרגול בפרוטוקול, חשוב להוציא כל חיידקים מחוץ לאתר רקמות גידול. לכן, כל ההליכים בפרוטוקול זה צריכים להיות סטריליים.במהלך הניתוח, להפריד שחלות נצוצות לתוך בערך סנטימטר אחד דגימות רקמה בעובי עם זוג פינצטה סטרילית חדשה. הימנע מלגעת בכל דבר אחר במהלך כל ההליך. לאחר ההפרדה, להסיר את המדגם לתוך צינור סטרילי ולשים אותו חנקן נוזלי לשידור.שמור על דגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לתקן רקמות על ידי פורמלין, ולאחר מכן להטמיע אותם על ידי פרפין. פרוטוקול זה ניתן להשהות כאן.ניתן לשמור את הרקמות בטמפרטורת החדר לשימור ארוך יותר. על מנת להפעיל צעדים נוספים, לחתוך את הדגימות בחמישה מקטעים טוריים מיקרומטר. לאחר מכן, לייבש את הדגימות.לעשות דה פרפין והידרציה לדגימות. כדי לאחזר אנטיגן, יש צורך בטיפול מיקרוגל 10 דקות במאגר EDTA. טובלים את הדגימות ב-PBS שמכיל 0.3% מימן.Peroxidize במשך 20 דקות כדי לעצור פעילות פרוקסידאז אנדוגני. בצע את הנוגדן EMA בליבת LPS, בריכוז של 1 מעל 300. ולשמור אותו ללילה אחד בארבע מעלות צלזיוס.על מנת לגלות את החיידקים, להשתמש בערכת מצע DAP כדי לזהות את קיומו של HRP. התבססות על הוראות היצרן, השתמש בפולימר HRP, נוגדן נגד ארנבים. השתמש ברכז שולחן כדי לאפשר לנוגדן לשלב באופן מלא.השתמש PBS כדי לחסל נוגדנים לא קומבננטיים. האם הכתמים הכימיים שלך על פי הוראות היצרן, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות מתחת למים. האם התייבשות לדגימות.דגימות חליפות על ידי חתימה. והזן כדוגמה באמצעות ספריית Imaging Pro Plus Prepare בהתבסס על פרוטוקול היצרן. תרגלו את תבנית הפריימר, המורכבת מהרצפים הספציפיים לגנים ומרצפי הנוקלאוטידים של מתאם Illumina.כדי להגביר את שיעורי הילודה עבור אזור V4 של חיידקים 16s על רצפי גנים rRNA, להגביר את התבנית מן קלט דגימת DNA באמצעות AMPLICON PCR. השתמש Mag-Bind RxNPure פלוס חרוזים מגנטיים כדי להסיר את תערובת התגובה ממוצר PCR. בצע הגברת PCR באינדקס בפעם השנייה.השתמש ב- Agilent 2200 TapeStation כדי לבדוק את הספריה. השתמש במערכת dsDNA של QuantiFluor כדי לכמת את הספריה. עם מחזור 600, תא זרימה סטנדרטי v3 לייצר כ 100, 000 קצוות מזווגים.2 כפול 300 בסיס 3. הספריות מסונפות, מ ומאוחסות ברצף. התעריפים הגולמיים של כל מדגם מסוננות על בסיס איכות רצף על ידי Trimmomatic.יש להסיר את רצפי הפריימר והמתאם. יש לקצר את קריאות הרצף עם זוג ואיכויות הנמוכות מ- 25. ניתח את rRNA 16s על ידי חבילת התוכנה QIIME.לאסוף רצפים כדי ליצור OTUs עם ניתוק דמיון ב 97%עבור OTUs, השפע היחסי צריך להיות מחושב בכל מדגם. השתמש מסווג בייסיאנית, אשר נמצא בהכשרת RDP להגדיר כדי למיין את כל הרצפים. עם OTU נתון, סיווג אשר יש את העקביות העיקרית של הרצפים מוקצה OTUs.OTUs מיושרים למסד הנתונים סילבה, התבססות על מידע קבוצה לדוגמה. בצע גיוון אלפא וניתוח הקואורדינטות הראשי המבוסס על UniFrac. כדי לחזות את המצגת הנוגעת למאפייני החיידקים השתמש ב- BugBase.לחזות את ההרכב הפונקציונלי של metagenome ב PICRUSt. עם השימוש בנתוני ניטור ובמסד נתונים המכיל גנומי ייחוס, נתח את הפונקציות השונות בקרב כל קבוצה בעזרת תוכנת STAMP. השתמש בתוכנת סטטיסטיקה אחת כדי לחשב את התוצאה.יש להגדיר את האינדיקציה למשמעות סטטיסטית כ- p פחות מ- 0.05. חשב גורמים מבלבלים, הכוללים גיל ושוויון, לפי מבחן t של סטודנט. חשב מצב גיל המעבר, היסטוריה של יתר לחץ דם וסוכרת על ידי מבחן צ'י-ריבוע.לחשב את מספר חיידקי השחלות מסה על ידי מבחן מאן-ויטני U. 16 חולים נרשמו למחקר זה. BugBase שימש לתרגול ניתוח של metagenomes חזוי.פוטנציאל פתוגנטי ואימונוהיסטוכימיה של השחלות באמצעות נוגדן LPS אנטי בקטריאלי. נתון זה מראה עושר חיידקי וגיוון בקבוצות הסרטן והבקרה. נחשף על-ידי רצף rRNA של 16S.הנתונים הם מדד מינים נצפה. מדד Chao1, מדד ACE, מדד שאנון, מדד שוויון, מדד סימפסון, בהתאמה. השפע היחסי של פילה ו -12 המינים החיידקיים הנפוצים ביותר בדגימות השחלות מוצג באיור זה.איור א', ב', ג' ו-ד' פירושו השפע היחסי של הפאנל בשחלות של החולים בקבוצת הביקורת וקבוצת סרטן השחלות. השפע היחסי של שנים עשר מיני החיידקים הנפוצים ביותר בשחלות של חולי הבקרה וקבוצת סרטן השחלות. זה נפוץ, מקובצים באמצעות PCoA ואת השפע היחסי של Anoxynatronum סיביריקום ומתנוזרצ'ינה vacuolata.איור א' מציג את הנפוצים ביותר, שהיו מקובצים באשכולות באמצעות PCoA. PC1 ו- PC2 מותווים על x ועל ציר ה- y. הבלוק האדום שווה לדגימה בקבוצת סרטן השחלות.העיגול הכחול שווה לדוגמה בקבוצת הביקורת. ניתן להפריד את הדגימות מקבוצת סרטן השחלות מדגימות אחרות בקבוצת הביקורת. איור ב' מציג את הנפוצים ביותר שהיו מקובצים באשכולות באמצעות PCoA.PC1 ו- PC2 מותווים על ציר x ו- y. הבלוק האדום שווה לדגימה בקבוצת סרטן השחלות. העיגול הכחול המוצק שווה לדגימה מהמטופל עם מיומה ברחם.והעיגול החלול הכחול שווה לדגימה של מטופל עם אדנומיוזיס ברחם. איור C מראה את השפע היחסי של סיביריקום Anoxynatronum. איור ד' הוא מתנוזרצ'ינה וקולטה.נתון זה הוא ניתוח BugBase של מטגנומיקה חזויה. הפנוטיפ הפתוגנטי והחמצוני של השחלות בקבוצת הסרטן היו חזקים יותר מזה של קבוצת הביקורת. נתון זה שונה באופן משמעותי מרחב נתיב KEGG בין הסרטן וקבוצות בקרה על ידי ניתוח PICRUSt.כאשר אנו מקבלים את הדגימות שלנו, יש צורך בזוג פינצטה סטרילית חדשה. שימו לב לזיהום פוטנציאלי בדגימות. רקמות גידול חיידקים מחוץ לאתר עשויות להשפיע מאוד על הנחישות.הגדרת קבוצת ביקורת לכל שלב מועדפת. על מנת להפחית את ההשפעה של זיהום פוטנציאלי.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

ניתוח דיגיטלי של מעטפת חיסונית של חלבון ZW10 אינטראקציה רקמות ריאות האדם

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

הכנת מיטוכונמיטומיה של רקמות סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטאומוניקס כמותיים

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

אינטגרציה של גישות ביואינפורמטיקה ואימותים ניסיוניים כדי להבין את תפקיד האיתות החריץ בסרטן השחלות

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...